阅读说明：本技术 新型Neddylation抑制剂的医药用途 (Medical application of novel Neddylation inhibitor ) 是由 贾立军 李剑 倪帅帅 张军千 陈鑫 于 2019-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及式I<Sub>A</Sub>所示化合物或其药学上可接受的盐及其药用组合物在预防、延缓或治疗NEDDylation通路参与或介导的疾病中的医药用途,及I<Sub>A</Sub>参与的联合用药。<Image he="414" wi="700" file="DDA0002031132190000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to the formula I A The compounds or the pharmaceutically acceptable salts and the medical application of the compounds or the pharmaceutically acceptable salts and the medical compositions thereof in preventing, delaying or treating diseases in which NEDDylation pathways participate or are mediated, and I A The participated combined medication.)

新型Neddylation抑制剂的医药用途

技术领域

本发明涉及新型Neddylation抑制剂的发现及其医药用途，具体提供了式I_A化合物或其药学上可接受的盐及其药用组合物在预防、延缓或治疗NEDDylation通路参与或介导的疾病中的医药用途，尤其是在抗肿瘤领域内的应用。同时，提供一类I_A参与的多药物联合治疗抗肿瘤方法。

背景技术

蛋白质的降解主要通过两种途径：溶酶体降解途径和泛素(ubiquitin)介导的蛋白酶体降解途径。在真核细胞中，泛素蛋白酶系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)在一系列特殊酶的作用下，从细胞内的蛋白质底物遴选出靶蛋白分子，并对这些靶蛋白进行特异性修饰，这个过程称为泛素化修饰(Ubiquitination)。泛素化修饰在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。在肿瘤研究领域，众多研究也证明了泛素化修饰在肿瘤发生、转移、肿瘤微环境形成起着至关重要的作用。

与泛素化的过程类似，类泛素化也是通过相同的酶促反应(E1-E2-E3)与底物相结合。 Neddylation是其中最重要的类泛素化通路之一。与Ubiquitination不同，Neddylation通常不直接参与蛋白质的降解，而是作为蛋白活化信号来调控细胞内各转录因子的活性。 Neddylation修饰过程主要为类泛素分子NEDD8(neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8)通过三步酶促级联反应，最终和目标蛋白结合(图 1)。修饰过程首先在ATP存在的条件下，NEDD8被NEDD8激活酶E1(NEDD8-activating enzyme E1,NAE)催化激活，激活后的NEDD8通过巯基化反应转移到两个结合酶UBE2M (或称UBC12)或UBE2F中的一个，最后在E3连接酶的催化作用下，将NEDD8从E2 转移到底物蛋白上完成修饰。

不同于泛素化系统中E3连接酶多达4个家族和600多种亚型，Neddylation E3连接酶只有10个，且大部分都包含泛素相关RING(Really Interesting New Gene)结构特征域。由于直接调控Cullin-RING泛素连接酶(CRLs)的修饰，Neddylation E3连接酶RBX1 (RING-box proteins 1，又称为ROC1)和RBX2(又称为ROC2/SAG)是研究最为深入的两类。CRL泛素连接酶家族能特异性调控约20％经过泛素-蛋白酶体系统介导的底物降解，其底物包括细胞周期调节蛋白、转录因子、信号转导分子、促癌蛋白、抑癌蛋白、DNA复制调控蛋白等。Cullins蛋白家族(cullin-1、2、3、4a、4b、5、7、9，其中cullin-7和cullin-9 研究较少)是CRLs的骨架蛋白，Neddylation E3连接酶RBX1通过和Neddylation修饰的 UBE2M配对，催化cullins家族中的cullin-1、2、3、4a、4b发生Neddylation修饰。同样地，NEDD8E3连接酶RBX2通过和Neddylation修饰的UBE2F配对，催化cullins家族中的cullin-5发生Neddylation修饰。

2009年，米伦纽姆制药公司(Millennium Pharmaceuticals,Inc)首次报道了通过高通量药物筛选模型发现腺嘌呤核苷酸(AMP)类似物MLN4924能够通过和ATP竞争NAE 蛋白结合口袋，抑制ATP对NAE的二次激活，最终阻断Neddylation对CRLs的修饰。随后的药物-蛋白晶体复合结构也证实了MLN4924和NEDD8在NAE腺苷酰化功能域发生了共价结合(MLN4924结构中的氨基磺酸甲酯侧链与NEDD8的半胱氨酸巯基结合)，目前该候选药物现已进入急/慢性骨髓性白血病临床III期实验阶段。依赖于对NAE抑制剂的深入了解，多个具有氨基磺酸甲酯侧链的核苷类药物被设计、合成并用于对Neddylation通路抑制活性的筛选。但是核苷类抗肿瘤药物潜在的代谢毒性，易耐药及核心结构几乎完全被专利覆盖，可能导致该类药物无论在成药性研究还是知识产权的保护上都面临巨大阻碍。因此，发展一类非核苷类Neddylation抗肿瘤小分子抑制剂是必然趋势。

同时，已有报道发现将Neddylation抑制剂MLN4924和组蛋白去乙酰化试剂联用，能够有效提升药物的抗肿瘤效果(Liang Zhou,et al.Blood,2016,127,2219)。鉴于此，本发明也将利用Neddylation抑制剂的这一优势，开展相关药物联用实验。

发明内容

本发明利用体外酶活验证、细胞体内NEDDyaltion通路阻断实验，细胞活性筛选，最终获得了式I_A具有阻断NEDD8-cullins作用通路的化合物。

本发明旨在提供式I_A所示化合物或其药学上可接受的盐及其药用组合物的医药用途，尤其是在预防、延缓或治疗NEDDylation通路参与或介导的疾病，尤其是在抗肿瘤领域内的应用。

本发明为拓宽I_A的应用领域，提供了与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂联用的新抗肿瘤治疗策略。

为实现上述目的，本发明提供具有式I_A所示的化合物，或其药学上可接受的盐：

以上化合物的合成方法可以从已发表的相关文献和专利中获取。

本发明的进一步目的在于提供式I_A所示的化合物，或其药学上可接受的盐在抗肿瘤领域内的应用。其中所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌、唇癌、食道癌、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、胆囊癌、喉癌、脑瘤、鳞癌、血管瘤、***癌、肠癌、肾癌、骨癌、舌癌、淋巴癌、胰腺癌、膀胱癌、黑素瘤、白血病、皮肤癌、脂肪瘤、***、甲状腺癌、胸腺癌。

本发明生物活性测试结果表明，所提供化合物I_A具有抑制NEDDylation通路的作用，同时代表化合物I_A对肿瘤细胞株的生长具有一定的抑制作用。因此本发明化合物可以用于抗肿瘤药物的开发。

在本发明中，术语“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。

“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过本专业已知的方法制备。

“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。这些盐可通过本专业已知的方法制备。

在本发明中，“药物组合物”是指本发明化合物与本领域通常接受的用于将生物活性化合物输送至哺乳动物(例如人)的介质的制剂。该介质包括药学上可接受的载体。药物组合物的目的是促进生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

本发明所用术语“药学上可接受的”是指不影响本发明化合物的生物活性或性质的物质 (如载体或稀释剂)，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中包含的任意组分相互作用。

在本发明中，“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于任何被相关的政府管理部门许可为可接受供人类或家畜使用的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

本发明所用术语“预防的”、“预防”和“防止”包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性。

本发明所用的术语“治疗”和其它类似的同义词包括以下含义：

(i)预防疾病或病症在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病或病症，但尚未被诊断为已患有该疾病或病症时；

(ii)抑制疾病或病症，即遏制其发展；

(iii)缓解疾病或病症，即，使该疾病或病症的状态消退；或者

(iv)减轻该疾病或病症所造成的症状。

本发明所使用术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本发明公开化合物的组合物的量。可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。

本发明所用术语“服用”、“施用”、“给药”等是指能够将化合物或组合物递送到进行生物作用的所需位点的方法。这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局部给药和经直肠给药。本领域技术人员熟知可用于本发明所述化合物和方法的施用技术，例如在Goodman andGilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,current ed.；Pergamon；andRemington's, Pharmaceutical Sciences(current edition),Mack Publishing Co.,Easton,Pa中讨论的那些。在优选的实施方案中，本发明讨论的化合物和组合物通过口服施用。

本发明所使用术语“药物组合”、“药物联用”、“联合用药”、“施用其它治疗”、“施用其它治疗剂”等是指通过混合或组合不止一种活性成分而获得的药物治疗，其包括活性成分的固定和不固定组合。术语“固定组合”是指以单个实体或单个剂型的形式向患者同时施用至少一种本发明所述的化合物和至少一种协同药剂。术语“不固定组合”是指以单独实体的形式向患者同时施用、合用或以可变的间隔时间顺次施用至少一种本发明所述的化合物和至少一种协同制剂。

附图说明

图1是基于western blotting的细胞内NEDDyaltion抑制试验结果示图(I_A表现出较好的细胞内NEDDylation通路抑制活性)。

图2是体内肿瘤细胞生长抑制实验结果示图(证明I_A和组蛋白去乙酰化抑制剂联用能显著提升体内抗肿瘤活性)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。

1.基于western blotting的细胞内NEDDyaltion抑制试验

(1)实验材料：

人源性肺癌细胞A549，10％牛血清培养基，PBS溶液，胰蛋白酶(sigma)，一抗(anti-cullin1rabbit，abcom公司，2000：1稀释)，二抗(IgG rabbit)，蛋白裂解液，×4SDS-loading。

(2)实验方法：

(i)A549细胞的复苏和传代：将装有A549的细胞冻存液从-80摄氏度冰箱中取出并离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬并转入10cm培养皿，37摄氏度培养箱中孵育24小时。选取生长较好的细胞，吸取培养液，PBS清洗并用胰酶消化，离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬；

(ii)接种细胞：对上述细胞进行计数，按每皿30万个细胞平均分配入各培养皿中，37摄氏度培养箱中孵育过夜；

(iii)加入受试化合物(终浓度100μM)，共孵育6小时；

(iv)孵育完，蛋白定量；

(iv)10％的SDS-PAGE制胶并进行电泳实验；

(v)转膜1小时后，20％牛奶封闭1小时，加入一抗孵育过夜；

(vi)洗膜，并加入二抗孵育1小时。

(3)实验结果：

I_A表现出较好的细胞内NEDDylation通路抑制活性，如图1所示。

2.体外肿瘤细胞增殖实验

采用CCK8评价候选化合物I_A对人源性肿瘤细胞的增殖活性。

(1)实验材料：

人源性肺癌细胞A549，人源性肺癌细胞H1299，人源性肺癌细胞EKVX，人源性肝癌细胞SK-HepG1，人源性肝癌细胞Huh7，人源性肝癌细胞HepG2，人源性乳腺癌细胞T-47D，人源性胃癌细胞MKN45，人源性胃癌细胞MGC803，人源性胃癌细胞PLC。10％牛血清培养基，PBS溶液，胰蛋白酶(sigma)，×10CCK8(sigma)。

(2)实验方法：

(i)A549细胞的复苏和传代：将装有A549的细胞冻存液从-80摄氏度冰箱中取出并离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬并转入10cm培养皿，37摄氏度培养箱中孵育24小时。选取生长较好的细胞，吸取培养液，PBS清洗并用胰酶消化，离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬；

(ii)接种细胞：对上述细胞进行计数，按每孔3000～5000个细胞平均分配入各96孔板中，37摄氏度培养箱中孵育过夜；

(iii)加入不同浓度的受试化合物，共孵育24小时；

(iv)吸取上层清液，每孔加入100μL 10％的CCK8培养液，孵育1小时；

(v)酶标仪在450nm下检测各孔吸光度的变化，并计算IC₅₀值。

(3)实验结果：

CCK8增殖试验结果表明I_A在体外，能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，且增殖抑制活性在48小时时，明显由于阳性药物MLN4924。如下表1所示。

表1

3.体内肿瘤细胞生长抑制实验

体外增殖活性试验结果证明了I_A能够显著抑制多种人源性肿瘤细胞的增殖。鉴于此，本发明又开展了I_A体内肿瘤细胞A549生长抑制实验。

(1)实验材料：

人源性肺癌细胞A549，10％牛血清培养基，PBS溶液，胰蛋白酶(sigma)，4～5周龄bal/bc雌鼠；

(2)实验方法：

(i)A549细胞的复苏和传代：将装有A549的细胞冻存液从-80摄氏度冰箱中取出并离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬并转入10cm培养皿，37摄氏度培养箱中孵育24小时。选取生长较好的细胞，吸取培养液，PBS清洗并用胰酶消化，离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬；

(ii)接种细胞：对上述细胞进行计数，按每皿30万个细胞平均分配入各培养皿中，37摄氏度培养箱中孵育过夜；

(iii)悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集，用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集2～3×10^{^7}细胞，加入100μL的PBS悬浮细胞，混匀，室温保存；

(iv)将上述100μL含肿瘤细胞的PBS移植入小鼠皮下，并观察一周；

(v)确定肿瘤抑制成功后，分别给与不同剂量的I_A(15mg/kg,30mg/kg),I_A和组蛋白去乙酰化抑制剂恩替诺特的联合给药，并设置空白组，MLN4924阳性药组和HDAC抑制剂组。

(3)实验结果：

I_A在30mg/kg的给药剂量下，肿瘤抑制效果明显好于空白组；同时，I_A在30mg/kg的给药剂量下的肿瘤体积及大小和60mg/kg MLN4924没有明显差异，表明I_A在体内不仅具有良好的抗肿瘤效果，且毒副作用较小。同时，本发明又引入了组蛋白去乙酰化抑制剂恩替诺特和I_A的联合给药组，考察通过同时抑制NEDDylation和组蛋白去乙酰化靶点，是否能更高效的抑制肿瘤的体内生长。由实验结果可知，单独使用10mg/kg恩替诺特组或 15mg/kg I_A组虽表现出良好的体内抗肿瘤抑制活性，但仍差于30mg/kg I_A组和60mg/kg MLN492。然而，10mg/kg恩替诺特和15mg/kg I_A组表现出最好体内抗肿瘤活性，不仅强于单独给药组，且明显由于阳性药组MLN4924。证明I_A和组蛋白去乙酰化抑制剂联用能显著提升体内抗肿瘤活性。如图2所示。

4.实验结论

本发明中，发明人报道了具有Neddylation抑制活性的小分子化合物I_A。体内外实验证明了I_A不仅具有较强的体内外Neddylation抑制活性，同时抗肿瘤实验证明了，I_A不仅能够显著抑制多种肿瘤细胞，而且表现出较好的体内抗肿瘤活性。通过和组蛋白去乙酰化抑制剂联用，I_A表现出了更优的抗肿瘤活性，目前暂无资料报告该类药物组合模式。因此本发明提供的化合物可以用于预防和治疗由Neddylation通路引起的相关疾病，尤其是肿瘤相关的疾病，并可用于多药物联用。