阅读说明：本技术 一种液晶弹性体材料、dna生物传感器及其制备方法和病原体检测方法 (Liquid crystal elastomer material, DNA biosensor, preparation method of DNA biosensor and pathogen detection method ) 是由 林金明 李玮玮 林玲 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种液晶弹性体材料、DNA生物传感器及其制备方法和病原体检测方法。液晶弹性体材料,其制备原料包括丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、模板剂、引发剂和表面活性剂水相溶液。采用该液晶弹性体材料制备的DNA生物传感器可以快速、高灵敏、高选择性地检测病原体,不需要进行复杂的生物标记,也无需复杂的检测仪器。(The invention discloses a liquid crystal elastomer material, a DNA biosensor, a preparation method of the DNA biosensor and a pathogen detection method. The preparation raw materials of the liquid crystal elastomer material comprise acrylate liquid crystal polymerization monomers, functional monomers, a template agent, an initiator and a surfactant aqueous phase solution. The DNA biosensor prepared by the liquid crystal elastomer material can quickly, highly sensitively and selectively detect pathogens without complex biomarkers or complex detection instruments.)

一种液晶弹性体材料、DNA生物传感器及其制备方法和病原体 检测方法

技术领域

本发明涉及一种液晶弹性体及其制备方法和应用，一种DNA生物传感器及其制备方法和应用，以及病原体检测方法。

背景技术

基于脱氧核糖核酸(DNA)的生物传感器系统在基因诊断、基因分析、生物分子的快速检测以及病原体特异性检测等领域得到了广泛的应用。为了达到预期的检测速度、灵敏度以及检测限，以往提出的基于DNA的生物传感器使用了多种多样的传感技术，比如荧光、电化学、表面等离子体共振以及表面增强拉曼散射等，

CN105445350A公开了一种基于肽核酸的电化学DNA生物传感器及其制备方法，具体地，其公开了将一段与目标DNA序列互补的肽核酸固定在金电极表面作为捕获探针，与目标DNA序列杂交后，以与目标DNA序列定量结合的氨基二茂铁作为电化学活性标记物，实现对目标DNA序列的检测。

CN110951831A公开了一种基于核酸识别诱导的荧光生物传感器及应用，该传感器基于核酸识别诱导多DNA释放和酶辅助靶循环扩增来实现信号放大策略，以增强检测的灵敏度。同时，该检测中涉及了两种荧光分子强度的变化，能避免检测结果的偶然性，提高检测的准确度。但是需要对DNA信号探针标记荧光基团(Cy3、Cy5)，且存在荧光背景干扰的问题。

CN111175365A公开了一种检测外泌体miRNA的电化学传感器及其制备与应用，其电化学传感器是由T-结构复合物(Ts)、F链和亚甲蓝-DNA纳米片组成。Ts通过一锅法退火组装而成，其由P链、R链、L1链和L2链组成。在T型结构的末端，通过I2和I2*的部分互补设计了两个凸起的碱基(方案1A中的T2)，加入到生物传感系统中，靶标可以与第一个立足点(蓝色区域)结合，并通过立足点介导的链置换反应取代P链，暴露位于L1链中的封闭的立足点(绿色结构域)。随后，F链与暴露的立足点结构域杂交，随着碱基配对的延伸置换目标和R链。然后，移位的靶快速结合到相邻的立足点以触发下一个循环反应，从而导致大量P链的替换。置换的P链与固定在电极表面的捕获探针CP特异性杂交，进一步捕获构建的MB-DNS。在退火形成的DNA纳米片溶液中滴加适当浓度的亚甲蓝溶液，使得亚甲蓝(MB)和DNA纳米片充分结合，得到MB-DNS混合溶液。将MB-DNS混合溶液滴加至电极表面，MB-DNS与P链部分杂交，形成了三层结构复合材料。通过对电化学信号的检测即可获知靶物质的含量。以上详细说明了基于L-TEDCR和MB-DNS标签的无酶、无标记电化学生物传感器检测外泌体miRNA的原理。但是其存在工作电极制备步骤繁琐且工作电极较为复杂以及灵敏度有待进一步提高的问题。

CN110643684A公开了一种黄曲霉毒素产毒基因nor-1的荧光传感器制备和检测方法，荧光传感器为基于特异性识别黄曲霉毒素产毒基因nor-1的长臂发夹探针，在所述长臂发夹探针的两端分别带有NH₂和SH，NH₂修饰上核壳结构的CdTe/CdS量子点，SH修饰上金纳米粒子AuNPs，在没有目标物出现时，CdTe/CdS量子点和AuNPs空间距离靠近，发生荧光共振能量转移，从而导致CdTe/CdS量子点的荧光淬灭，当目标物nor-1出现时，nor-1与发夹探针特异性互补配对，使发夹探针伸直，拉大了CdTe/CdS量子点和AuNPs的距离，阻断了荧光共振能量转移，从而使CdTe/CdS量子点的荧光恢复，通过荧光恢复强度测定nor-1的浓度。但是荧光量子点和金纳米颗粒制备和标记复杂，尤其是同时在单链DNA的两个位点进行标记的困难降低了产率，增加了引入单一标记的杂质的干扰，以及存在不可避免的荧光背景干扰等问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种新的液晶弹性体材料，采用该液晶弹性体材料制备的DNA生物传感器可以快速、高灵敏、高选择性地检测病原体，不需要进行复杂的生物标记，也无需复杂的检测仪器。

本发明第一方面提供了一种液晶弹性体材料，其制备原料包括丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、模板剂、引发剂和表面活性剂水相溶液。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，所述丙烯酸酯液晶聚合单体为双丙烯酸酯主链液晶聚合单体，更优选选自1,4-双[4-(6-丙烯酰氧基己氧基)苯甲酰氧基]-2-甲基苯(RM82)、(4-(((4-(丙烯酰氧基)丁氧基)羰基)氧基)苯甲酸2-甲基-1,4-二苯酚酯(CAS号187585-64-4)和2-甲基-1,4-苯二基二(4-[4-[(1-氧代-2-丙烯基)氧基]丁氧基]苯甲酸酯)中的一种或多种。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，所述功能单体为末端羧基烯烃单体，更优选为7-辛烯酸(7OAc)、6-庚烯酸和8-壬烯酸中的一种或多种。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，所述模板剂为氰基联苯型液晶，优选为液晶E7、液晶7CB、液晶5CB和液晶8CB中的一种或多种。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，所述引发剂选自偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基硫酸钠和聚乙烯醇中的一种或多种。

在本发明中，丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、模板剂、引发剂和表面活性剂均可通过商购获得。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、引发剂和模板剂的摩尔比为1：(15-20)：(0.3-0.8)：(20-25)。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，表面活性剂水相溶液中，表面活性剂浓度为25-35mM。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、引发剂和模板剂的混合物与表面活性剂水相溶液的体积比为1：(25-35)。

根据本发明所述的液晶弹性体材料的一些实施方式，所述液晶弹性体材料的形貌为微球，更优选为尺寸均一的微米级微球，更优选地，微球的直径为2.0-3.5微米。在本发明中，所述液晶弹性体微球尺寸在本发明优选的范围内且均一时，病原体的检测灵敏度更高，检测效果更佳。

本发明第二方面提供了一种液晶弹性体材料的制备方法，包括：

(1)将丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、模板剂和引发剂混合，获得有机向列相；

(2)将所述有机向列相与表面活性剂水相溶液进行微乳液聚合反应。

根据本发明所述的制备方法的一些

具体实施方式

，液晶弹性体材料的制备方法可以包括：

(1)将丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、模板剂和引发剂充分接触混合，于室温下获得有机向列相；

(2)在匀速搅拌的条件下，将所述有机向列相逐滴加入到表面活性剂的水相溶液中，进行热辅助的微乳液聚合反应。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述热辅助是指加热条件下进行。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述微乳液聚合反应的条件包括：温度为45-70℃，时间为5-8h，搅拌速度为100-200rpm。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述丙烯酸酯液晶聚合单体为双丙烯酸酯主链液晶聚合单体，更优选选自1,4-双[4-(6-丙烯酰氧基己氧基)苯甲酰氧基]-2-甲基苯(RM82)、(4-(((4-(丙烯酰氧基)丁氧基)羰基)氧基)苯甲酸2-甲基-1,4-二苯酚酯(CAS号187585-64-4)和2-甲基-1,4-苯二基二(4-[4-[(1-氧代-2-丙烯基)氧基]丁氧基]苯甲酸酯)中的一种或多种。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述功能单体为末端羧基烯烃单体，更优选为7-辛烯酸(7OAc)、6-庚烯酸和8-壬烯酸中的一种或多种。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述模板剂为氰基联苯型液晶，优选为液晶E7、液晶7CB、液晶5CB和液晶8CB中的一种或多种。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述引发剂选自偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基硫酸钠和聚乙烯醇中的一种或多种。

在本发明中，丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、模板剂、引发剂和表面活性剂均可通过商购获得。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、引发剂和模板剂的摩尔比为1：(15-20)：(0.3-0.8)：(20-25)。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，表面活性剂水相溶液中，表面活性剂浓度为25-35mM。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，丙烯酸酯液晶聚合单体、功能单体、引发剂和模板剂的混合物与表面活性剂水相溶液的体积比为1：(25-35)。

根据本发明所述的制备方法的一些实施方式，所述液晶弹性体材料的形貌为微球，更优选为尺寸均一的微米级微球，更优选地，微球的直径为2.0-3.5微米。在本发明中，所述液晶弹性体微球尺寸在本发明优选的范围内且均一时，病原体的检测灵敏度更高，检测效果更佳。

本发明第三方面提供了一种DNA生物传感器，包括液晶弹性体材料和嵌插在所述液晶弹性体材料上的单链DNA探针(ssDNAprobe)，其中，所述液晶弹性体材料为上述的液晶弹性体材料或根据上述的制备方法得到的液晶弹性体材料。

在本发明中，术语“嵌插”是指单链DNA探针一端嵌入液晶弹性体材料，另一端位于液晶弹性体材料外部，例如图1所示。

根据本发明所述的DNA生物传感器的一些实施方式，所述单链DNA探针(ssDNAprobe)为与待测目标病原体的单链DNA序列(ssDNAtarget)互补配对的氨基修饰的单链DNA探针。

根据本发明所述的DNA生物传感器的一些实施方式，单个液晶弹性体(微球)与修饰的单链DNA探针个数的比例可以为但不限于1：10⁶-10⁷。即一个液晶弹性体微球嵌插有10⁶-10⁷个修饰的单链DNA探针。

根据本发明所述的DNA生物传感器的一些实施方式，所述单链DNA探针(ssDNAprobe)通过化学修饰嵌插在液晶弹性体材料上。

本发明第四方面提供了一种DNA生物传感器的制备方法，包括将单链DNA探针嵌插到液晶弹性体材料上，其中，所述液晶弹性体材料为上述的液晶弹性体材料或根据上述的制备方法得到的液晶弹性体材料。

根据本发明所述的DNA生物传感器的制备方法一些实施方式，所述嵌插的方法为化学修饰方法。

根据本发明所述的DNA生物传感器的制备方法一些实施方式，所述化学修饰方法包括：将酰氯基化的液晶弹性体材料与有机酸接触，然后进行EDC/NHS反应，其中EDC/NHS反应是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，EDC/NHS反应可以是本领域常规的反应及操作条件，例如但不限于：将液晶弹性体微球置于24mg的EDC与6mg的NHS形成的3mL水溶液中，室温下反应1h。

根据本发明所述的DNA生物传感器的制备方法一些实施方式，所述有机酸为N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N’,N’-三乙酸。

根据本发明所述的DNA生物传感器的制备方法一些具体实施方式，包括如下步骤：将过量的氯化亚砜(SOCl₂)与上述液晶弹性体材料(重量比大于80:1)在20-30℃下反应12-36h，后通过减压蒸馏去除多余的SOCl₂，得到酰氯基化的液晶弹性体(微球)材料；将过量的有机酸与得到的酰氯基化的液晶弹性体材料(重量比大于10：1)在水相中室温反应8-16h，离心去除多余的有机酸；然后EDC/NHS反应，将氨基修饰的ssDNAprobe化学嵌插到液晶弹性体材料上。

本发明第五方面提供了上述的液晶弹性体材料或根据上述的制备方法得到的液晶弹性体材料或上述的DNA生物传感器或根据上述的制备方法得到的DNA生物传感器在病原体检测中的应用。

本发明第六方面提供了一种病原体的检测方法，包括将待测目标病原体的单链DNA序列引入至DNA生物传感器，所述待测目标病原体单链DNA序列与DNA生物传感器的单链DNA探针互补配对，然后通过检测DNA生物传感器的液晶弹性体材料的光学几何形貌以检测目标病原体，其中，所述DNA生物传感器为上述的DNA生物传感器或根据上述的制备方法得到的DNA生物传感器。

根据本发明所述的检测方法的一些具体实施方式，病原体的检测方法可以包括：将待测目标病原体的单链DNA序列(ssDNAtarget)引入至上述的DNA生物传感器或根据上述的制备方法得到的DNA生物传感器，在适合的电解质溶液中，将所述ssDNAtarget与DNA生物传感器的ssDNAprobe互补配对，然后通过检测DNA生物传感器的液晶弹性体材料的光学几何形貌以检测目标病原体。

根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述待测目标病原体单链DNA序列的获得方法包括依次进行提取待测目标基因的提取、纯化、扩增和解链。

根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，从待测目标病原体中进行待测目标基因的提取与纯化可以通过商用的细菌基因组DNA提取试剂盒或者病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，或者十六烷基三甲基溴化铵方法(CTAB)等。

根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，对待测目标基因基因的扩增和解链的方法可以为本领域常规的方法。例如，扩增的方法可以为PCR(聚合酶链式反应)或者RTPCR(反转录聚合酶链反应，适用于RNA病毒病原体的检测)；解链的方法可以为，在提取、纯化、扩增的双链DNA(dsDNA)溶液中加入甲酰胺或者尿素，95℃下变性约3min，然后迅速转移至冰水中降温或者95℃下变性约30min，然后迅速转移至冰水中降温，得到ssDNAtarget。

根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述为基于液晶弹性体的DNA生物传感器提供的适合的电解质溶液，例如NaCl水溶液(1-5mM，pH＝6.6-6.8)，减弱单链DNA之间的互相排斥，为DNA杂化提供条件。

根据本发明所述的检测方法的一些实施方式，所述病原体为病原微生物；更优选选自细菌、真菌、DNA病毒和RNA病毒中的一种或多种。

本发明的有益效果：

(1)本发明的液晶弹性材料为功能化液晶材料，液晶弹性体上修饰的ssDNAprobe特异性识别响应ssDNAtarget，引起液晶弹性体表面的负电荷密度发生改变，同时DNA杂化过程对交联的液晶分子产生力的作用变化，从而导致液晶分子排列取向的变化，在偏光显微镜下容易观察液晶弹性体的光学几何形貌改变，将待测目标的检测信号转化为可视化的光学信号输出。

(2)基于液晶弹性的生物传感器具有良好的操作和储存稳定性、高灵敏度、高选择性、快速响应和高重复性等优点，而且不需要进行复杂的生物标记，也无需复杂的检测仪器，在生物分析以及临床检测方面具有广阔的应用前景，特别适用于在缺乏实验室操作条件的地方，比如简易护理点、家庭或者检测现场等，进行快速高效的病原体检测。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的病原体的检测方法的原理示意图；

图2为本发明实施例1提供的液晶弹性体材料化学修饰单链DNA探针的过程示意图。

附图标记说明

1-液晶弹性体微球；2-单链DNA探针(ssDNAprobe)；3-负电荷；4-病原体；5-待测目标病原体的单链DNA序列(ssDNAtarget)。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

在本发明中，

1,4-双[4-(6-丙烯酰氧基己氧基)苯甲酰氧基]-2-甲基苯(RM82)购自Ark Pharm公司，CAS号为125248-71-7；

7-辛烯酸购自北京诺倍威科技有限公司，CAS号为18719-24-9；

E7液晶购自上海恒商精密仪器有限公司。

【制备例1】

通过商用细菌基因组DNA提取试剂盒(购买自天根生化科技(北京)有限公司)从病原体大肠杆菌中提取目标基因。将经PCR扩增后的目标dsDNA在95℃下变性约30min，然后迅速转移至冰水中降温，得到ssDNAtarget。

【实施例1】

(1)制备液晶弹性体材料

将聚合单体RM82(0.12mmol)，2mmol的7OAc和7mg的AIBN溶解于700μL(～2.5mmol)的液晶E7中，室温下形成有机向列相；将0.28g的SDS溶解于30mL的去离子水中，形成水相；在油浴58℃，匀速搅拌的条件下(150rpm)，将有机向列相逐滴加入到水相中，发生微乳液聚合反应时长6h；高速离心去上清，无水乙醇洗涤3次，去离子水洗涤3次，制备得到尺寸均一，直径～2μm的液晶弹性体微球。

(2)制备DNA生物传感器

将200mg上述制备的液晶弹性体微球，与10mL的SOCl₂在室温下反应24h，后通过减压蒸馏去除多余的SOCl₂，得到酰氯基化的液晶弹性体微球；然后将酰氯基化的液晶弹性体微球与2.5g的N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N’,N’-三乙酸在水相中室温反应12h，离心洗去多余的N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N’,N’-三乙酸；然后通过EDC/NHS反应(将液晶弹性体微球置于24mg的EDC与6mg的NHS形成的3mL水溶液中，室温下反应1h)，将与待测目标病原体的单链DNA序列(ssDNAtarget)互补配对的氨基修饰的单链DNA探针(ssDNAprobe)稳固地以化学键合的方式嵌插到液晶弹性体微球(图1中标号1)上，即得到基于液晶弹性体材料的DNA生物传感器。液晶弹性体材料上化学修饰ssDNAprobe的过程示意图可以如图2所示。

(3)病原体的检测

通过商用细菌基因组DNA提取试剂盒(购买自天根生化科技北京有限公司)从病原体(图1中标号4)大肠杆菌中提取目标基因，再将经PCR扩增后的目标dsDNA在95℃下变性约30min，然后迅速转移至冰水中降温，得到ssDNAtarget(图1中标号5)。ssDNAtarget与上述DNA生物传感器的ssDNAprobe(图1中标号2)互补配对。将ssDNAtarget引入到基于液晶弹性体材料的DNA生物传感器中，ssDNAprobe特异性识别响应ssDNAtarget，引起液晶弹性体表面的负电荷(图1中标号3)密度发生改变，同时DNA杂化过程对交联的液晶分子产生力的作用变化，从而导致液晶分子排列取向的变化，在偏光显微镜下容易观察到液晶弹性体的光学几何形貌改变，从同心圆构型转变为径向构型。除了定性地识别ssDNAtarget，不同浓度的ssDNAtarget造成响应后液晶弹性体材料的构型变化程度的差异以及达到某一构型状态的时间差异，成为定量检测ssDNAtarget的依据。该基于液晶弹性体材料的DNA生物传感器实现了对目标病原体高灵敏度、高选择性、快速简便的定性和定量检测。

以上所述的仅是本发明的优选实例。应当指出对于本领域的普通技术人员来说，在本发明所提供的技术启示下，作为本领域的公知常识，还可以做出其它等同变型和改进，也应视为本发明的保护范围。