阅读说明：本技术 二分支dna四面体纳米结构及其合成方法与应用 (Two-branch DNA tetrahedral nano structure and synthetic method and application thereof ) 是由 郝京诚 王雅静 刘淑雅 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于纳米生物材料领域,涉及二分支DNA四面体纳米结构及其合成方法与应用。通过化学方法合成了两种拓扑结构不同的二分支DNA四面体纳米结构,通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜对两种结构的合成情况进行了验证并对两种结构的稳定性进行了对比探究。琼脂糖凝胶电泳结果和原子力显微镜表征结果表明,我成功构筑出了这两种二分支DNA四面体纳米结构。(The invention belongs to the field of nano biological materials, and relates to a two-branch DNA tetrahedral nano structure and a synthetic method and application thereof. Two kinds of two-branch DNA tetrahedral nano-structures with different topological structures are synthesized by a chemical method, the synthesis conditions of the two kinds of structures are verified by agarose gel electrophoresis and an atomic force microscope, and the stability of the two kinds of structures is contrasted and researched. Agarose gel electrophoresis results and atomic force microscope characterization results show that I successfully constructs the two-branch DNA tetrahedral nano-structures.)

二分支DNA四面体纳米结构及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于纳米生物材料领域，具体涉及两种不同拓扑结构的二分支DNA四面体纳米结构的合成。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA是一种长链聚合物，其基本组成单位为脱氧核苷酸单体。这类脱氧核苷酸单体由共价连接的三部分组成：含氮碱基，脱氧核糖和磷酸骨架。在双链DNA中，两条DNA链反向平行排列，两条反向平行排列的DNA主链上位置相对的碱基彼此相互作用形成沃森克里克氢键，其中，A和T碱基对中有两条氢键，G和C碱基对中有3 条氢键。在正常生理条件下，最常见的双链DNA为B型，右手型的 DNA双螺旋，其双螺旋宽度为2.2-2.6nm，每一螺旋周长度为3.36nm, 每一螺旋周有10.5个碱基对。此外，当外界条件发生改变，如骨架附近的含水量减少时，DNA链的构型也会发生改变，在生物体中较为常见的是比B型DNA更为紧密的右手型DNA双螺旋A型以及左手型的双螺旋Z型DNA。

DNA分子具有良好的可编程性、可预测的稳定性及较易合成和修饰的特性，这使DNA分子成为了一种非常理想的自组装材料。线框型DNA多面体中空的结构非常类似于病毒等自然界已存在的结构，可封装化学小分子、药物分子和其他的功能性材料，具有非常广阔的应用前景。众多研究者探究了DNA四面体在生物医学和材料科学等方面的诸多应用，但是目前应用最广的仍为Turberfield组使用一步法合成的四分支型DNA四面体纳米结构。在四分支型四面体的构筑过程中，需要精确控制四条DNA组分链的化学当量比为1：1：1： 1，实验操作起来有较大的难度。为了探究只使用一条DNA链能否成功构建出一个完成的DNA四面体这一问题，研究人员设计并构筑了一个由一条286个碱基的DNA单链合成的纳米级DNA四面体结构，且这种四面体可以通过体内分子克隆技术复制出来。但是发明人发现：受到DNA链极性的限制，该研究中构建的DNA四面体结构并不紧凑，在四面体的一条边上必然会存在一个平行的DNA双螺旋部分。

发明内容

为了克服上述问题，本发明通过化学方法合成了两种拓扑结构不同的二分支DNA四面体纳米结构，通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜对两种结构的合成情况进行了验证并对两种结构的稳定性进行了对比探究。琼脂糖凝胶电泳结果和原子力显微镜表征结果表明，本发明成功构筑出了这两种二分支DNA四面体纳米结构。同时，通过对DNA四面体进行拓扑分析并结合DNA链的极性，本发明认为结构紧凑的线框型DNA正四面体最少的分支数为二分支。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了二分支DNA四面体纳米结构，所述DNA四面体的每条边均由31个脱氧核苷酸碱基DNA链与其互补序列杂交形成，在四面体的顶点处设计了一个未配对的胸腺嘧啶T。

本发明证实构筑结构紧凑且对称的DNA四面体所需的最少分支数为两分支，有效地简化了DNA四面体的合成步骤。

本发明的第二个方面，提供了二分支DNA四面体纳米结构的制备方法，包括：

设计构成DNA四面体的DNA单链；

将所述DNA单链混合于缓冲液中，进行升温退火处理，得到二分支DNA四面体纳米结构。

本发明的第三个方面，提供了任一上述的二分支DNA四面体纳米结构在生物检测、活体成像、基因载体或药物传送中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过化学方法合成了两种拓扑结构不同的二分支 DNA四面体纳米结构，通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜对两种结构的合成情况进行了验证并对两种结构的稳定性进行了对比探究。琼脂糖凝胶电泳结果和原子力显微镜表征结果表明，本发明成功构筑出了这两种二分支DNA四面体纳米结构，不仅结构紧凑、而且稳定性好。

(2)本发明的方法简单、实用性强，应用前景好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是两种两分支DNA四面体的脱氧核苷酸链的折叠路径图；

图2是本发明实施例1的四分支DNA四面体的凝胶电泳实验结果图；

图3是本发明实施例1的二分支DNA四面体的凝胶电泳实验结果图；

图4是本发明实施例1的四分支和二分支DNA四面体的稳定性测试结果图；

图5是本发明实施例1的DNA四面体2branches A的形貌扫描结果图。

图6是本发明实施例1的DNA四面体2branches B的形貌扫描结果图。

图7是本发明实施例1的四分支DNA四面体的形貌扫描结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

二分支DNA四面体纳米结构，所述DNA四面体的每条边均由 31个脱氧核苷酸碱基DNA链与其互补序列杂交形成，在四面体的顶点处设计了一个未配对的胸腺嘧啶T。

两种两分支DNA四面体的脱氧核苷酸链的折叠路径如图1所示。这两种DNA四面体的每条边均由31个脱氧核苷酸碱基DNA链与其互补序列杂交形成，在四面体的顶点处设计的一个未配对的胸腺嘧啶 T赋予了DNA链足够的折叠灵活度，从而保证四面体的相邻边之间能够形成60°的夹角。退火之后，两条组份链按照预先设定好的路径进行折叠，形成每边均为DNA双螺旋的DNA四面体结构。

本发明使用DNA序列设计软件Uniquimer设计了这两个拓扑结构不同的两分支DNA四面体的序列。

DNA四面体2branches A的序列为：

Stand 1:

ATCGTCTATAGTAAGTTTTTCCTAACGCAGGTTGTTTTCGCG TTACTTTATAGCGGATTTTCATTTGGATCAAATATGAGTAGGTCA CGTATCTATTCGGATCCTAGGCTCAGGATCTGGGTATCCATTAGC ACATTCAATCTCCGTTCAGGGGCTCGGTTGAAAATCCGCTATAA AGTAACGCGAAAACATCACATCTGATCCGACTGTTTGTCTCTCT TCATTAGATACGTGACCTACTCATATTTGATCCAATCCGAGCCCC TGAACGGAGATTGAATGTGCTA

Stand 2:

CCTGCGTTAGGAAAAACTTACTATAGACGATTTGGATACCC AGATCCTGAGCCTAGGATCCGATTGAAGAGAGACAAACAGTCG GATCAGATGTG

DNA四面体2branches B的序列为：

Stand 1:

GGTCGCTGTCGAAAGGCAGTTTCCTAGCAATTTTCGCACGG TGGAGAGTCCGTCTTAACCGCCTTGCCGTCCGACTGGATGTTCA GTTCCTCAAATGCTGTGTAGGTCTGACGCAAAGATCGTACATTA TTGCTAGGAAACTGCCTTTCGACAGCGACCTGGGTTTTGCCCTT GTTCAGGCCATGCAGTCATTTTGAGGAACTGAACATCCAGTCGGACGGCATGGAAGCTCCCATGACCATAGGTGAATAAGCT

Stand 2:

ATGTACGATCTTTGCGTCAGACCTACACAGCTTGACTGCAT GGCCTGAACAAGGGCAAAACCCTAGCTTATTCACCTATGGTCAT GGGAGCTTCCTGGCGGTTAAGACGGACTCTCCACCGTGCGAA

本发明还提供了二分支DNA四面体纳米结构的制备方法，包括：

设计构成DNA四面体的DNA单链；

将所述DNA单链混合于缓冲液中，进行升温退火处理，得到二分支DNA四面体纳米结构。

本申请中对缓冲液的具体类型并不作特殊的限定，在一些实施例中，所述缓冲液为TEM缓冲液，以使DNA能够有效地分散。

随着DNA单链的浓度的提高，反应速率提高，但DNA链浓度过高会增加碱基的错配率，降低特异性。因此，在一些实施例中，各 DNA单链的最终浓度均为0.1μM，以提高反应效率。

在一些实施例中，所述升温退火的具体步骤为：将温度升高至 95℃并保持5分钟，然后使该体系在48小时内缓慢降至室温。退火之后，两条组份链按照预先设定好的路径进行折叠，形成每边均为 DNA双螺旋的DNA四面体结构。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：

本发明在该实验中也构筑了一个由等长的四条寡核苷酸链杂交形成的四分支DNA四面体纳米结构且该四面体的分子量与两个二分支DNA四面体纳米结构的分子量相同。四分支四面体的序列也由 DNA序列设计软件Uniquimer设计。四分支四面体四条组分链的序列如下：

Stand 1:

AAACTACTCCTCGAAGTGATTTGTACCGTCTTGATAGGGCG GGACCCGGGATAGCATATGGGTTTGCCCGGATCGAGACCCCTCA ATTCGGGAGG

Stand 2:

ACCCATATGCTATCCCGGGTCCCGCCCTATCTATTTGCGTGA TCGCATCACTACCAGACGGACTTAAAAGGGGAATCCCTGCCAC GTGAATGCGG

Stand 3:

AGACGGTACAAATCACTTCGAGGAGTAGTTTTTTATTCGGT ATGGTTATGCCTTACGCATGTTTGTCCGTCTGGTAGTGATGCGAT CACGCAAAT

Stand 4:

AACATGCGTAAGGCATAACCATACCGAATAATCCTCCCGAA TTGAGGGGTCTCGATCCGGGCATCCGCATTCACGTGGCAGGGAT TCCCCTTTTA

本发明根据软件设计的序列，从生物公司订制了相应的脱氧核苷酸链，用于合成二分支和四分支DNA四面体纳米结构。在DNA四面体的构建过程中，本发明使用的是升温退火的实验方法。首先，本发明向盛有TEM缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,10mM MgCl₂, pH7.6)的离心管中加入等化学当量比的相应的各DNA组分链，保证各DNA链的最终浓度均为0.1μM。之后，将温度升高至95℃并保持约5分钟，最后将离心管转移至盛有约1.5L水的保温桶中，使该体系在48小时内缓慢降至室温。

表征结果

本发明用2.5％的琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜对二分支和四分支的DNA四面体进行表征。

1.琼脂糖凝胶电泳结果分析

图2是四分支DNA四面体的凝胶电泳实验结果。位于第1泳道的是四分支四面体的Stand 1链，位于第2泳道的是四分支四面体Stand 1链和Stand 2链结合形成的产物，位于第3泳道的是四分支四面体Stand 1链、Stand 2链和Stand 3结合形成的产物，位于第4泳道的是四分支DNA四面体纳米结构，M带为50bpDNAladder。通过该凝胶电泳实验结果，本发明可以初步验证四分支DNA四面体已经被本发明成功构筑出来。

图3是二分支DNA四面体的凝胶电泳实验结果。位于第4、5 泳道的是四分支DNA四面体纳米结构，位于第3泳道的是DNA四面体2branches A，位于第8泳道的是DNA四面体2branches B。位于 1、2和6、7泳道的则分别为DNA四面体2branches A和DNA四面体2branches B的两条组分链，M带为50bpDNAladder。从凝胶电泳图中可以看到，二分支四面体和四分支四面体的泳带位于凝胶电泳图的同一水平位置。通过该凝胶电泳实验结果，本发明可以初步验证二分支DNA四面体已经被本发明成功构筑出来。

图4是四分支和二分支DNA四面体的稳定性测试结果。本发明使用琼脂糖凝胶电泳的方法对二分支和四分支DNA四面体的稳定性进行了对比研究。图4中的四个图分别为将样品放置1天、1周、2 周和3周后的琼脂糖凝胶电泳实验结果。其中，泳道1中为四分支 DNA四面体纳米结构，位于第2泳道的是DNA四面体2branches A，位于第3泳道的是DNA四面体2branches B。通过对比不同阶段的凝胶电泳图，本发明可以看出，本发明所构筑的二分支DNA纳米结构在三个周内的结构稳定性均较好。

2.原子力显微镜表征结果分析

本发明使用原子力显微镜对本发明所构筑的DNA四面体纳米结构进行形貌表征，成像基底为云母片。本发明先用聚赖氨酸对云母片进行修饰，再取适量样品滴加至用赖氨酸修饰的云母基底上，静置一段时间后吹干，然后用原子力显微镜Bruker BioScopeResolve进行形貌扫描。

图5、图6和图7分别为DNA四面体2branches A和DNA四面体2branches B、四分支DNA四面体的形貌扫描结果。从形貌扫描图中可以看出，两种二分支DNA四面体均具有较为规整的粒径，四面体的纵向尺寸均在20nm左右，比本发明的预期尺寸10nm稍大，本发明认为这是由于AFM针尖的展宽效应导致的。在该实验结果中，样品的高度为2nm左右，比DNA链的高度稍高，本发明认为这是由于基底与样品的强作用力和样品的失水引起的。该原子力显微镜成像结果可以很好地证明本发明已经成功合成了两个拓扑结构不同的二分支DNA四面体结构。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 二分支DNA四面体纳米结构及其合成方法与应用

<130> 2020

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcgtctata gtaagttttt cctaacgcag gttgttttcg cgttacttta tagcggattt 60

tcatttggat caaatatgag taggtcacgt atctattcgg atcctaggct caggatctgg 120

gtatccatta gcacattcaa tctccgttca ggggctcggt tgaaaatccg ctataaagta 180

acgcgaaaac atcacatctg atccgactgt ttgtctctct tcattagata cgtgacctac 240

tcatatttga tccaatccga gcccctgaac ggagattgaa tgtgcta 287

<210> 2

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgcgttag gaaaaactta ctatagacga tttggatacc cagatcctga gcctaggatc 60

cgattgaaga gagacaaaca gtcggatcag atgtg 95

<210> 3

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtcgctgtc gaaaggcagt ttcctagcaa ttttcgcacg gtggagagtc cgtcttaacc 60

gccttgccgt ccgactggat gttcagttcc tcaaatgctg tgtaggtctg acgcaaagat 120

cgtacattat tgctaggaaa ctgcctttcg acagcgacct gggttttgcc cttgttcagg 180

ccatgcagtc attttgagga actgaacatc cagtcggacg gcatggaagc tcccatgacc 240

ataggtgaat aagct 255

<210> 4

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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gtgcgaa 127

<210> 5

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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ggtttgcccg gatcgagacc cctcaattcg ggagg 95

<210> 6

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acccatatgc tatcccgggt cccgccctat ctatttgcgt gatcgcatca ctaccagacg 60

gacttaaaag gggaatccct gccacgtgaa tgcgg 95

<210> 7

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agacggtaca aatcacttcg aggagtagtt ttttattcgg tatggttatg ccttacgcat 60

gtttgtccgt ctggtagtga tgcgatcacg caaat 95

<210> 8

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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