阅读说明：本技术 一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用 (Extraction process and application of acanthopanax bark flavone ) 是由 苏建青 阚琦缤 褚秀玲 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物化学技术领域,尤其涉及一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用。本发明首次提出对刺五加茎皮部位的黄酮进行超声波辅助乙醇提取工艺,并提供了一套能够较大程度从刺五加茎皮中提取黄酮的工艺,具体为：乙醇浓度50％,提取时间65min,液料比40mL/g,提取温度65℃,吐温80浓度1.8％(体积分数),提取功率300W的超声波提取工艺,优化后的黄酮提取率为24.75mg/g。(The invention belongs to the technical field of biochemistry, and particularly relates to an extraction process of acanthopanax bark flavone and application thereof. The invention provides an ultrasonic-assisted ethanol extraction process for the flavone in the bark of the acanthopanax senticosus for the first time, and provides a set of processes capable of extracting the flavone from the bark of the acanthopanax senticosus to a greater extent, which specifically comprises the following steps: the ethanol concentration is 50%, the extraction time is 65min, the liquid-material ratio is 40mL/g, the extraction temperature is 65 ℃, the Tween 80 concentration is 1.8% (volume fraction), the extraction power is 300W, and the optimized flavone extraction rate is 24.75 mg/g.)

一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用。

背景技术

刺五加acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms属于五加科植物，灌木，高1-6米，分枝多，生于海拔数百米至2000米的森林或灌木丛中，主要分布东北三省及朝鲜等地。刺五加性温，味辛，微苦；归脾、肾、心经，作为药物的应用历史十分悠久。明代李时珍在《本草纲目》中表明，刺五加为“本经上品”，具有“补中益气，坚筋骨，强意志，久服轻身耐老”的功效，主要用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦等症。现代研究发现刺五加主要的化学成分包括黄酮类、苷类、多糖类、多酚类化合物以及钠、钾、硒和铁等微量元素，其中黄酮类成分是其主要活性成分之一，可扩张冠状动脉，增加冠状血流量，并有轻度减慢心率，抑制心收缩力，减少氧化应激，抑制炎症因子等作用，在畜禽生产中被用于畜禽抗炎、抗氧化和抗应激的治疗和保健用药。

近年来，随着抗生素逐渐退出畜禽养殖的历史，中药在畜禽疾病预防与治疗上得到快速发展，对刺五加的需求量逐渐增加，导致出现畜禽和人争药的现象，因此开发新的刺五加药用来源或药用部位，是解决刺五加用供应量不足的一条途径。目前，药典规定的入药部位为刺五加干燥根和根茎，刺五加叶和果实也被用于刺五加茶、刺五加保健饮料等。而刺五加茎或茎皮没有得到很好的应用，作为一种灌木，刺五加每年能产生大量茎或茎皮，因此，研究刺五加茎及茎皮的药用价值及其有效成分含量，具有重要意义。

前期研究发现，刺五加茎皮中的黄酮含量显著高于刺五加茎中的含量，刺五加茎皮的含量是12.37％，而茎的含量只有8.25％(相同条件下的水提结果)。说明刺五加茎皮是更有潜力开发为药用价值的部位。将刺五加茎皮中的有效成分黄酮更加充分的提取出来，是高效利用刺五加茎皮的关键，这也将对野生刺五加资源的保护具有重要意义。

目前对于刺五加的有效成分的提取部位主要集中在药用部位根及根茎，保健用品刺五加果实或刺五加叶上，而刺五加茎皮的报道极少。在提取方法上也是传统的热水浸提或乙醇回流，不仅费时、费力，而且由于高温还会导致有效成分分解。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用。

本发明是这样实现的，一种刺五加茎皮黄酮提取工艺，包括以下步骤：

步骤1：将刺五加干燥茎皮清洗干净，干燥后粉碎，得到刺五加茎皮粉末；

步骤2：将刺五加茎皮粉末置于乙醇溶液中，超声提取；

步骤3：100目滤网过滤，得到含黄酮的滤液。

进一步地，步骤1中，将刺五加茎皮于60℃干燥24h。

进一步地，步骤1中得到的刺五加茎皮粉末进行筛选，保留能够通过60目筛，但不能通过40目筛的刺五加茎皮干粉进行提取操作。

进一步地，步骤2中所用乙醇浓度为45％-75％。

进一步地，步骤2中刺五加茎皮粉末与乙醇溶液的液料比为(15-40):1。

进一步地，步骤2中所用超声波功率为150-400W。

进一步地，步骤2中提取温度为45-70℃。

进一步地，步骤2中提取时间为25-75min。

进一步地，步骤2中吐温80体积百分数为1.8％。

进一步地，步骤2中所用乙醇浓度50％，提取时间65min，液料比40：1，提取温度65℃，超声波功率为300W，吐温80体积百分数为1.8％。

如上所述的一种刺五加茎皮黄酮提取工艺在刺五加黄酮提取中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明首次提出对刺五加茎皮部位的黄酮进行提取的工艺，刺五加茎皮作为刺五加中药的非利用部位，每年被作为废物浪费掉了，研究并开发刺五加茎皮的保健或药用价值，有利于提高刺五加药用植物的整体利用率，还能够解决畜禽的临床治疗和保健用药；药典规定的刺五加提取方法是热水浸提或乙醇回流提取，不仅提取时间长，而且费时费力，由于高温，还会引起活性成分的失活。目前，新的提取方法如超声波提取、微波提取和超高压提取已经得到利用，新的提取方法具有省事、省力、提取温度低、提取效率高等优点。本发明采用超声波辅助乙醇的新型提取方法，并加入能提高黄酮提取率的表面活性剂吐温80来促进黄酮的释放，获得刺五加茎皮黄酮的最佳提取工艺，为刺五加茎皮的临床开发提供支撑。具体程序为：乙醇浓度50％，提取时间65min，液料比40mL/g，提取温度65℃，提取功率300W，吐温80体积百分数为1.8％的超声波提取工艺，优化后的黄酮提取率为24.75mg/g。

本研究采用新型的超声波辅助乙醇提取，能够缩短提取的时间，而且避免了高温对有效成分的破坏，相对传统的提取方法，黄酮提取率更高。

附图说明

图1是乙醇浓度对刺五加黄酮提取的影响；

图2是提取时间对刺五加黄酮提取的影响；

图3是液料比对刺五加黄酮提取率的影响；

图4是提取温度对刺五加黄酮提取率的影响；

图5是超声波功率对刺五加黄酮提取的影响；

图6是吐温80浓度对提取率的影响；

图7是乙醇浓度与提取时间对刺五加黄酮提取的影响；

图8是乙醇浓度与液料比对刺五加黄酮提取的影响；

图9是提取时间与液料比对刺五加黄酮提取的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种刺五加茎皮黄酮提取工艺及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例1提取方法

取刺五加干燥茎皮清洗表面土壤，用鼓风干燥箱在60℃下干燥24h后，用粉碎机粉碎，筛选能过60目筛，但不能通过40目筛的刺五加茎皮干粉备用。

刺五加茎皮黄酮提取：准确称取3g上述制备的刺五加茎皮粉末，置于带塞的锥形瓶中，加入乙醇溶液后放入超声波清洗机中进行刺五加茎皮黄酮的提取。用纱布滤去残渣，使用移液枪从滤液中吸取5mL，以10000r离心5min后，取1mL于25mL容量瓶中进行刺五加黄酮含量的测量，测量方法为亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法。

刺五加茎皮总黄酮提取率计算公式为：

式中：Y为刺五加茎皮总黄酮提取率(mg/g)；C为稀释后总黄酮提取液浓度(mg/mL)；N为提取液稀释倍数；M为刺五加茎皮干粉质量(g)。

实施例2单因素试验

初步选定乙醇浓度、提取时间、液料比、提取温度、超声波提取功率及吐温80浓度进行单因素试验，考察这六种因素对刺五加茎皮黄酮提取率的影响。

乙醇浓度对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：将乙醇浓度的体积百分数设置为45％，50％，55％，60％，65％和70％；称取刺五加茎皮干燥粉末3g，其他因素固定为：液料比为30:1，提取时间55min，提取温度50℃，超声功率300W，吐温80为1％。

提取时间对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：将提取时间设为25min，35min，45min，55min，65min和75min；称取刺五加茎皮干燥粉末3g，其他因素固定为：液料比值为30:1，乙醇浓度60％，提取温度50℃，提取功率300W，吐温80为1％。

液料比对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：将液料比设为15:1，20:1，25:1，30:1，35:1，40:1；称取刺五加茎皮干燥粉末3g，其他因素固定为：乙醇浓度60％，提取时间55min，提取温度50℃，提取功率300W，吐温80为1％。

提取温度对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：将提取温度设为45℃，50℃，55℃，60℃，65℃和70℃；称取刺五加茎皮干燥粉末3g，其他因素固定为：乙醇浓度60％，液料比30:1，提取时间55min，提取功率350W，吐温80为1％。

提取功率对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：将超声波功率设为150W，200W，250W，300W，350W和400W；称取刺五茎皮加干燥粉末3g，其他因素固定为：乙醇浓度60％，液料比30:1，提取时间50min，提取温度50℃，吐温80为1％。

吐温80浓度对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：将吐温80浓度设为0.23％，0.45％，090％，0.18％和0.36％；称取刺五茎皮加干燥粉末3g，其他因素固定为：乙醇浓度60％，液料比30:1，提取时间50min，提取温度50℃，提取功率为300W。

实验结果：

乙醇浓度对刺五加茎皮黄酮提取的影响：结果如图1所示，随着乙醇浓度的逐步升高，刺五加茎皮黄酮的提取率逐步提高，在乙醇浓度为60％时达到峰值(18.27mg/mL)；当乙醇浓度的继续升高时，黄酮的提取率呈下降趋势。提取率先升后降其原因可能为：黄酮类化合物随乙醇浓度的增加，其析出量逐渐增多，在60％时达到最大值；而乙醇浓度继续增加可能导致一些水溶性黄酮析出量减少，并且容易使亲脂性的物质析出，同黄酮类化合物形成竞争，从而黄酮提取率下降。

提取时间对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：结果如图2所示，黄酮提取率随时间的延长而逐步升高，在55min达到最大值(17.65mg/mL)；而后随提取时间继续延长其提取率呈下降趋势，其原因可能是超长的提取时间会导致刺五加茎皮中的黄酮类化合物发生分解，从而导致刺五加茎皮黄酮提取率快速下降。

液料比对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：液料比对于刺五加茎皮黄酮提取率的影响变化见图3，液料比在20:1至35:1时，刺五加茎皮黄酮提取率迅速增加，在35:1时达到顶峰(18.60mg/mL)；当液料比提高到40:1，其提取率稍有下降。究其原因可能为，随液料比增加，乙醇溶质的含量也在增高，从而可以溶解出更多的黄酮类化合物；当其提取率达到最大值后，再进一步增加液料比，提取率反而略有下降。

提取温度对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：提取温度也是对黄酮提取率有影响的一个因素，由图4可以看出，刺五加茎皮黄酮提取率在65℃达到最大值(22.42mg/mL)。随温度再次升高，黄酮的提取率反而下降；其原因可能为黄酮在溶剂中的溶解度会随温度的升高而适当增高，且黄酮的扩散效率也会加快，从而使黄酮的提取率提高；但当温度过高时，黄酮类化合物可能会发生水解从而使提取率下降，因此选择65℃为最佳的提取温度。

提取功率对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：黄酮提取率随超声波提取功率的变化趋势见图5，随超声波功率的升高，黄酮提取率快速提高，在300W处到达最大值(21.77mg/mL)，这是由于超声波会破坏细胞壁结构，使刺五加细胞中的内容物扩散到溶剂中，从而提高了溶液中黄酮的含量。当提取功率继续提高，由于超声波的空泡化作用反而会使黄酮提取率下降，因此选择300W为最佳的提取功率。

吐温80浓度对刺五加茎皮黄酮提取率的影响：黄酮的提取率随着吐温80％的浓度上升而升高，在1.8％时达到做大值，见图6。吐温80作为表面活性剂，在提取溶液中可以形成胶束，促进亲水和亲油物质的平衡，有利于疏水性的黄酮溶出，提高其溶解度，但是过高的表面活性剂浓度可能会改变溶液的性质，降低黄酮的提取率。因此，1.8％的吐温80是最好的提取助溶剂。

实施例3响应面优化试验

根据单因素试验结果，选取乙醇浓度(50-70％)，提取时间(45-65min)和液料比(30-40mL/g)进行三因素，三水平的响应面设计，见表1。

表1 Box-Behnken设计因素及其水平表

使用Dsign Expert 10.0.4中的Box-Behnken design(BBD)进行17组三因素、三水平试验，见表2，从而对刺五加茎皮黄酮提取条件进行优化。为了预测优化条件，优先拟合出二级多项式方程：

式中：Y为刺五加茎皮黄酮提取率的响应值；Xi和Xj为不同提取条件的编码值；β0为二次方程的截距；β_i、β_ii、β_ij为观察到的响应值中计算得到的不同项回归系数；X_iX_j和X_i ²分别代表不同因素的交互作用项和二次项。

表2 Box-Behnken试验设计表及结果

实验结果：

数据分析和模型拟合：将17组BBD响应面分析试验所得结果填入表2，使用DesignExpect 10.0.4通过多元回归分析对所得数据进行分析，结果见表3，并得到有关提取率的回归方程：

Y＝23.244-0.848X₁+0.103X₂+0.635X₃-0.430X₁X₂-0.085X₁X₃+0.045X₂X₃-0.477X₁ ²-0.042X₂ ²-0.122X₃ ²

AVOVA用于分析模型的显著性和适合度，该模型的F值为17.72，表明其具有高度的显著性。而失拟项的P值为0.1195，表现为不显著，说明该模型具有良好的拟合程度。测量得到的信噪比为14.784，其比率大于4，表明该模型具有足够强的信号，可用于指导刺五加茎皮黄酮提取。

表3 Box-Behnken试验设计ANOVA方差分析表

*P<0.05显著，**P<0.01极显著

3D响应面分析：根据拟合的二次多项式方程以及AVOVA方差分析，由DesignExpert 10.0.4可得到相应的响应面3D图和等高线图，可进一步明确乙醇浓度(X1)、提取时间(X2)和液料比(X3)对刺五加茎皮黄酮提取率的影响。响应面3D图以及等高线图见图7，图8，图9。

本发明采用超声波辅助乙醇提取刺五加茎皮黄酮，通过乙醇浓度，提取时间，液料比，提取温度、提取功率以及吐温80浓度这六种因素，对其提取工艺进行优化。其中提取温度和提取功率对于刺五加茎皮黄酮的提取率的影响差异不显著(P<0.01)，提取时间和乙醇浓度对于提取率的影响差异性显著(0.01<P<0.05)，液料比则差异性极显著(P>0.05)。因此选择乙醇浓度、液料比和提取时间进行响应面优化分析，其中R²为0.9580，且乙醇浓度同提取时间的协同效应差异性显著。由图7可以看出，随着乙醇浓度的降低，提取率坡度变化趋势较陡，表明提取率迅速升高，这说明降低乙醇浓度有利于提高溶液中刺五加茎皮黄酮的含量。而随提取时间的增加，提取率缓慢升高，同样说明延长提取时间有助于提取刺五加茎皮中的黄酮，只是增加的速度相对较慢。即乙醇浓度相对提取时间来说对刺五加茎皮黄酮提取率影响更大。图8展示黄酮提取率随着液料比的增大而增大，并在乙醇浓度的影响下，提取率的坡度变化较为迅速，说明增加液料比有助于黄酮提取率的升高。且乙醇浓度对液料比有促进作用。两者共同作用可使刺五加茎皮黄酮的提取效率迅速提高。图9表明提取时间与液料比共同作用对刺五加茎皮黄酮提取率的影响，提取率随液料比的增加而缓慢增加，同样随提取时间的延长提取率的增加也较为缓慢。这表明提取时间与液料比对刺五加茎皮黄酮提取率的影响较小。

结合3D响应面效果图以及单因素试验进行分析，刺五加茎皮有效成分中黄酮类化合物的最佳提取条件为；乙醇浓度50％，提取时间65min，液料比40mL/g，即40：1，提取温度65℃，提取功率300W，吐温80浓度为1.8％，优化后的黄酮提取率为24.75mg/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。