阅读说明：本技术 一种保持脂蛋白相关磷脂酶a2试剂盒稳定的组合物及其制备方法 (Composition for keeping stability of lipoprotein-associated phospholipase A2 kit and preparation method thereof ) 是由 麻玉雯 于 2020-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物,包括：试剂R1和试剂R2,其中,所述试剂R1包括脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂、两性离子缓冲液、表面活性剂1和防腐剂；且所述试剂R2包括：两性离子缓冲液、果糖和包被脂蛋白相关磷脂酶A2的乳胶粒子；本发明所述的组合物,通过在组合物中添加合理配比的、特定的脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由选自表面活性剂、蛋白类物质、氧化类物质组成)以及特定表面活性剂和果糖,能够显著减少在试剂盒使用中外界对Lp-PLA2的影响,保持测试结果的稳定,且本发明的制备工艺简单,利于实施和工业化生产,具有良好的市场应用前景。(The invention provides a composition for keeping a lipoprotein-associated phospholipase A2 kit stable, which comprises: reagent R1 and reagent R2, wherein the reagent R1 comprises a lipoprotein-associated phospholipase A2 structure stabilizer, a zwitterionic buffer, a surfactant 1 and a preservative; and the reagent R2 comprises: a zwitterionic buffer, fructose and latex particles coated with lipoprotein-associated phospholipase A2; the composition provided by the invention has the advantages that the influence of the outside on Lp-PLA2 in the use of the kit can be obviously reduced and the stability of the test result is kept by adding the specific lipoprotein-related phospholipase A2 structure stabilizer (composed of surfactants, protein substances and oxidation substances) and the specific surfactant and fructose in a reasonable ratio into the composition, and the preparation process is simple, is beneficial to implementation and industrial production and has a good market application prospect.)

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物及其制备 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物及其制备方法。

背景技术

脂蛋白磷脂酶A2(1ipoprotein-associated phospholipaseA2，Lp-PLA2)是近年来引起广泛关注的一种与动脉硬化和缺血性心脑血管疾病密切相关的磷脂酶A2超家族、一种新的炎症标记物和一种独立危险因子。它的分子量为45KD，由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节。脂蛋白磷脂酶A2具有促炎症的作用，因此Lp-PLA2从炎症细胞中产生和释放也可以被解读成为一个极佳的前炎症反应指标。Lp-PLA2在血管壁内产生氧化分子，它更易于导致动脉粥样硬化和产生不稳定性斑块。Lp-PLA2水平的升高预示着有斑块形成和破裂的很大危险性，并且不依赖其他脂类和CRP水平。通过检测循环系统中的Lp-PLA2水平，可以独立的预测心脑血管的病发。心脑血管栓塞性疾病测定试剂盒——人血浆脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein phospholipase A2,Lp-PLA2)定量测定试剂盒可以迅速地监控和预测心脑血管栓塞性疾病。人血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)作为心脑血管栓塞的提示性临床检测指标，是拯救病人生命的一个重要的临床新检测。通过检测血液中Lp-PLA2的水平，可以有效了解动脉内粥样硬化斑块的炎症程度，预测人心脑血管栓塞性疾病的发生和发病程度，有利于心脑血管栓塞性疾病的诊断和预防。

目前常用的测定脂蛋白磷脂酶A2蛋白的方法有荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法、上转发光法、胶乳增强免疫比浊法。其中大多数方法都无法准确进行定量测定，只有胶乳增强免疫比浊法可以用于准确定量测定，它的基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，在与相应抗原发生免疫反应后，能够形成聚集颗粒，在一定波长条件下，聚集颗粒形成的浊度与相应抗原有比例关系，因此通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出样本中待检抗原的含量。目前将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体包被到胶乳颗粒上的常用方法是物理吸附法或者随机方向偶联法，这些方法稳定性较差，实际应用中脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)结构易受到外界条件的影响，因此，需要提供稳定Lp-PLA2试剂盒在样本中稳定的组合物，减少外界对Lp-PLA2的影响，保持测试结果的稳定，能真实反应样本中Lp-PLA2的生物活性。

发明内容

为克服现有技术缺陷，本发明提供了以下技术方案：

本发明一方面提供了一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物：包括：试剂R1和试剂R2，其中，所述试剂R1包括脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂、两性离子缓冲液(即Good's缓冲液)、表面活性剂1和防腐剂；所述试剂R2包括：Good's缓冲液、果糖和包被脂蛋白相关磷脂酶A2的乳胶粒子；

进一步的，所述脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂选自表面活性剂2、蛋白类物质、氧化物质中一种或几种；

更进一步的，所述表面活性剂2选自3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(即CHAPS)、直链仲醇聚氧乙烯醚(即TERGITOL 15-S-7)、聚氧乙烯基衍生物(即EMULGEN B-66)、聚氧乙烯烷基酚醚(即Tx-405)中一种或几种；优选的，CHAPS占所述组合物的质量百分比的0.1％～0.5％；优选的，TERGITOL 15-S-7占所述组合物质量百分比的0.1％～0.5％；优选的，EMULGEN B-66占所述组合物质量百分比的0.1％～0.5％；优选的，Tx-405占所述组合物质量百分比的0.1％～0.5％；

更进一步的，所述蛋白类物质为脂蛋白酶、胆固醇酯酶中的一种或几种；优选的，所述组合物中脂蛋白酶浓度为1KU/L～10KU/L；优选的，胆固醇酯酶占所述组合物总体积的1KU/L～10KU/L；

更进一步的，所述氧化物质为胆酸钠、尿素中的一种或几种；优选的，所述组合物中胆酸钠的浓度为1mmol/L～10mmol/L；优选的，所述组合物中尿素的浓度为300mmol/L～2000mmol/L；

进一步的，所述组合物中两性离子缓冲液浓度为25～100mmol/L；进一步优选的，所述两性离子缓冲液由3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(即MOPSO)配制，所述两性离子缓冲液pH为6.5～7.5；

进一步的，所述表面活性剂1选自五肽-59、异辛醇聚氧乙烯醚(即CA-60)中的一种或两种；优选的，五肽-59占所述组合物质量百分比的0.3％～1.0％；优选的，CA-60占所述组合物质量百分比的0.1％～0.6％；

进一步的，所述防腐剂为叠氮钠；更进一步的，所述防腐剂占所述组合物质量百分比的0.5％～5.0％；

进一步的，所述果糖为酰基类聚果糖；更进一步的，所述果糖占所述组合物质量百分比的0.05％～0.5％；

进一步的，所述包被脂蛋白相关磷脂酶A2的乳胶粒子为聚苯乙烯粒子。

本发明的另一方面请求保护上述任一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物的制备方法，包括以下步骤：按比例取上述各组分，将其充分混合均匀后，即得。

有益效果

首先，本发明所述的保持脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)试剂盒稳定的组合物，通过在组合物中添加合理配比的、特定的脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由选自表面活性剂、蛋白类物质、氧化类物质组成)以及特定表面活性剂和果糖，能够显著减少在试剂盒使用中外界对Lp-PLA2的影响，保持测试结果的稳定，能真实反应样本中Lp-PLA2的生物活性，由实施例的实验结果来看，测试结果是十分稳定的；其次，本发明的制备条件以及制备工艺简单，利于实施和工业化生产，能够有效了解动脉内粥样硬化斑块的炎症程度，预测人心脑血管栓塞性疾病的发生和发病程度，有利于心脑血管栓塞性疾病的诊断和预防，具有良好的市场应用前景。

具体实施方式

说明：以下实施例和对比例中的“％”均指占所述保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物的质量百分含量。

实施例1：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(仅含0.1％的CHAPS)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备发方法包括以下步骤：按比例取上述各组分，充分混合均匀后，即得。

实施例2：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(仅含0.5％的CHAPS)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例3

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(仅含0.25％的CHAPS)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例4：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(仅含0.25％的TERGITOL 15-S-7)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例5：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(仅含0.25％EMULGEN B-66)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例6：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(仅含0.25％Tx-405)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例7：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.25％TERGITOL 15-S-7和浓度为5KU/L脂蛋白脂酶组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例8：

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.25％TERGITOL 15-S-7、浓度为5KU/L胆固醇脂肪酶和浓度为5KU/L脂蛋白脂酶组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例9

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.25％TERGITOL 15-S-7和浓度为5mmol/L胆酸钠组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例10

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.25％CHAPS和浓度为尿素500mmol/L组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/LMOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例11

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶以及5mmol/L胆酸钠组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例12

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例13

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.25％CHAPS和浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/LMOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

实施例14

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.2％CHAPS、浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶、5mmol/L胆酸钠以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备方法同实施例1。

对比例1

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/LMOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备发方法包括以下步骤：按比例取上述各组分，充分混合均匀后，即得。

对比例2

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.3％CHAPS、浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶、5mmol/L胆酸钠以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(0.5％的五肽-59)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备发方法包括以下步骤：按比例取上述各组分，充分混合均匀后，即得。

对比例3

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.3％CHAPS、浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶、5mmol/L胆酸钠以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备发方法包括以下步骤：按比例取上述各组分，充分混合均匀后，即得。

对比例4

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.5％CHAPS、浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶、5mmol/L胆酸钠以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/LMOPSO缓冲液，0.1％聚苯乙烯离子以及0.3％酰基聚果糖；其制备发方法包括以下步骤：按比例取上述各组分，充分混合均匀后，即得。

对比例5

一种保持脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒稳定的组合物，包括：试剂R1和试剂R2，其中，R1试剂成分包括：脂蛋白相关磷脂酶A2结构稳定剂(由0.5％CHAPS、浓度为5KU/L脂蛋白脂酶、5KU/L胆固醇脂肪酶、5mmol/L胆酸钠以及1000mmol/L的尿素组成)，pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液，表面活性剂1(由0.5％的五肽-59和0.5％的CA-60组成)以及0.5％叠氮钠；R2试剂成分包括：pH为7.4、浓度为50mmol/L MOPSO缓冲液以及0.1％聚苯乙烯离子；其制备发方法包括以下步骤：按比例取上述各组分，充分混合均匀后，即得。

实验例

对于实施例1～15以及对比例1～5，将其加入到Lp-PLA2检测试剂中，测试Lp-PLA2含量分别为低浓度(10～150ng/ml)、中浓度(150～250ng/ml)及高浓度(250～550ng/ml)的三份临床测试样本，连续监测7天，测定Lp-PLA2检测试剂的稳定性，计算偏差并其将试剂稳定性记录在下表1中：

表1