阅读说明：本技术 治疗神经退行性相关疾病的刺五加提取物的制备方法 (Preparation method of acanthopanax senticosus extract for treating neurodegenerative related diseases ) 是由 周慧 付佳 何洋 张欣 于 2020-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药用途及制备技术领域,具体涉及治疗神经退行性相关疾病的刺五加提取物的制备方法。本发明通过细胞和动物试验发现：刺五加水提取物,经大孔树脂30％乙醇洗脱组分具有协同作用,作为治疗帕金森疾病的刺五加的最佳有效部位。(The invention belongs to the technical field of medical application and preparation, and particularly relates to a preparation method of an acanthopanax senticosus extract for treating neurodegenerative related diseases. The invention discovers that: the water extract of radix Acanthopanacis Senticosi is eluted with 30% ethanol via macroporous resin to obtain synergistic effect, and can be used as the optimal effective component of radix Acanthopanacis Senticosi for treating Parkinson disease.)

治疗神经退行性相关疾病的刺五加提取物的制备方法

技术领域

本发明属于医药用途及制备技术领域，具体涉及治疗神经退行性相关疾病的刺五加提取物的制备方法。

背景技术

目前，随着全球老龄化进程的加快，与年龄相关的神经退行性疾病(例如：阿尔兹海默病，帕金森病，肌肉萎缩性侧索硬化症，亨廷顿氏病等)已经成为严重危害人类生命健康和降低生活质量的重大疾病。其中，全球帕金森病患者超过400万人，其中我国有170万。研究表明，近20年来，我国大城市患此病的人数猛增。据估计，我国每年有近10万人成为新发的帕金森病患者。患者病后出现肢体震颤、僵直、行动迟缓和姿势平衡障碍以及植物神经症状，病情呈进行性加重，严重限制病人的活动能力及影响病人的生活质量，给病人造成极大的痛苦，也给社会和家庭带来严重的负担，所以迫切需求寻找预防和治疗帕金森病的有效中药，以延缓帕金森症的进程和防止病情的加重。

刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.Et Maxim.)Harms的干燥根。主产于黑龙江省山区。味辛、微苦、性温、无毒，具有益肾健脾，补肾安神作用。目前刺五加复方和刺五加注射液已用于帕金森病的临床治疗，并取得了一定疗效。

现有技术CN200610151066.6公开了刺五加有效部位的提取方法，该方法采用水煎煮法、水提醇沉、大孔吸附树脂法对刺五加进行提取分离，得到所述有效部位。该方法主要控制了提取和浓缩的浓度，其有效部位含量在60％以上，但未知何种提取物对于帕金森病治疗最为有效。

然而，探索发现刺五加治疗帕金森病的有效提取物仍是需要进一步研究和解决的技术问题。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种治疗神经退行性相关疾病的刺五加提取物的制备方法，取刺五加干燥根用水加热回流提取，过滤得到上清液，经70％以上的乙醇沉淀过夜，浓缩上清液后上大孔树脂柱，分别用水、体积比为10％、30％的乙醇水溶液洗脱，得到30％乙醇洗脱液，冻干，即得。

作为本发明的一种优选实施方案，所述神经退行性相关疾病包括但不限于阿尔兹海默病，帕金森病，肌肉萎缩性侧索硬化症，亨廷顿氏病，优选帕金森病。

作为本发明的一种优选实施方案，所述大孔树脂优选AB-8大孔树脂。

作为本发明的一种优选实施方案，洗脱液用量均为5倍树脂柱体积。

作为本发明的一种优选实施方案，洗脱流速为4BV/h。

作为本发明的一种优选实施方案，加热回流提取过程刺五加与水的质量比为3：10。

作为本发明的一种优选实施方案，加热回流提取前，用水浸泡0.5h小时以上。

作为本发明的一种优选实施方案，加热回流提取过程保持微沸状态回流1h，过滤得到上清液。

作为本发明的一种优选实施方案，第一次加热回流提取后的过滤残留物，然后再加入第一次提取所用量的蒸馏水按相同方法提取、过滤得到上清液，将2次所得药液合并浓缩后，得到刺五加根的总水提物(即原液)，再经70％以上的乙醇沉淀。

作为本发明的一种优选实施方案，刺五加提取物有效组分黄酮含量以芦丁计为30.91％±0.76％，皂苷含量以齐墩果酸计为28.97％±2.6％。

本发明相对于现有技术的有益效果包括：

本发明意外的发现30％组分作为治疗帕金森疾病的刺五加的最佳有效部位，并且对30％组分的化学成分研究发现，所述组成的黄酮及皂苷成分并非多种方法分离中最高的，却意外的表现最佳的治疗效果，可见，由于产物中多种物质的存在，通过协同作用表现出优异的治疗效果。

本发明通过自发活动实验，爬竿实验，滚轴实验，悬挂实验。模型组小鼠出现明显行为学障碍，协调运动能力降低，表现为自主活动次数和自发站立次数减少，爬竿、滚轴和悬挂时间延长，表明刺五加根30％组分有明显的抗帕金森的作用。结合细胞实验结果，证实了刺五加对帕金森的预防和治疗作用。

附图说明

图1，对照品芦丁的标准曲线；

图2，对照品齐墩果酸的标准曲线；

图3，MPP⁺浓度不同浓度对细胞存活率的影响

图4，刺五加根各有效组分对氧化应激损伤模型的影响

图5，刺五加根各有效组分对缺氧缺糖模型的影响

图6，30％组分对于帕金森小鼠自主站立次数的影响

图7，30％组分对于帕金森小鼠对于自发活动次数的影响

图8，30％组分对于帕金森小鼠对于爬竿时间的影响

图9，30％组分对于帕金森小鼠对于悬挂时间的影响

图10，30％组分对于帕金森小鼠对于滚轴时间的影响

其中，各图中，*p<0.01，^#p<0.05，与模型组比。

具体实施方式

下面结合具体的实例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实验仪器和材料

氮气吹干仪(HSC-24A)，AB-8大孔吸附树脂(山东鲁抗立科药业有限公司)，Spectra FLOUR plus酶标仪(瑞士TECAN公司)，GENESYS 10S可见光分光光度计(上海君翼仪器设备有限公司)，SanoriusBSl10S分析天平(北京赛多利斯有限公司)，XZR-A旋转蒸发仪(科龙仪器厂)，ALPHA 2-4冻干机(Marin christ公司)，KDM型电热套(鄄城华鲁电热仪器有限公司)，96孔板(thermo公司)

芦丁(四川省维克奇生物科技公司201004)，齐墩果酸(中国药品生物制品检定所200304)，高氯酸、冰醋酸、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸氢铵、硫酸亚铁、甲醇、冰醋酸、盐酸、三氯化铁、磷酸氢二钠、三氯化铁、磷酸二氢钠均为分析纯，购自北京化工厂，30％过氧化氢溶液(北京化工厂)，1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)(Sigma公司)，邻苯三酚(阿拉丁试剂有限公司)，WST-1(南京旋光科技有限公司)，抗坏血酸(VC)、碱性藏红花(藏红T)(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，醋酸钠(益利精细化学品有限公司)，4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)(上海晶纯实业有限公司)。

刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.Et Maxim.)Harms的干燥根采购自北京同仁堂药店，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定。

实施例1，刺五加根提取物的制备

取刺五加干燥根3kg，加入10倍量的蒸馏水，浸泡0.5h小时后，用加热回流提取法，保持微沸状态回流1h，过滤得到上清液。然后再加入10倍量的蒸馏水按相同方法提取、过滤，将2次所得药液合并浓缩后，得到刺五加根的总水提物(即原液)。

刺五加总水提取物，一半冻干成粉末，另一半经70％乙醇沉淀过夜，浓缩为1g·L^-1上清液后上AB-8大孔树脂柱，分别用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇洗脱，得到水洗脱液、10％乙醇洗脱液、30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液、70％乙醇洗脱液、90％乙醇洗脱液，洗脱液用量均为5倍树脂柱体积，洗脱流速为4BV/h。

各洗脱液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，共得到7种刺五加不同组分提取物粉末。

依次分别为原液冻干粉末，水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇冻干粉末。

实施例2，刺五加根提取物的含量测定

总黄酮含量的测定

2.1绘制芦丁标准曲线

将芦丁标准品配置成0.4g·L^-1的溶液，精密吸取芦丁标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于10mL离心管内(不足1mL用60％乙醇补足)，依次加入5％亚硝酸钠200μL，摇匀，静置6min，然后加入10％硝酸铝溶液200μL，摇匀，静置6min，最后加入4％氢氧化钠溶液1mL，加入60％乙醇稀释到5mL，静置15min，以对应的60％乙醇为空白，于510nm波长下测定其吸收度。吸光度为纵坐标，取样浓度为横坐标，绘制芦丁标准曲线。

如图1，标准方程为y＝10.6x+0.0036，r＝0.9982。表明芦丁浓度在0.016～0.08g·L^-1线性关系良好。

2.2总黄酮含量测定

将7种刺五加不同组分提取物粉末稀释到一定浓度，各取三个平行样，按2.1方法显色，测定吸光度，从标准曲线上计算相当于芦丁量。

总皂苷含量的测定

2.3绘制齐墩果酸标准曲线

将齐墩果酸标准品配置成0.3g·L^-1的溶液，精密吸取齐墩果酸标准溶液50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL分别置于10mL离心管内，氮气吹干，加入5％香草醛-冰醋酸溶液200μL和800μL高氯酸溶液，混匀后于70℃恒温水浴15min后，流水冷却2min，继续加入5mL冰醋酸，摇匀于550nm波长下测定其吸光度，取样浓度为横坐标，绘制齐墩果酸标准曲线。

如图2，标准方程为y＝40.56x+0.0033，r＝0.9990。表明齐墩果酸浓度在0.0025～0.015g·L^-1线性关系良好。

2.4总皂苷含量测定

将7种刺五加不同组分提取物粉末稀释到一定浓度，各取三个平行样，按2.3方法显色，测定吸光度，从标准曲线上计算相当于齐墩果酸量。

结果与结论

刺五加根7种有效组分黄酮含量以芦丁计依次为27.52％±4.8％，11.07％±1.3％，21.37％±3.5％，30.91％±0.76％，53.10％±0.52％，55.43％±3.5％，17.48％±4.8％。

刺五加根7种有效组分皂苷含量以齐墩果酸计依次为8.93％±3.7％，8.63％±4.3％，10.63％±2.1％，28.97％±2.6％，37.03％±3.6％，30.82％±2.2％，7.9％±4.8％。

实施例3细胞实验

3.1材料

PC₁₂细胞株购自中国科学院上海细胞库。

96孔板(thermo公司)，Spectra FLOUR plus酶标仪(瑞士TECAN公司)，TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂)

30％过氧化氢溶液(北京化工厂)，胎牛血清购自浙江天杭生物科技公司，DMEM无糖培养基购自gibco公司，DMEM高糖培养基购自HyClone公司，硫酸青霉素、硫酸链霉素、胰蛋白酶、噻唑兰(MTT)、二甲基亚(DMSO)均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，谷氨酸购自中国惠世生化试剂有限公司，1-甲基-4-苯基-l,2,3,6-四氢吡啶(l-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)购自上海德默医药科技有限公司。

3.2方法

3.2.1待用溶液的配制

PBS:氯化钠4g，氯化钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸氢二钠1.44g，500mL超纯水高压灭菌，待用。

0.25％胰蛋白酶：0.25g胰蛋白酶，100mL过无菌滤膜，6h后，待用。

双抗：62.5mg硫酸青霉素和100mg硫酸链霉素10mLPBS溶解，过无菌滤膜，待用。

完全培养基：10％胎牛血清，0.1％双抗，高糖DMEM

MTT溶液：40mg，40mLPBS溶解，配制成1g·L^-1过无菌滤膜，避光，待用。

培养箱条件：37℃，5％CO2，湿度90％。

刺五加7种有效组分，用完全培养基配成0.16g·L^-1，待用。

刺五加7种有效组分，用缺糖培养基配成0.16g·L^-1，待用于细胞缺氧缺糖模型中。

3.2.2种96孔板

取对数期PC12细胞，当细胞长满瓶底80％时，用酒精棉擦拭后，放入超净台，弃去原有培养液，用PBS润洗2次，用1mL0.25％胰蛋白酶消化约10min，显微镜下，观察，细胞间隙增大近乎圆形，加入1mL培养基终止消化，用移液枪吹打至单细胞状态，1000r/min，10min。弃掉上清，加入10％完全培养基调细胞密度为1.8×10⁵10⁵个/mL,96孔板***每孔加入200mLPBS，剩下每孔加入100mL细胞密度为1.8×10⁵10⁵个/mL细胞悬液，加入时边加边摇，防止细胞沉降导致种板密度不同，种完后，放入恒温箱中培养24h.

3.2.3摸造膜药MPP⁺浓度

按2.2种96孔板，24h后，用2.5mL注射器将培养基吸出，而模型组分为4个不同浓度，MPP⁺终浓度0.13g·L^-1，0.15g·L^-1，0.18g·L^-1，0.2g·L^-1，每孔100μL，空白组加入100μL完全培养基即正常生长的细胞，每个样平行4个孔，放入恒温箱中孵育24h后，用2.5mL注射器将液体吸出，加入MTT溶液，避光放入恒温箱中孵育4h后，用2.5mL注射器将MTT溶液吸出，每孔加入100μLDMSO溶液，放入37℃恒温震荡箱中，10min后于570nm测定每孔吸光度值。

3.2.4MPP⁺诱导帕金森模型

按2.2种96孔板，24h后，用2.5mL注射器将培养基吸出，给药组将刺五加7种不同组分溶液0.16g·L^-1每孔50μL(即终浓度为0.08g·L^-1)和0.4g·L^-1MPP⁺50μL，空白组加入100μL完全培养。模型组每孔加入0.4g·L^-1MPP⁺50μL和完全培养基50μL，每孔做4个平行孔，放入恒温箱中孵育24h后，用2.5mL注射器将液体吸出，加入MTT溶液，避光放入恒温箱中孵育4h后，用2.5mL注射器将MTT溶液吸出，每孔加入100μLDMSO溶液，放入37℃恒温震荡箱中，10min后于570nm测定每孔吸光度值，计算细胞存活率。

根据数据分析,MPP⁺对PC₁₂细胞具有损伤作用，并且具有一定的量效关系，这四种浓度下的细胞存活率与空白组比均具有极显著性差异。当造膜药MPP⁺浓度0.20g·L^-1为50.38％±1.39％，说明细胞模型建立成功。选择的造膜条件为0.20g·L^-1MPP⁺终浓度，孵育24h。

3.2.5谷氨酸建立兴奋性毒性损伤模型

按2.2种96孔板，24h后，用2.5mL注射器将培养基吸出，给药组刺五加7种不同组分溶液50μL和每孔50μL10.2 g·L^-1谷氨酸溶液(完全培养基溶解后过无菌滤膜)，造膜药终浓度为5.1g·L^-1,空白组加入100μL完全培养。模型组每孔加入10.2g·L^-1谷氨酸溶液50μL和完全培养基50μL，每孔做4个平行孔，放入恒温箱中孵育24h后，用2.5mL注射器将液体吸出，加入MTT溶液，避光放入恒温箱中孵育4h后，用2.5mL注射器将MTT溶液吸出，每孔加入100μLDMSO溶液，放入37℃恒温震荡箱中，10min后于570nm测定每孔吸光度值，计算细胞存活率。

3.2.6过氧化氢建立氧化应激损伤模型

按2.2种96孔板，24h后，用2.5mL注射器将培养基吸出，给药组刺五加7种不同组分溶液每孔加入过氧化氢溶液9×10^-4％过氧化氢溶液50μL(即终浓度4.5×10^-4)，空白组加入100μL完全培养。模型组每孔加入9×10^-450μL过氧化氢溶液和完全培养基50μL，每孔做4个平行孔，放入恒温箱中孵育24h后，用2.5mL注射器将液体吸出，加入MTT溶液，避光放入恒温箱中孵育4h后，用2.5mL注射器将MTT溶液吸出，每孔加入100μLDMSO溶液，放入37℃恒温震荡箱中，10min后于570nm测定每孔吸光度值，计算细胞存活率。

3.2.7建立缺氧缺糖模型

无糖培养基：10％胎牛血清，0.1％双抗，无糖DMEM

缺氧培养箱条件：37℃，93％N₂，7％CO2，湿度90％。

刺五加7中有效组分溶液，用无糖培养基配成0.16g·L^-1，待用。

按2.2种96孔板，24h后，用2.5mL注射器将培养基吸出，给药组刺五加7种不同组分溶液每孔100μL，空白组加入100μL完全培养基放入正常培养箱中孵育24h，模型组每孔加入100μL无糖培养基，每孔做4个平行孔，放入缺氧恒温箱中孵育24h后，用2.5mL注射器将液体吸出，加入MTT溶液，避光放入恒温箱中孵育4h后，用2.5mL注射器将MTT溶液吸出，每孔加入100μLDMSO溶液，放入37℃恒温震荡箱中，10min后于570nm测定每孔吸光度值，计算细胞存活率。

3.3结果与结论

3.3.1MPP⁺诱导帕金森模型

由图3可知，将空白组正常生长的细胞细胞活力看做100％，当模型组细胞存活率为54.49％时，刺五加7种有效组分终浓度为0.08g·L^-1时，30％组分细胞存活率可以达到83.00％±1.16％为最佳，其次是水洗部位细胞活力为80.53％±1.30，而后是10％组分，50％组分和原液，细胞存活率分别为75.00％±2.00％，74.69％±2.16％，74.04％±1.33％。以上组分与模型组比较，均具有极显著性差异。

3.3.2氧化应激性损伤模型

由图4可知，将空白组正常生长的细胞细胞存活率看做100％，当模型组细胞存活率为54.49％时，刺五加7种有效组分终浓度为0.08g·L^-1时，30％组分细胞存活率可以达到81.78±1.71％为最佳，其次是50％部位细胞存活率为75.76％±0.31％，而后是10％组分71.27％±0.64％。这三种组分p<0.01，与模型组比较，均具有极显著性差异。

3.3.3细胞缺氧缺糖损伤模型

由图5可知，将空白组正常生长的细胞细胞存活率看做100％，当模型组细胞存活率为37.16％时，空白组与模型组有机显著性差异，说明模型建立成功。刺五加7种有效组分终浓度为0.08g·L^-1时，30％组分细胞存活率可以达到65.44％±0.81％为最佳，其次是10％部位细胞存活率为55.35％±0.40％，而后是50％组分和水洗组分也较好，细胞存活率分别为47.73％±0.72％和45.02％±0.44％。这二种组分p<0.01，与模型组比较，均具有极显著性差异。

综上，由MPP⁺诱导帕金森疾病建立PC₁₂细胞的帕金森模型，空白组与模型组两者之间有极显著性差异，说明模型建立成功。其中刺五加根30％组分，最能增加细胞的成活率，可以考虑开发30％组分作为治疗帕金森疾病的刺五加的有效部位。在氧化应激损伤模型与缺氧缺糖损伤模型中，30％组分均具有最显著性的疗效，说明当细胞受到氧化应激和缺氧缺糖状态下，30％部位可以避免缓解或者治疗这2种损伤状态。

实施例4动物实验预实验

4.1材料

C57/6BL雄性小鼠，鼠龄3-4月大，体重20g左右。购自长春生物制品研究所有限责任公司。

ZZ-6小鼠自主活动测试仪(成都泰盟软件有限公司)，YLS-4C转棒式疲劳仪(济南益延科技发展有限公司)

生理盐水购自辰欣药业有限股份公司，美多芭购自上海罗氏制药有限公司，1-甲基-4-苯基-l,2,3,6-四氢吡啶(l-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)购自上海德默医药科技有限公司。

4.2方法

4.2.1刺五加根30％组分浓度的确定

实验前，小鼠适应环境5天。将小鼠随机分为5组，每组5只。

正常组(n＝5)：给予与灌胃等体积的生理盐水。

模型组(n＝5)：给予与灌胃等体积的生理盐水。

低剂量组(n＝5)：灌胃刺五加根30％组分2.25g生药kg^-1d^-1

中剂量组(n＝5)：灌胃刺五加根30％组分4.50g生药kg^-1d^-1

高剂量组(n＝5)：灌胃刺五加根30％组分13.5g生药kg^-1d^-1

灌胃剂量按0.1mL/10g，连续注射7天，从第8天开始除正常组外，均腹腔注射30mg/kg/dMPTP溶液，于第15天后腹腔注射1h后，做以下行为学测试，自发活动实验，爬杆实验，滚轴实验和悬挂实验，结束后，处死。

4.2.2动物实验

实验前，小鼠适应环境5天。将小鼠随机分为4组，每组15只。

正常组(n＝15)：给予与灌胃等体积的生理盐水。

模型组(n＝15)：给予与灌胃等体积的生理盐水。

美多芭组(n＝15)：灌胃100mg kg^-1d^-1

刺五加根30％组(n＝15)：灌胃刺五加根30％组分4.50g生药kg^-1d^-1

灌胃剂量按0.1mL/10g，连续注射7天，从第8天开始除正常组外，均腹腔注射30mg/kg/dMPTP溶液，于第15天腹腔注射1h后做以下行为学测试，自发活动实验，爬竿实验，滚轴实验和悬挂实验，结束后，分离脑组织及血清样品。

4.3结果与结论

4.3.1活动实验结果

由图6，7可知，与正常组比较，模型自发活动次数和自主站立次数均明显减少(p<0.01)，说明造膜成功。与模型组相比，美多芭和刺五加根30％组分自发活动次数和自主站立次数均缩短(p<0.05)，具有显著性差异。

4.3.2爬竿实验结果

从图8，9与正常组比较，模型组爬竿时间和悬挂时间明显延长p<0.01，与模型组比较，美多芭组和刺五加根30％组分组爬竿爬竿时间和悬挂时间明显缩短(p<0.05)。

4.3.3滚轴实验结果

由图10与正常组比较，模型组滚轴时间明显缩短(p<0.01)，与模型组比较，美多芭与刺五加根30％滚轴时间明显增加(p<0.01)。

综上，采用C57/6BL腹腔注射MPTP的方法建立小鼠PD模型，造膜15天后，造膜组小鼠出现肌肉振颤，竖尾，竖毛，窜动等。注射MPTP后1h后进行以下行为学指标检测，自发活动实验，爬竿实验，滚轴实验，悬挂实验。模型组小鼠出现明显行为学障碍，协调运动能力降低，表现为自主活动次数和自发站立次数减少，爬竿、滚轴和悬挂时间延长，表明刺五加根30％组分有明显的抗帕金森的作用。结合细胞实验结果，证实了刺五加对帕金森的预防和治疗作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。