阅读说明：本技术 一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒及其制备方法 (Matrix metalloproteinase-3 determination kit and preparation method thereof ) 是由 伍卫姣 郑慧铃 黄爱 刘道锦 陈婷 张雪娇 舒芹 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒及其制备方法,所述试剂盒包括试剂R1,所述试剂R1以质量分数计包括如下组分：缓冲液100mmol/L～200mmol/L,防腐剂0.1％～0.2％,无机盐1％～10％,络合剂0.2g/L～0.8g/L,硫脲0.1％～1％,表面活性剂0.2％～1.5％,pH 6.5～7.5；其中,所述表面活性剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的至少一种。该试剂盒准确度高,偏差在10％以内；灵敏度可以达到5ng/mL；精密度高,试剂盒精密度CV值为1.688％～2.257％。(The invention discloses a matrix metalloproteinase-3 determination kit and a preparation method thereof, wherein the kit comprises a reagent R1, and the reagent R1 comprises the following components in parts by mass: 100 mmol/L-200 mmol/L of buffer solution, 0.1-0.2% of preservative, 1-10% of inorganic salt, 0.2-0.8 g/L of complexing agent, 0.1-1% of thiourea, 0.2-1.5% of surfactant and 6.5-7.5 of pH; wherein the surfactant is at least one of sodium cholate, sodium deoxycholate, sodium taurodeoxycholate and sodium chenodeoxycholate. The kit has high accuracy, and the deviation is within 10%; the sensitivity can reach 5 ng/mL; the precision is high, and the precision CV value of the kit is 1.688-2.257%.)

一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)，基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca²⁺、Zn²⁺等金属离子作为辅助因子而得名。其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成：(1)疏水信号肽序列；(2)前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活；(3)催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；(4)富含脯氨酸的铰链区；(5)羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。

将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。基质金属蛋白酶3是基质金属蛋白酶家族的重要成员，MMP-3主要由巨噬细胞、滑膜细胞、成纤维细胞和软骨细胞所分泌，是一种具有广泛作用底物的蛋白酶，它的活性可导致纤维连接素、软骨连接蛋白以及多种胶原酶(包括Ⅳ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ)等蛋白(酶)的分解，被认为是讲解关节软骨最为关键的蛋白酶，它参与组织形态发生、损伤修复、炎症反应等一系列生理、病理过程，并在风湿性关节炎、动脉粥样硬化、乳腺癌等疾病和肿瘤的发生及进展中发挥重要作用。

MMP-3也叫间充质溶解素。多种细胞在被适当的刺激后，都可以表达MMP-3，如成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞、造骨细胞、角质化细胞等等。炎症因子如IL-1、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血小板源生长因子、佛波醇等等都是诱导试剂。而视黄酸、糖皮质激素、***、***与TGF-β都抑制MMP-3的表达。MMP-3又称基质分解素-1，是金属蛋白酶类的主要成员之一，MMP-3在细胞内以前体形式(proMMP23)合成，共含有477个氨基酸，分子量约57kDa。

MMP-3的测定通常采用ELISA方法进行测定，但是ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，不同批次试剂检测结果差异较大，准确度、灵敏度不高。

因此，如何开发一种准确度、灵敏度高的基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，提高试剂的灵敏度，同时具有良好的准确度、线性和精密度性能。

为了实现上述目的，本发明提供了一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1，所述试剂R1以质量分数计包括如下组分：

缓冲液100mmol/L～200mmol/L，防腐剂0.1％～0.2％，无机盐1％～10％，络合剂0.2g/L～0.8g/L，硫脲0.1％～1％，表面活性剂0.2％～1.5％，pH 6.5～7.5；其中，所述表面活性剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的至少一种。

进一步地，所述缓冲液为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种。

进一步地，所述防腐剂为叠氮钠、PC300、CAA中的至少一种。

进一步地，所述无机盐为氯化钠和氯化钾中的至少一种。

进一步地，所述络合剂为EDTA-2Na、二巯基丙醇、二巯基丙烷磺酸钠、巯基乙胺、巯基乙酸、硫脲、氟化氨、8-羟基喹啉、铬酸钾、硫化钠中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括试剂R2，所述试剂R2的成分包括：60nm～120nm，终浓度为0.25％～0.4％聚苯乙烯羧基微球，终浓度为20mM～50mM缓冲液、使用浓度为0.75％～1％的EDC、终浓度为20ml/L～25ml/L的基质金属蛋白酶-3多克隆抗体、封闭剂和R2缓冲液，所述封闭剂为浓度18％～20％BSA与浓度0.8mol/L～1.2mol/L甘氨酸的混合物；所述R2缓冲液包含50mM～100mM缓冲液、4％～6％的保护剂和0.095％～0.1％防腐剂。

进一步地，所述保护剂为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、BSA、甘露醇、乙二醇、丙三醇的至少一种；所述防腐剂为叠氮钠、PC300、CAA中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括不同浓度梯度的基质金属蛋白酶-3校准品。

进一步地，所述基质金属蛋白酶-3校准品包括基质金属蛋白酶-3和基质液，所述基质液包括磷酸盐缓冲液，EDTA二钠或EDTA二钾，枸橼酸钠，肝素钠或肝素锂，尿素，尿酸，海藻糖，BSA，盐类物质，氯化钾中的至少一种。

本发明还提供了一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒的制备方法，采用所述的配方配制而得。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，利用胶乳免疫比浊法测试时，通过添加硫脲0.1％～1％，表面活性剂0.2％～1.5％(胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的至少一种)可以减小基质金属蛋白酶-3与偶联在胶乳微球上的基质金属蛋白酶-3抗体结合的空间位阻，在基质金属蛋白酶-3低含量样本测试中，可大大提高试剂的灵敏度，同时具有良好的准确度、线性和精密度性能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒的校准曲线图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1，所述试剂R1以质量分数计包括如下组分：

缓冲液100mmol/L～200mmol/L，防腐剂0.1％～0.2％，无机盐1％～10％，络合剂0.2g/L～0.8g/L，硫脲0.1％～1％，表面活性剂0.2％～1.5％，pH 6.5～7.5；其中，所述表面活性剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的至少一种。

MMP-3蛋白的结构可分为氨基末端前肽区、氨基末端催化区以及羧基末端结构域3部分。氨基末端前肽区的前部存在着一个由17个氨基酸残基构成的信号序列，能够引导新合成的MMP-3向细胞膜运动。氨基末端催化区由一个铰链区与氨基末端前肽区相连,其结构内含有一个Zn²⁺基序,为整个蛋白酶的活性部位。羧基末端结构域的氨基酸序列与血红素结合蛋白很相似，是MMP-3与底物相结合的部位。其催化区内Zn²⁺与氨基末端一个未配对的半胱氨酸以配位键相结合,无法暴露其催化活性。当这个配位键被破坏时,蛋白酶的前肽区被水解下来,同时蛋白质自身构象也会发生变化，使基质金属蛋白酶-3的蛋白构象展开，而我们利用胶乳免疫比浊法测试时，通过添加硫脲：0.1％～1％，表面活性剂0.2％～1.5％(胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的至少一种)可以减小基质金属蛋白酶-3与偶联在胶乳微球上的基质金属蛋白酶-3抗体结合的空间位阻，在基质金属蛋白酶-3低含量样本测试中，可大大提高试剂的灵敏度，同时具有良好的准确度、线性和精密度性能。

若所述硫脲的质量分数小于0.1％或所述表面活性剂的质量分数小于0.2％，则不足以使MMP-3蛋白构象发生变化，而达不到提高试剂灵敏度的目的；若所述硫脲的质量分数大于1％或所述表面活性剂的质量分数大于1.5％，则会使MMP-3蛋白构象发生严重变化，甚至变性失活，也达不到提高试剂灵敏度的目的。

所述表面活性剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的至少一种的原因为：这四种物质可用于蛋白质的溶解，任一一种与硫脲结合使用，能达到使MMP-3蛋白构象展开，提高试剂灵敏度的目的。

当表面活性剂为胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠中的多种时，它们之间的比例不做限定，总量在0.2％～1.5％即可。

硫脲0.1％～1％，表面活性剂0.2％～1.5％两者结合，使样本中的基质金属蛋白酶-3蛋白构象发生变化，减小了蛋白与偶联在胶乳微球上抗体结合的空间位阻，从而大大提高试剂的灵敏度，同时具有良好的准确度、线性和精密度性能。缺少硫脲，表面活性剂中的任何一种，均不能解决上述技术问题。

作为一种可选的实施方式，所述缓冲液为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种。

作为一种可选的实施方式，所述防腐剂为叠氮钠、PC300、CAA中的至少一种。

作为一种可选的实施方式，所述无机盐为氯化钠和氯化钾中的至少一种。

作为一种可选的实施方式，所述络合剂为EDTA-2Na、二巯基丙醇、二巯基丙烷磺酸钠、巯基乙胺、巯基乙酸、硫脲、氟化氨、8-羟基喹啉、铬酸钾、硫化钠中的至少一种。

作为一种可选的实施方式，所述试剂盒还包括试剂R2，所述试剂R2的成分包括：250nm～350nm，终浓度为0.25％～0.4％聚苯乙烯羧基微球，终浓度为20mM～50mM缓冲液、使用浓度为0.75％～1％的EDC、终浓度为20ml/L～25ml/L的基质金属蛋白酶-3多克隆抗体、封闭剂和R2缓冲液，所述封闭剂为浓度18％～20％BSA与浓度0.8mol/L～1.2mol/L甘氨酸的混合物；所述R2缓冲液包含50mM～100mM缓冲液、4％～6％的保护剂和0.095％～0.1％防腐剂。所述保护剂为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、BSA、甘露醇、乙二醇、丙三醇的至少一种；所述防腐剂为叠氮钠、PC300、CAA中的至少一种。

作为一种可选的实施方式，所述试剂盒还包括不同浓度梯度的基质金属蛋白酶-3校准品。所述基质金属蛋白酶-3校准品包括基质金属蛋白酶-3和基质液，所述基质液包括磷酸盐缓冲液，EDTA二钠或EDTA二钾，枸橼酸钠，肝素钠或肝素锂，尿素，尿酸，海藻糖，BSA，盐类物质，氯化钾中的至少一种。

所述基质金属蛋白酶-3校准品中基质金属蛋白酶-3浓度梯度为：0.0，125.0ng/mL，250.0ng/mL，500.0ng/mL，1000.0ng/mL，2000.0ng/mL。

所述基质金属蛋白酶-3校准品的校准曲线如图1所示。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒的制备方法，采用所述的配方配制而得。

本发明的一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒的检测原理为：

免疫比浊法是可溶性抗原、抗体在液相中特意结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位，本发明采用吸收后的透射光作为计算单位。在抗原过量情况下，与待测样品中相应的Ig发生抗原-抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介质的浊度发生改变，利用分光光度计测量被吸收的量，读数以吸收单位(A)或OD值表示，待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，待测物中的Ig含量可通过标准曲线计算得出。

试剂R1：样本处理液，主要作用是为了稀释样本，同时处理掉样本中的背景干扰，提高检测结果的准确性，本发明对试剂R1进行了优化，在不影响试剂的灵敏度的前提下，能准确有效的提升中低值样本的测定。

试剂R2：核心反应组分，包括包被抗体的胶乳微球颗粒、表面活性剂、防腐剂等常用组分。

校准品\质控品：主要是对试剂进行测试前的质量控制，常为液体或干粉状态。用于获得标准曲线。

本发明的一种基质金属蛋白酶-3测定试剂盒的使用方法为：

将基质金属蛋白酶-3试剂盒，用全自动生化仪进行测试，参数如下，在570nm主波长下，先加入样本2.4ul，再加入120ul试剂1，37℃孵育约5min，加入40ul试剂2，约30s读取吸光度A1，约4min后读取吸光度A2，计算吸光度的差值△A＝A2-A1；使用配套校准品进行多点定标，得到定标曲线并进行线性拟合，则样本浓度(单位ng/mL)可通过其检测的吸光度差值在定标曲线上计算得到。

下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的基质金属蛋白酶-3测定试剂盒的制备方法进行详细说明。

S1、各实施例、各对比例的R2试剂的制备均为：

(1)溶液制备

①活化缓冲液：10-50mmol/L HEPES缓冲液，pH值为6.0-7.0。

②偶联缓冲液：10-50mmol/L HEPES缓冲液，pH值为7.0-8.0。

③活化剂：10mg/ml的EDC，现配现用。

④封闭液：10％-20％BSA。

⑤R2缓冲液：25-50mmol/L HEPES，0.5g/L的EDTA-2Na，5％乙二醇，5％葡萄糖，0.1％PC-300，pH值为7.0-7.5。

(2)胶乳试剂R2的制备

①取粒径为250-350nm的胶乳微球10mL与活化缓冲液按体积比1:2-1:4进行混合后混匀；

②向步骤①中加入2-3mL的10mg/ml的活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20-30min，温度范围：30-37℃；

③用偶联缓冲液把抗体稀释至1mg/mL，向步骤②中加入50-100mL的1mg/ml稀释后的抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2-3h，温度范围：30-37℃；

④向步骤③中加入5-10mL的封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应0.5-1h，温度范围：30-37℃；

⑤向步骤④中加入200-250mL的R2缓冲液，混匀，备用。

S2、各实施例、各对比例的R1试剂的配方如表1所示。

表1

S3、各实施例、各对比例的基质金属蛋白酶-3校准品包括基质金属蛋白酶-3和基质液，所述基质液包括磷酸盐缓冲液，EDTA二钠或EDTA二钾，枸橼酸钠，肝素钠或肝素锂，尿素，尿酸，海藻糖，BSA，盐类物质，氯化钾中的至少一种。

试验例

使用各实施例和各对比例的基质金属蛋白酶-3测定试剂盒进行性能评价：

1、灵敏度评价：测定空白样本、MMP-3浓度为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL的低浓度样本，每个样本测定10次，计算均值、标准差、偏差、变异系数，CV小于10％且偏差小于10％能满足使用需求；结果如表2所示。

表2-实施例1-4以及对比例1-6的灵敏度数据

为方便对比，将表1测5ng/mL样本的均值、偏差、标准差SD、CV数据统计如表3所示。

表3

组别	均值(ng/mL)	偏差(％)	标准差SD(ng/mL)	CV(％)
					对比例1	5.06	1.2	0.272	5.37
对比例2	5.19	3.8	0.251	4.84
					对比例3	5.24	4.8	0.263	5.03
对比例4	5.27	5.4	0.125	2.38
					对比例5	4.18	-16.4	1.704	40.77
对比例6	3.59	-28.2	1.320	36.78
					对比例7	4.36	-12.8	1.029	23.59
对比例8	4.37	-12.6	1.333	30.49
					实施例1	3.72	-25.6	1.188	31.93
实施例2	4.04	-19.2	1.217	30.12
					实施例3	4.23	-15.4	0.906	21.41
实施例4	4.32	-13.6	1.016	23.5

2、准确度评价结果如表4所示。

表4准确度数据

3、线性范围如表5所示。

表5-线性范围数据

4、精密度：取样本测试10次，计算精密度CV，结果如表6所示。

表6-精密度评价数据

由表3-表6的数据可知：

对比例1中，不含牛黄脱氧胆酸钠，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为6.70％和3.99％，精密度CV值为7.008％；

对比例2中，不含硫脲，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为-7.00％和-5.25％，精密度CV值为6.669％；

对比例3中，硫脲的质量分数为0.05％，低于本发明的0.1％～1％的范围，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为0.40％和4.75％，精密度CV值为7.170％；

对比例4中，硫脲的质量分数为2％，高于本发明的0.1％～1％的范围，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为1.20％和3.30％，精密度CV值为6.076％；

对比例5中，牛黄脱氧胆酸钠的质量分数为0.1％，低于本发明的0.2％～1.5％的范围，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为1.90％和5.14％，精密度CV值为7.027％；

对比例6中，牛黄脱氧胆酸钠的质量分数为2％，高于本发明的0.2％～1.5％的范围，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为-2.13％和-6.29％，精密度CV值为6.738％；

对比例7中，含有硫脲，牛黄脱氧胆酸钠更改为常用的表面活性剂吐温，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为-5.17％和-2.14％，精密度CV值为6.688％；

对比例8中，不含硫脲，同时牛黄脱氧胆酸钠更改为常用的表面活性剂吐温，灵敏度达不到15ng/mL，准确度为-9.70％和-4.07％，精密度CV值为6.676％；表明硫脲0.1％～1％与其他的常用的表面活性剂比如吐温没有协同增效作用，对于灵敏度、准确度和精密度无显著地提高。

实施例1-4的试剂盒灵敏度均为5ng/mL，准确度分别为0.57％和0.07％、1.13％和-0.22％、-0.03％和-1.46％、0.73％和0.24％，精密度CV值分别为1.829％、2.257％、2.210％、1.688％，高于对比例1-6。

综上可知，实施例1-4的灵敏度、精密度比对比例1-6好。表明硫脲0.1％～1％，表面活性剂0.2％～1.5％、pH 6～8同时满足要求时，才能达到较高的准确度、灵敏度和精密度。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。