一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物及其制备方法和应用 (weight-losing composition containing bacillus subtilis and preparation method and application thereof ) 是由 王业富 胡坤坤 李靖 范宇鹏 胡定邦 于 2019-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物及其制备方法和应用,所述减肥组合物按质量百分比包括以下组分：枯草芽孢杆菌70％～80％、大豆粉20％～30％、葡萄糖5％～10％、磷酸氢二钾0.1％～0.15％；所述减肥组合物的百分比之和不超过100％。本发明的减肥组合物将益生菌与膳食纤维相组合,以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分,与大豆粉、葡萄糖和磷酸氢二钾按特定比例相互协同,具有明显的减肥效果,显著降低了肥胖小鼠的血脂含量,配方简洁,无毒副作用,具有广阔的应用前景。(the invention provides a weight-losing composition containing bacillus subtilis and a preparation method and application thereof, wherein the weight-losing composition comprises the following components in percentage by mass: 70-80% of bacillus subtilis, 20-30% of soybean meal, 5-10% of glucose and 0.1-0.15% of dipotassium phosphate; the sum of the weight-reducing composition percentages is not more than 100%. The weight-losing composition disclosed by the invention combines probiotics and dietary fibers, takes the screened bacillus subtilis as a main component, and is mutually cooperated with soybean meal, glucose and dipotassium hydrogen phosphate according to a specific proportion, so that the weight-losing composition has an obvious weight-losing effect, the blood fat content of obese mice is obviously reduced, the formula is simple, no toxic or side effect is caused, and the weight-losing composition has a wide application prospect.)
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物 及其制备方法和应用。
背景技术
随着经济的发展、人们生活水平的提高以及生活方式的改变，肥胖已成为 全球成年人最大的慢性疾病。肥胖病是能量摄入超过能量消耗而导致体内脂肪 积聚过多，且达到危害程度的一种慢性代谢性疾病。目前，我国有超重或肥 胖者近3亿人，其中18岁以上成年人的超重或肥胖比例分别达到22.8％和 7.1％。据研究报道，肥胖与许多现代疾病直接相关，肥胖者患心脑血管疾病、 糖尿病、高血压、冠心病、胆囊疾病、痛风、呼吸道疾病、和某些肿瘤的风险 很大，而高血脂、内脏脂肪更是诸多生活习惯病的元凶，因此肥胖不仅影响人的外观体型，而且严重威胁到了人类的健康。
肥胖症和高胆固醇血症在一定程度上与脂肪摄入有关，饮食脂肪在胃肠道 被脂肪酶尤其是胰脂肪酶水解为脂肪酸和甘油三酯才能被人体吸收。随着健康 意识的提高，越来越多的人们认识到，肥胖已成为不可忽视的严重威胁人们身 心健康的危险因素。
膳食纤维(DF)是指不能被人体内源酶消化吸收的可食性植物细胞、多糖、 木质素以及相关物质的总和。根据溶解性膳食纤维可分为可溶性膳食纤维(SDF) 和不溶性膳食纤维(IDF)。可溶性膳食纤维(SDF)具有减缓消化速度、使餐后血 糖平稳以及降低血清胆固醇水平等作用；不溶性膳食纤维(IDF)不能溶解，口感 粗糙，可预防便秘，降低罹患肠癌的风险，因而有人称膳食纤维为人体“第七营 养素”。
CN102579507A公开了一种枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)微生物，尤其 是纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto或Bacillus natto)的脂肪酶抑制剂及其制备方法和用途，该发明是通过抑制脂肪酶活性而达到减肥降脂的目的，该脂肪酶 抑制剂来源于食用纳豆，对人体没有毒副作用；该脂肪酶抑制剂选择性地作用 于胃肠道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而对蛋白酶和淀粉酶等没有抑制作用。以上 的现有技术虽然具有减肥的作用，但是其是通过枯草芽孢杆菌中的脂肪酶抑制 剂，成分过于单一，效果有待进一步提高。
基于此，有必要提供一种安全性高、无毒副作用、效果显著、成分简单的 减肥组合物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物 及其制备方法和应用，所述减肥组合物以筛选得到的枯草芽孢杆菌 Subtilisin-QK为主要成分，辅以膳食纤维，能够显著降低肥胖小鼠的血脂，减 轻肥胖小鼠的重量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物，所述减肥 组合物按质量百分比包括以下组分：
枯草芽孢杆菌 65％～80％
大豆粉 15％～30％
葡萄糖 5％～10％
磷酸氢二钾 0.1％～0.15％；
所述减肥组合物的百分比之和不超过100％。
本发明中的各组分的功效如下：
枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK通过分泌蛋白酶、α-淀粉酶等酶类，在消化道内同人体消化酶共同作用，而原料中大豆中含有丰富的蛋白质、脂质和维生素，并且 还能给人体补充丰富的膳食纤维，更重要的是，本发明枯草芽孢杆菌是从发酵 的大豆中分离的，发明人发现大豆能够促进枯草芽孢杆菌从休眠态中快速复苏， 并且大豆中的相关成分能够让枯草芽孢杆菌更快的生长，大豆中的一些成分能 够增强枯草芽孢杆菌的抗逆性；同时，在枯草芽孢杆菌培养基中添加部分的葡 萄糖和磷酸二氢钠能够促进枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK的生长，枯草芽孢杆菌与 大豆粉、葡萄糖和磷酸二氢钠能够起到互相促进的功效。
本发明的减肥组合物将益生菌与膳食纤维成分相组合，以筛选得到的枯草 芽孢杆菌Subtilisin-QK为主要成分，辅以大豆粉、葡萄糖和磷酸二氢钠，按特 定比例相互配合，产生协同作用，具有降低肥胖大鼠重量、降低肥胖大鼠血脂 含量等作用，有效降低了肥胖大鼠的胆固醇含量。
本株枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK自身能够分泌蛋白酶、α-淀粉酶等酶类， 在消化道内同人体消化酶共同作用；同时，枯草芽孢杆菌产生的酶类可以进一 步。
优选地，所述枯草芽孢杆菌的重量百分比为65％～80％，例如可以是65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、 78％、79％或80％。
优选地，所述大豆粉的重量百分比为15％～30％，例如可以是15％、16％、 17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、 29％或30％。
优选地，所述葡萄糖的重量百分比为5％～10％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％或10％。
优选地，所述磷酸氢二钠的重量百分比为0.1％～0.15％，例如可以是0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％。
本发明中，减肥组合物中的各组分在特定比例下协同增效，枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK作为主要成分，质量百分比占各组分质量之和的70％～80％，枯草 芽孢杆菌过少不利于与其他成分共同配合发挥减脂效果，枯草芽孢杆菌过多则 有可能产生副作用，降低安全性，同时提高了制备成本。
优选地，所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK，保藏于国家典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号 为CCTCCNO：M203078，保藏日期为2003年11月17日。
本发明中，发明人在长期科研实践中，筛选得到一株新型的枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK，所述枯草芽孢杆菌较普通的枯草芽孢杆菌在减脂、降脂等方面表 现出优良功效，枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵的大 豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，该菌种己保存于国家典型培养物 保藏中心，菌种编号为CCTCCNO：M203078。
优选地，所述枯草芽孢杆菌中的活菌数不小于2×1011cfu/g。
本发明中，所述枯草芽孢杆菌中的活菌数需要限定在不小于2×1011cfu/g的 范围，才能有效发挥减肥功效。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的减肥组合物的制备方法， 所述方法包括以下步骤：
将大豆研磨成粉，并与枯草芽孢杆菌、葡萄糖和磷酸氢二钠过筛后，按比 例混合，得到所述减肥组合物。
优选地，所述过筛的目数为80～100目，例如可以是80目、81目、82目、83目、84目、85目、86目、87目、88目、89目、90目、91目、92目、93 目、94目、95目、96目、97目、98目、99目或100目。
优选地，所述混合采用混合机、优选为采用三维混合机进行。
作为优选技术方案，本发明提供了一种助减肥组合物的制备方法，所述方 法包括以下步骤：
将大豆研磨成粉，并与枯草芽孢杆菌、葡萄糖和磷酸氢二钠过80～100目筛 后采用三维混合机按比例混合，得到所述减肥组合物。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的减肥组合物在制备减肥、 降血脂或降胆固醇药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种药物，所述药物包括如第一方面所述的减肥 组合物。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意 一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的减肥组合物将益生菌与膳食纤维成分相组合，以筛选得到的 枯草芽孢杆菌为主要成分，辅以大豆粉、葡萄糖和磷酸氢二钠组成的组合物， 按特定比例相互配合，产生协同作用，具有减肥、减脂和降低胆固醇等作用， 有效降低了大鼠血液中的甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白， 显著降低大鼠体重；
(2)本发明的减肥组合物配方简单合理，将枯草芽孢杆菌的质量百分比限 定在70％～80％，无副作用，安全性好，具有优良的减肥减脂的功效。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发 明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释 本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可 通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1枯草芽孢杆菌的获取和形态学鉴定
(1)菌株获取
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵 的大豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，经历了样品采集→微生物分 离→培养→筛选鉴定→阳性结果→菌种鉴定和保藏→生产出发菌等步骤。
(2)菌株形态学鉴定
将分离的菌株接种于NA固体培养基，在30℃下培养48h，单菌落浅白不 透明，表面不光滑，边缘不整齐、无光泽，质地均一；将菌落接种于LB液体 培养基，30℃恒温振荡培养18-24小时，培养基变浑浊，表面没有菌膜生成。
革兰氏染色后的镜检结果显示，菌体为革兰氏阳性杆菌，多单生，菌株形 成椭圆形芽孢。
实施例2枯草芽孢杆菌的分子鉴定
菌株通过平板划线得到单菌落，挑取单菌落于含有2mL TSB的摇菌管中， 置于28℃振荡培养至浑浊；取1mL菌液于离心管中，10000rpm离心3min后 弃上清，加入50μL无菌水，振匀后于95℃保温处理2min，置于0℃冰箱中备 用；
根据文献记载选择通用引物27F和1492R进行菌株基因组的PCR扩增，反 应条件为94℃预变性3min，35循环(94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延 伸100s)，72℃延伸7min，PCR扩增引物如下：
27F(SEQ ID NO:1)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；
1492R(SEQ ID NO:2)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’.
取5μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳45 min；使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒回收DNA片 段；
将回收的片段进行测序，测序结果在GenBank中通过BLAST比对该菌的 16S rRNA序列片段，结果显示其与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis序列的相似度 (maxidentity)为100％，比对序列覆盖范围(query cover)为100％，E值为0， 因此鉴定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)Subtilisin-QK，鉴定结果可信。
实施例3菌株保藏
本实施例采用甘油冷冻保存法进行菌株保藏，具体步骤如下：
(1)用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在LB培养基平皿上划线分离单菌落；
(2)平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为 3mm左右；
(3)挑取一个单菌落，接种于一个装50mLLB培养基的250mL三角瓶中 37℃振荡培养16小时，至菌密度OD600为3-5；
(4)用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微 镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌；
(5)按1:1加入900μL50％无菌甘油和900μL培养好的种子液，混合后分 装至事先灭菌的菌种保存管(2mL/管)-80℃冰箱保存，在保种管上标明批号。
实施例4菌株测序
将筛选得到的枯草芽孢杆菌与普通枯草芽孢杆菌进行比对分析；
(1)本发明所述枯草芽孢杆菌的筛选过程如下：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵 的大豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，经历了样品采集→微生物分 离→培养→筛选鉴定→阳性结果→菌种鉴定和保藏→生产出发菌等步骤。
(2)本发明所述枯草芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的比对结果：
根据测序结果整理出待检菌的16SrDNA序列(共1514bp)，如SEQ ID NO: 3所示：
AGAGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATAC ATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCG GGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA CGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGG AAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGT CTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTT CCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT TGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAG TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTG GGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG ACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATC TGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAAT CGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGA GGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTG AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA.
将上述测序得到的16SrDNA序列提交到NCBI，比对结果发现，待检菌与 已经公布的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis序列一致。
对该株枯草芽孢杆菌进行基因测序，结果如SEQ ID NO:4所示，为一株新 的枯草芽孢杆菌，将该株枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK。
SEQ ID NO:4：
GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTT AATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAA GCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTTGGATTTAAACAGACAATGAGTGCC ATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGT TCAAAAGCAGTTTAAGTATGTTAACGCAGCCGCAGCAACATTGGATGAAA AAGCTGTAAAAGAATTGAAACAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAA GATCATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTACGGCATTTCTCAAA TTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAA GTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTC AGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACG GCAGTTCTCACGGCACACACGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACA CAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAACGCATCGTTATATGCAGTAAAAG TTCTTGACTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATTATTAACGGCATTG AGTGGGCTATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGAC CTTCTGGATCTACAGCTCTGAAAACAGTCGTTGATAAAGCAGTTTCCAGC GGTATCGTCGTTGCTGCCGCTGCCGGAAACGAAGGTTCATCGGGCAGCAC AAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACCATTGCGGTAGGTGC GGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGC TTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCA CTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGA GCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCATCCGACTTGGACAAACGCGCAAGT CCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTTTCTACTA TGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCACAATAATAG.
实施例5
原料的制备：
枯草芽孢杆菌：本发明所用的枯草芽孢杆菌是经过发酵罐，通过菌种活化、 培养后接种到液体发酵罐中发酵得到的，在发酵完毕后经过离心机离心，将收 集得到的菌体喷雾干燥得到了枯草芽孢杆菌菌粉。
采用筛选得到的枯草芽孢杆菌制备减肥组合物，所述减肥组合物按质量百 分比包括70％枯草芽孢杆菌、20％大豆粉、9.9％葡萄糖和0.1％磷酸氢二钠，其 中，枯草芽孢杆菌的活菌数为3×1011cfu/g。
减肥组合物的制备方法为：
将大豆研磨成粉，并与枯草芽孢杆菌粉、葡萄糖、磷酸氢二钠过80目筛后 采用三维混合机按质量百分比进行混合，得到所述减肥组合物。
实施例6
原料的制备同实施例5；
减肥组合物按质量百分比包括65％枯草芽孢杆菌、30％大豆粉、4.85％葡萄 糖和0.15％磷酸氢二钠，其中，枯草芽孢杆菌的活菌数为2×1011cfu/g。
将大豆研磨成粉，并与枯草芽孢杆菌粉、葡萄糖、磷酸氢二钠过100目筛 后采用三维混合机按质量百分比进行混合，得到所述减肥组合物。
实施例7
原料的制备同实施例5；
减肥组合物按质量百分比包括80％枯草芽孢杆菌、15％大豆粉、4.85％葡萄 糖和0.15％磷酸氢二钠，其中，枯草芽孢杆菌的活菌数为2×1011cfu/g。
将大豆研磨成粉，并与枯草芽孢杆菌粉、葡萄糖、磷酸氢二钠过100目筛 后采用三维混合机按质量百分比进行混合，得到所述减肥组合物。
实施例8
与实施例7相比，枯草芽孢杆菌的活菌浓度为1×1011cfu/g，其他条件与实 施例5相同。
对比例1
与实施例7相比，仅含有活菌数不小于2×1011cfu/g的枯草芽孢杆菌。
对比例2
与实施例7相比，采用市售的活菌数不小于2×1011cfu/g的枯草芽孢杆菌制 备减肥组合物，所述减肥组合物的组成为80％市售枯草芽孢杆菌、15％大豆粉、 4.85％葡萄糖和0.15％磷酸氢二钠。
对比例3
与实施例7相比，减肥组合物不包括枯草芽孢杆菌，组成为30％大豆粉、 10％葡萄糖、0.15％磷酸氢二钠，余量为水。
对比例4
与实施例7相比，减肥组合物不包括大豆粉，组成为80％枯草芽孢杆菌、 4.85％葡萄糖和0.15％磷酸氢二钠，余量为水。
对比例5
与实施例7相比，减肥组合物不包括葡萄糖，组成为80％枯草芽孢杆菌、 15％大豆粉和0.15％磷酸氢二钠，余量为水。
对比例6
与实施例7相比，减肥组合物不包括磷酸氢二钠，组成为80％枯草芽孢杆 菌、15％大豆粉和4.85％葡萄糖，余量为水。
人工胃测试
按照药典中的制备方法，制备了人工胃液，分成6组，每组人工胃液50ml。 其中三组里面加入1×1011cfu的枯草芽孢杆菌(对比例1)，剩余三组加入1×1011cfu的枯草芽孢杆菌制剂(实施例7)，并在不同时间点取样1ml，测量 枯草芽孢杆菌活菌数，得到总体活枯草芽孢杆菌的菌数，结果如表1所示：
表1
时间(h)
对比例1存活菌数
实施例7存活菌数
1
(6.2±0.57)×10<sup>9</sup>
(7.3±0.78)×10<sup>10</sup>
2
(2.12±0.42)×10<sup>8</sup>
(6.32±0.33)×10<sup>9</sup>
4
(8.65±0.50)×10<sup>6</sup>
(1.55±0.44)×10<sup>8</sup>
6
(7.21±0.22)×10<sup>5</sup>
(3.66±0.45)×10<sup>6</sup>
从表1可以看出，将枯草芽孢杆菌制备成制剂后，其枯草芽孢杆菌存活菌 数相比于单一的枯草芽孢杆菌组高，可见，在本申请配方的制剂中，枯草芽孢 杆菌能够与其他组分配合，更好的存活。
减肥组合物对大鼠体重的影响
选取100只体重约为20g的雌性昆明大鼠，采用常规饲料预饲一周，按照 下表2进行随机分组，每组10只。采用实施例5-8和对比例1-7的减肥组合物 进行灌胃1.5mL，正常对照组和模型对照组灌胃1.5mL水，每周称量一次体重， 结果如表3所示。
表2
称重的结果如下表3所示，具体如下：
表3
表4
从表3和表4的统计结果可知，枯草芽孢杆菌组和高脂食物组在第九周和 第十周中，体重都出现了明显的差异；制剂组和高脂食物组在8-10周的统计结 果都显示了明显的差异；制剂组同枯草芽孢杆菌组(C组)数据相比，在第九 周和第十周也都显示出了明显的差异。而通过D-G组与H-L组的对比，采用本 申请筛选得到的枯草芽孢杆菌相比于市售枯草芽孢杆菌效果好，且在膳食纤维 大豆、葡萄糖和磷酸氢二钠的协同作用下，效果更显著，说明枯草芽孢杆菌可 以作为一种减肥益生菌，并且通过该方法制剂后，能更加显著的提高枯草芽孢 杆菌对肥胖大鼠的减肥效果。
减肥组合物对大鼠血清中TG(甘油三酯)、TC(总胆固醇)、HDL(高 密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)的影响
在第十周最后一天，将大鼠禁食12h，处死大鼠，摘眼球取血3ml，分别 用试剂盒测量血清中TG、TC、HDL、LDL的量，具体结果如表5所示：
表5
从表5结果显示，高脂肪食物组的TG、TC、LDL明显高于基础食物喂养 组，HDL明显高于基础食物饲养组，且有显著差异。高脂肪食物大鼠经过枯草 芽孢杆菌饲喂后，大鼠的TG、TC、LDL含量明显降低，HDL含量升高。用枯 草芽孢杆菌制剂组灌胃大鼠后，发现大鼠的TG、TC、LDL含量明显降低，且 比只加枯草芽孢杆菌菌体组相比，也有明显差异。而通过D-G组与H-L组的对 比，采用本申请筛选得到的枯草芽孢杆菌相比于市售枯草芽孢杆菌效果好，且 在膳食纤维大豆、葡萄糖和磷酸氢二钠的协同作用下，血清中TG、TC、HDL、 LDL的量都有明显差异。
枯草芽孢杆菌的计算
分别取8-10周C组、D组和F组(随机抽取制剂两组)大鼠粪便，于大鼠 排便后迅速分装于密闭无菌粪便储存盒中并将标本储存于-80℃低温冰箱中。 称1g样品采用总DNA提取试剂盒提取总菌DNA，微量核酸定量检测仪检测 DNA浓度。再将提取的菌体用本株枯草芽孢杆菌引物进行扩增，具体的扩增体 系如下：
50μl PCR体系：2×Es Taq MasterMix 25μl，27F(SEQ ID NO:1)1μl， 1492R(SEQID NO:2)1μl，总DNA 2μl和H2O 21μl；
PCR程序：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min30s)×30； 72℃，5min。
测定扩增后DNA浓度，并计算出粪便中枯草芽孢杆菌数量占总DNA量的 比例，并将第8周中的只饲喂枯草芽孢杆菌组的枯草芽孢数量含量定为1，分 别计算相应周的制剂组枯草芽孢杆菌数量。
表6
时间
C组
D组
F组
8周
1
3.51
3.68
9周
2.50
20.14
21.17
10周
2.65
19.38
20.45
从表6的结果表明，制剂组中大鼠粪便中枯草芽孢杆菌数量要远远大于只 饲喂枯草芽孢杆菌组。可知，制剂组大鼠肠道中定植有更多的枯草芽孢杆菌， 说明枯草芽孢杆菌制剂在大鼠肠胃中能够保护并激活枯草芽孢杆菌，并且其效 果要优于仅仅只用枯草芽孢杆菌组。
综上所述，本发明的减肥组合物中以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分， 辅以大豆粉、葡萄糖和磷酸氢二钠组成的组合物，按特定比例协同增效，产生 协同作用，具有减肥、减脂和降低胆固醇等作用，有效降低了大鼠血液中的甘 油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，显著降低大鼠体重，应用 前景广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原 料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。
序列表
<110>湖北真福医药有限公司
<120> 一种含有枯草芽孢杆菌的减肥组合物及其制备方法和应用
<130> 20190618
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 1
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1514
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180
accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240
cattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300
ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420
cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcgaatagg gcggcacctt 480
gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540
gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600
gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660
gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720
agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840
tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900
aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020
gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140
tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
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acaaggtagc cgta 1514
<210> 4
<211> 1149
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 4
gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60
gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120
gttggattta aacagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180
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caataatag 1149