阅读说明：本技术 应用于骨肉瘤细胞成像或治疗的Au DENPs-巨噬细胞复合物 (Au DENPs-macrophage compound applied to imaging or treating osteosarcoma cells ) 是由 王悍 尹芳芳 史向阳 范钰 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种应用于骨肉瘤的细胞成像以及同时细胞治疗的Au DENPs-巨噬细胞复合物的制备方法：以第五代树状大分子为模板,将经马来酰亚胺活化的聚乙二醇单甲醚通过化学键间相互作用连接在G5.NH<Sub>2</Sub>的一端。上述得到的化合物通过物理吸附作用将HAuCl<Sub>4</Sub>整合在一起,再用NaBH<Sub>4</Sub>经过原位还原,最后,通过乙酸酐将树状大分子表面的氨基全部乙酰化以得到最终产生[(Au<Sup>0</Sup>)<Sub>100</Sub>-G5.NHAc-mPEG]DENPs,简称为Au DENPs。将Au DENPs与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞共培养获得Au DENPs-巨噬细胞复合物,可以用于小鼠骨肉瘤的细胞治疗或微环境中的CT成像,在肿瘤诊疗领域具有潜在的应用价值。(The invention discloses a preparation method of an Au DENPs-macrophage compound applied to cell imaging and simultaneous cell therapy of osteosarcoma, which comprises the following steps: taking fifth generation dendrimer as template, and connecting polyethylene glycol monomethyl ether activated by maleimide to G5.NH through chemical bond interaction 2 To one end of (a). The obtained compound is used for adsorbing HAuCl by physical adsorption 4 Integrated together, re-using NaBH 4 After in situ reduction, the amino groups on the surface of the dendrimer are fully acetylated by acetic anhydride to give the final product [ (Au) 0 ) 100 ‑G5.NHAc‑mPEG]DENPs, abbreviated as Au DENPs. Au DENPs and mouse mononuclear macrophage RAW264.7 cells are co-cultured to obtain Au DENPs-macrophage compound, the Au DENPs-macrophage compound can be used for cell therapy of mouse osteosarcoma or CT imaging in microenvironment, and has potential application value in the field of tumor diagnosis and treatment.)

应用于骨肉瘤细胞成像或治疗的Au DENPs-巨噬细胞复合物

技术领域

本发明涉及纳米医学诊疗试剂领域，尤其涉及一种应用于骨肉瘤的细胞成像或细胞治疗的Au DENPs-巨噬细胞复合物及其制备方法。

背景技术

纳米医学正在逐渐改变癌症治疗方法，并为肿瘤的诊治带来新的希望。比如，某些被动靶向或者主动靶向肿瘤的纳米药物递送系统可以实现药物在机体的准确递送，从而避免对正常组织的毒害作用，延长药物在体内的代谢过程，进而增强药物的疗效。

实现肿瘤对于免疫纳米药物的反应成像是设计、开发和应用有效的靶向治疗的关键。为了验证靶标的准确性，必须监测纳米药物在临床相关组织中的分布，最好是使用非侵入性的手段，以确定目标组织的吸收和非目标组织的最低吸收。实现这一目标最直接的方法是对纳米材料进行标记，这样就可以使用成像系统，如MRI(磁共振成像)、CT(计算机断层扫描)在体检测到纳米材料。这样不仅可以确定纳米粒子的生物分布，还可以监测肿瘤对治疗的反应性以及其他相关反应，例如肿瘤的免疫细胞浸润情况。纳米颗粒与周围环境和可能相互作用的细胞类型范围之间可能发生相互作用。例如，纳米颗粒的物理特性可以在免疫抑制，超敏反应，免疫原性和自身免疫方面影响免疫系统。这些相互作用可以导致多种影响，例如改变信号通路，破坏感染细胞的病毒以及细胞内分泌的分子，蛋白质和染色质复合物。此外，纳米粒子可以通过直接或诱导细胞坏死之类的间接作用而刺激先天和适应性免疫应答。

以往癌症纳米医学的研究重点是靶向肿瘤或基质细胞，而将纳米颗粒作为具有抗肿瘤应答作用的有效免疫刺激剂——癌症免疫疗法成为癌症治疗的新方向。与传统疗法相反，癌症免疫疗法通过增强宿主自身的免疫系统来特异性地检测，识别和破坏恶性细胞。纳米粒子具有多种理化特性，可以作为潜在的免疫激活剂。通过合理设计的癌症免疫纳米结构刺激先天和适应性免疫系统对于增强抗肿瘤作用将是重要的。

肿瘤的发生以及进展过程中会重塑宿主的免疫环境，其中某些免疫细胞比如巨噬细胞，在正常机体中起到清除病菌，起到防御功能。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associatedmacrophage，TAM)是肿瘤微环境中的一个关键组成部分，它们大约占据肿瘤重量的50％。在肿瘤发生发展过程中，循环中的巨噬细胞可以被募集到肿瘤微环境中，在肿瘤逃避机体的免疫监视中起到了突出的作用。研究表明，TAM大致可以分为两类：M1型和M2型巨噬细胞，而且受到不同刺激，两种类型之间可以实现转化。其中M1型巨噬细胞可以高度表达CD86、iNOS以及TNF-α等，可以起到抑制肿瘤的作用。而肿瘤组织中的TAM大多表现为M2型，可以促进肿瘤的生长、血管生成、侵袭转移。众多研究表明，肿瘤相关巨噬细胞在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、***癌、胶质母细胞瘤以及骨肉瘤等多种肿瘤进展中起到重要作用。这些证据表明针对TAM是肿瘤治疗的一种可行的策略。这些策略可以分为三类：1)抑制肿瘤招募TAM；2)直接杀伤TAM；3)再教育TAM，使其由M2-促肿瘤表型转变为M1抗肿瘤表型。因此，开发新的纳米药物针对TAM，逆转免疫抑制的肿瘤微环境是一种很有前景的机会。

具有靶向和杀死或再教育肿瘤相关巨噬细胞能力的新型纳米药物的工程设计是癌症免疫治疗的策略，可以诱使富含巨噬细胞有利于肿瘤细胞的肿瘤微环境有效地转变为抗肿瘤的类型。此外，以TAM为靶标的成像纳米结构的发展可用于研究实体瘤中巨噬细胞的含量，反应治疗的疗效以及预后信息，从而更好地诊断和预测癌症。

计算机断层扫描(computed tomography,CT)具有广泛应用性、成本相对较低、骨组织以及肺组织分辨率高等优势，是使用最广泛的癌症筛查成像技术。临床常用CT造影剂多为碘剂小分子，但这类成像剂通常存在循环半衰期短、靶向性差等缺点。而将碘或金(或其他大型原子)构成纳米结构则可以增加其稳定性以及延长其循环时间，加以修饰还可以实现特异性靶向肿瘤部位。应用于肿瘤CT显像的纳米材料包括金纳米棒、树枝状分子、含碘脂质体以及氧化镧纳米粒等。金元素具有比碘更高的X射线吸收系数。此外，在金纳米颗粒表面上负载聚乙二醇(PEG)可以延长金纳米粒子在血液中的循环时间。

在CT成像领域，通过靶向GD2抗体的金纳米颗粒可增强CT对比度并刺激自然杀伤细胞攻击神经母细胞瘤和黑色素瘤(Jiao P F,et al.J Mater Chem B.2016；4(3):513–520)。在另一个使用携带人黑色素瘤异种移植物的小鼠的黑色素瘤模型中，涉及被转导表达黑色素瘤特异性T细胞受体的T细胞的全身CT成像有效地表征了T细胞的分布，迁移和动力学(Meir R,et al.ACS Nano.2015；9(6):6363–6372.)。最近的一项研究表明，FDA批准的铁缺乏症患者可成功使用阿魏酸(氧化铁纳米颗粒)来诱导TAM从免疫抑制类型转变为促炎表型，具有抗肿瘤和减少肿瘤转移的功能(Zanganeh,S,et al.Nature Nanotech 2016；11,986–994)。

在之前的工作中，出于功能和结构成像的目的，已经设计了树状聚合物包裹的AuNPs(Au DENPs)并对其表面进行了功能化，用于CT/MR双模态成像以及用于CT成像引导的化学疗法等。Au DENPs的主要优点是：1)每个树枝状聚合物中都可以包埋少于5nm的Au；2)树状聚合物***可以进一步功能化以实现不同的成像和治疗功能。然而，目前，尚无关于将AuDENP用于巨噬细胞极化和跟踪用于细胞治疗应用的报道。

在目前的研究中，我们利用小鼠巨噬细胞吞噬Au DENPs并进一步向M1型巨噬细胞分化，从而可以实现对肿瘤进行细胞免疫治疗的同时完成对巨噬细胞的CT成像。

检索国内外有关利用金纳米粒子工程改造巨噬细胞用于肿瘤治疗方面的文献和专利结果发现：在本发明完成之前，还没有发现基于Au DENPs的巨噬细胞极化应用于骨肉瘤的细胞成像以及细胞治疗研究方面的报道。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于Au DENPs的巨噬细胞极化并应用于骨肉瘤的细胞成像以及细胞治疗的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何利用Au DENPs-巨噬细胞复合物对骨肉瘤进行CT成像并且同时进行细胞治疗。

为实现上述目的，本发明提供了一种应用于骨肉瘤的CT成像以及细胞治疗的AuDENPs-巨噬细胞复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取G5聚酰胺-胺树状大分子加入溶剂中，得到含有G5聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为3～4mmol/L，然后加入11.8～12.5mg/mL的mPEG-MAL，搅拌反应3d，得到G5.NH₂-mPEG溶液；

具体的，含有G5聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为4mmol/L，mPEG-MAL的浓度为12.3mg/mL。

(2)用水稀释G5.NH₂-mPEG溶液，并加入HAuCl₄溶液，剧烈搅拌，获得金/树状大分子混合物，所述HAuCl₄溶液与G5.NH₂-mPEG的摩尔比为100；

具体的，稀释G5.NH2-mPEG溶液体积为40mL。

(3)将上述溶液剧烈搅拌30min后，加入24～30mg/mLNaBH₄溶液，继续搅拌2h得到[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENP；

具体的，NaBH4的浓度为29mg/mL。

(4)在磁力搅拌下，将三乙胺加入[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENP中，继续搅拌30min后，加入乙酸酐，反应24h；

具体的，三乙胺浓度为730.38μg/μL，乙酰酐的浓度为1078.125μg/μL。

(5)将上述混合溶液透析3d以除去过量的反应物，冻干，获得最终产物——AuDENPs；

具体的，透析的溶液为PBS缓冲液和水。

(6)使用含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养基培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞，将Au DENPs加入培养基中，培养12-48h，得到Au DENPs-巨噬细胞复合物。

具体的，培养时间为24h，Au DENPs的定量标准为[Au]为200μM。

进一步的，还包括：

步骤(7)利用LPS作为阳性对照，进一步使用包括流式、PCR、免疫荧光、ELISA的技术检测Au DENPs-巨噬细胞复合物中M1型巨噬细胞的标志物，判断其极化状态；

具体的，LPS的浓度为10ng/mL，被检测的M1型巨噬细胞的标志物包括CD86、TNF-α、iNOS。

步骤(8)将Au DENPs-巨噬细胞复合物与小鼠骨肉瘤K7细胞共同孵育，使用包括流式、免疫荧光、WesternBlot的技术检测小鼠骨肉瘤K7细胞的凋亡情况。

具体的，用于判断K7细胞凋亡的指标为Annexin V-FITC/PI或Caspase 3蛋白。

本发明还提供一种应用于骨肉瘤的细胞成像以及细胞治疗的Au DENPs-巨噬细胞复合物，其特征在于，Au DENPs-巨噬细胞复合物中的Au DENPs内化在巨噬细胞内而非粘附于巨噬细胞表面，Au DENPs-巨噬细胞复合物表达M1型巨噬细胞标志物，M1型巨噬细胞标志物为CD86、TNF-α和iNOS，Au DENPs-巨噬细胞复合物被设置为由上述的制备方法制备而得。

进一步的，Au DENPs中的金纳米颗粒尺寸为1～6nm，所述Au DENPs的水合粒径平均值在142.3～142.6nm。

本发明一方面提供Au DENPs-巨噬细胞复合物在制备用于靶向骨肉瘤CT造影剂中的应用。

本发明另一方面提供Au DENPs-巨噬细胞复合物在制备用于靶向骨肉瘤CT造影剂以及同时治疗骨肉瘤药物中的应用。

本发明还提供Au DENPs-巨噬细胞复合物联用抗肿瘤药物在制备骨肉瘤药物中的应用。

使用NMR(核磁共振)、UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、DLS、CCK-8、CT成像设备、ICP-AES、光镜、流式、免疫荧光、WesternBlot(蛋白印迹)、ELISA(酶联免疫吸附实验)表征本发明获得的Au DENPs-巨噬细胞复合物的结果分别如下：

(1)NMR测试结果

¹H NMR图谱表明树状大分子表面基团的类型以及数量。参照说明书附图2。表明了mPEG已被成功的修饰在G5.NH₂树状大分子的表面上，对末端氨基的乙酰化也没有产生影响。

(2)UV-Vis测试结果

UV-Vis测试结果表明：本发明中制备得到的纳米颗粒在520nm左右出现了明显的吸收峰。参照说明书附图3。

(3)TEM测试结果

TEM测试结果显示了金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布。参照说明书附图4。金纳米颗粒的尺寸为1～6nm，表现出良好的单分散性。

TEM也同样用来显示金纳米颗粒在亚细胞分室中的分布。参照说明书附图5。图5B清楚地说明在用Au DENPs培养后，在细胞的细胞质中可以发现较多的电子染色颗粒。而图5A中显示未经Au DENPs培养的RAW264.7细胞质中没有发现电子染色颗粒，与图5B形成强烈对比。TEM证实了Au DENPs内化在细胞内而非粘附于细胞表面。

(4)DLS测试结果

DLS结果显示Au DENPs的水合粒径的尺寸分布，参照表1，水合粒径平均值在142.6nm左右，表明Au DENPs具有较好的水溶性。

(5)细胞毒性试验结果

细胞毒性试验结果表明在0-400μM范围内，该纳米颗粒没有对RAW264.7细胞活力造成影响，没有表现出明显的细胞毒性。参照说明书附图6。

(5)ICP测量细胞摄取结果

用ICP-AES计算小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞摄取Au DENPs的数量。参照说明书附图7，可以看到，随着[Au]的增加，测得RAW264.7细胞中金纳米粒子的量随之线性增加，当[Au]达到200μM时，细胞摄取量可以达到10pg/cell。

(6)流式检测Au DENPs-巨噬细胞复合物表达CD86的结果

使用流式检测Au DENPs-巨噬细胞复合物表达CD11b⁺CD86⁺的情况，参照说明书附图8。可以看出，相比较阴性对照Blank组中双阳性细胞比例为7.82％，阳性对照LPS(脂多糖)组中双阳性细胞比例为31.3％，Au DENPs组，即Au DENPs-巨噬细胞复合物中双阳性比例为41.2％(p＜0.05)。说明Au DENPs-巨噬细胞复合物高度表达M1型巨噬细胞的标志物CD86。

(7)ELISA检测Au DENPs-巨噬细胞复合物表达TNF-α的结果

使用酶联免疫吸附实验ELISA检测TNF-α的情况，参照说明书附图9。可以看出，AuDENPs-巨噬细胞复合物分泌TNF-α的量与LPS相当，远远高于Blank组(p＜0.01)。说明AuDENPs-巨噬细胞复合物高度表达M1型巨噬细胞标志物TNF-α。

(8)免疫荧光检测Au DENPs-巨噬细胞复合物表达iNOS的结果

使用免疫荧光检测TNF-α的情况，参照说明书附图10。可以看出，Au DENPs-巨噬细胞复合物表达iNOS的量与LPS相当，而Blank组几乎看不到iNOS蛋白的表达。说明Au DENPs-巨噬细胞复合物高度表达M1型巨噬细胞标志物iNOS。

(9)流式检测Au DENPs-巨噬细胞复合物对小鼠骨肉瘤K7细胞凋亡的影响的结果

在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，而在凋亡的早期，PS可以从细胞膜的内侧外翻到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜连蛋白V(Annexin V)是一种钙离子依赖的磷脂型结合蛋白，能够与PS高亲和力特异性结合。因此，可以使用流式检测细胞的情况，参照说明书附图11。可以看出，在对照组中几乎检测不到凋亡；单独巨噬细胞组凋亡率为9％，低于10％；LPS+巨噬细胞组中凋亡率为14.38％；而Au DENPs组中的K7细胞凋亡率明显增加，多达29.5％。由此可见，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以促进K7细胞凋亡。

(10)流式检测Au DENPs-巨噬细胞复合物对小鼠骨肉瘤K7细胞表达Caspase 3的表达结果

Caspase 3在细胞凋亡中起到了关键性作用，属于凋亡的效应子，它被激活后可以使得细胞发生一些生化反应，还可以使得细胞的形态发生改变，最终导致细胞的凋亡。所以，我们选择使用免疫荧光与免疫蛋白印迹进一步检测与各种巨噬细胞共同孵育后K7细胞中活化型Caspase 3的表达情况，参照说明书附图12和附图13。可以看出Control组与单独巨噬细胞组未见明显的Caspase 3的表达，而LPS+巨噬细胞组与Au DENPs-巨噬细胞复合物组中可以检测到蛋白的表达，其中，Au DENPs-巨噬细胞复合物组中Caspase 3的表达量较LPS+巨噬细胞组的高。结合上述研究结果，可以看出，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以促进K7细胞的凋亡。

(11)体外Au DENPs、Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT成像结果

体外Au DENPs的CT成像结果见附图14。分别对不同的Au DENPs浓度(7.5，15，30，60和80mM)进行CT成像。结果显示随着Au DENPs浓度的增加，其CT图像亮度(图14A)及信号强度(CT的信号强度为CT值，图14B)呈线性增加。

体外Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT成像结果参照说明书附图15。将不同浓度的Au DENPs与巨噬细胞共同孵育后，制备细胞悬液，对其进行CT成像。可以看到，随着[Au]的增加，Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT值呈线性增加。结合以上结果说明，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以用于CT成像。

(12)体内Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT成像结果

图16显示了静脉注射Au DENPs-巨噬细胞复合物前后小鼠骨肉瘤的CT成像(图16A和图16B)。相比于注射前，随着时间的推移，肿瘤部位的CT值逐步增加，直到注射后4h，肿瘤部位仍保持着较高的信号值。结果说明，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以随循环到达肿瘤部位，并可以实现对肿瘤的CT成像。

(13)体内Au DENPs-巨噬细胞复合物的抗肿瘤效果

图17-22显示，Au DENPs-巨噬细胞复合物对骨肉瘤具有一定的治疗效果，AuDENPs-巨噬细胞复合物与DOX联合使用的治疗效果优于单独化疗组，说明Au DENPs-巨噬细胞复合物还可以进一步增强DOX对于骨肉瘤的治疗作用。

技术效果

(1)本发明的制备过程温和，简单易行；

(2)本发明方法制备的金纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性；

(3)本发明制备得到的Au DENPs-巨噬细胞复合物具有良好的抗肿瘤以及CT成像效果，为肿瘤的诊治以及癌症免疫疗法提供了新思路。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的Au DENPs的原理图；

图2是本发明的一个较佳实施例的Au DENPs的¹H NMR谱图；

图3是本发明的一个较佳实施例的Au DENPs的UV-Vis图谱；

图4是本发明的一个较佳实施例的Au DENPs的TEM图片(a)，以及相应的尺寸分布直方图(b)；

图5是本发明的一个较佳实施例的正常小鼠单核巨噬细胞的电镜图(A)以及本发明制备的Au DENPs-巨噬细胞复合物的生物电镜图(B)，白色箭头代表被巨噬细胞吞噬的AuDNENPs；

图6是本发明的一个较佳实施例的本发明制备的Au DENPs在不同浓度下(0，1，5，10，25，50，75，100，200和400μM)与RAW264.7细胞共培养后的CCK-8结果；

图7为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs在不同浓度下(0，25，50，75，100和200μM)与RAW264.7细胞共培养后，细胞对金纳米粒子的摄取量；

图8为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs-巨噬细胞复合物以及各对照组表达CD86的流式检测结果；

图9为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs-巨噬细胞复合物以及各对照组表达TNF-α的ELISA检测结果；

图10为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs-巨噬细胞复合物以及各对照组表达iNOS的免疫荧光检测结果；

图11为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs-巨噬细胞复合物以及各对照组对K7细胞凋亡的流式检测结果；

图12为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs-巨噬细胞复合物以及各对照组对K7细胞凋亡蛋白Caspase 3表达的免疫荧光检测结果；

图13为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs-巨噬细胞复合物以及各对照组对K7细胞凋亡蛋白Caspase 3表达的WB检测结果。A为蛋白印迹检测条带，B为各组细胞蛋白表达的统计分析结果；

图14为本发明的一个较佳实施例的不同浓度(7.5，15，30，60，80mM)Au DENPs的CT成像图(A)以及CT值(B)；

图15为本发明的一个较佳实施例的不同浓度(25，50，75，100，200μM)Au DENPs与巨噬细胞共同孵育后得到的Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT成像图(A)以及CT值(B)；

图16为本发明的一个较佳实施例的Au DENPs以及Au DENPs-巨噬细胞复合物在小鼠骨肉瘤原位模型中的CT成像图(A、B)以及CT值(C)；

图17为本发明的一个较佳实施例的不同浓度的DOX单独或者与Au DENPs-巨噬细胞复合物与K7细胞共同孵育后，采用CCK-8测得的K7细胞的存活率结果；

图18为本发明的一个较佳实施例的不同治疗组别的小鼠治疗期间膝盖体积变化结果；

图19为本发明的一个较佳实施例的不同治疗组别的小鼠治疗期间体重的变化结果；

图20为本发明的一个较佳实施例的不同治疗组别的小鼠肿瘤部位病理H&E检测以及TUNEL荧光检测结果；

图21为本发明的一个较佳实施例的不同治疗组别的小鼠血清TNF-α的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果；

图22为本发明的一个较佳实施例的不同治疗组别的小鼠的内脏H&E染色结果。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本文述及的“G5聚酰胺-胺树状大分子”指第五代聚酰胺-胺树状大分子。

实施例1

首先，按照之前课题组的研究，将第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH₂)40mg，溶于5mL氘代水中获得溶液。磁力搅拌下，将含有61.5mg mPEG-MAL的溶液逐滴加入上述溶液体中。强磁力搅拌3天，以完成反应，得到G5.NH₂-mPEG溶液。然后，将溶液稀释到40mL，强磁力搅拌下加入与G5.NH₂-mPEG摩尔比为100的HAuCl₄溶液。反应30min后，加入冰的含有29mgNaBH₄的1mL溶液，继续搅拌2h以完成反应，得到[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENPs。

然后，将[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENPs进一步乙酰化以中和树状聚合物末端的氨基。在磁力搅拌下，将含有85.6mg三乙胺的117.2μL溶液加入[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENPs溶液中。反应10min后，在搅拌下将乙酸酐(69mg，64μL)添加到Au DENPs/三乙胺混合物溶液中，并使混合物反应24h。然后将反应混合物通过切割分子量为5000的膜在PBS缓冲液(4L)和水(4L)中充分透析3天，以除去过量的反应物，然后冻干以获得最终产物[(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG]DENPs(简称为Au DENP)。

¹H NMR图谱(附图2)证明了-COCH₃已被成功的修饰在mPEG-G5.NH₂树状大分子的表面上。紫外图谱中520nm的吸收峰为金纳米颗粒的吸收峰(附图3)。

TEM的测试结果表明，制备的Au DENPs的颗粒尺寸分布为1～6nm(附图4)，未出现团聚现象。DLS结果显示Au DENPs的水合粒径大约在142.6nm，多分散指数为0.698，表面电荷为6.44±0.2mV(见表1)，表明Au DENPs具有良好的单分散性以及较好的水溶性。

表1 Au DENPs的流体动力学尺寸以及表面电荷

实施例2

使用含有10％胎牛血清的DMEM培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞。按照3×10⁵的密度接种于6孔板中，在37℃，含有5％CO₂的细胞培养箱中培养24h。把含有金浓度为200μM的Au DENPs加入RAW264.7培养液中培养24h。然后丢弃培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞，用胰酶消化细胞，离心，然后再用PBS缓冲液冲洗3次。然后用1％的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PBS(pH 7.4)室温(20℃)固定2h，0.1M磷酸缓冲液PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15min。将待测物依次放入50％酒精-70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-100％丙酮-100％丙酮上行脱水，每次15min。再使用丙酮︰812包埋剂＝1︰1，2-4h，丙酮︰812包埋剂＝1︰2渗透过夜，纯812包埋剂5-8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品***包埋板后37℃烤箱过夜。然后，60℃烤箱聚合48h。使用超薄切片机切片60—80nm超薄切片。使用铀铅双染色(2％醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，切片室温干燥过夜。最后，透射电子显微镜下观察。

用TEM显示纳米颗粒在亚细胞器中的分布(附图5)。图5B清楚地显示与Au DENPs共培养后，细胞的亚细胞器中可以发现纳米粒子的染色颗粒。图5A中显示未与Au DENPs共培养的RAW264.7细胞的亚细胞器中没有发现电子染色颗粒。TEM证实了Au DENPs内化在细胞内而非粘附于细胞表面。

实施例3

按照1×10⁴细胞/孔的密度将培养好的RAW264.7细胞种于96孔板中，在细胞培养箱中培养24h。用PBS冲洗3次，然后加入不同浓度的Au DENPs([Au]＝0，1，5，10，25，50，75，100，200，400μM)，每组6个复孔，继续培养24h。随后，丢弃培养基，用PBS冲洗细胞3次，并把90μL新鲜的DMEM培养基和10μL CCK-8溶液加入每个孔中，在细胞培养箱中继续培养2h。然后，使用酶标仪检测450nm处的吸光度值。

CCK-8测试结果如附图6显示，在实验浓度范围内(0-400μM)，Au DENPs对RAW264.7细胞不表现出细胞毒性，显示良好的细胞相容性。

实施例4

按照3×10⁵细胞/孔的密度将培养好的RAW264.7细胞种于6孔板中，培养24h，然后加入金浓度分别为0，25，50，75，100，200μM的Au DENPs，与细胞共培养24h。经PBS冲洗3次后，将细胞胰蛋白酶化，离心收集，再经王水分解。每个实验一式三份。用ICP-AES量化细胞对纳米探针的摄取(附图7)。结果表明，随着金浓度的增加，细胞摄取金纳米颗粒的量呈现随之线性增加。当金浓度达到200μM时，细胞摄取量可以达到10pg/cell。

实施例5

将RAW264.7细胞按照每孔1×10⁵/mL的密度种植于六孔板中，培养24h，弃掉培养液，换新鲜培养液，并加入Au DENPs([Au]＝200μM)、LPS(10ng/ml)，空白组作为对照，继续培养24h。培养好的细胞，弃去上清，PBS洗涤细胞3次，使用预冷的PBS消化细胞，收集细胞悬液于EP管中，1000rpm，室温离心3min；弃去上清，每个EP管中加入90μL流式缓冲液(5％FBS+95％PBS)以及5μL Anti-mouse CD86和5μL Anti-mouse CD11b，空白组不添加任何抗体，同型对照组加入Anti-mouse CD86的同型对照，用100μL移液器轻轻混匀，室温下避光孵育15-20min。结果如附图8所示，Blank组中CD11b⁺CD86⁺双阳性的细胞比例为7.82％，LPS组与AuDENPs中双阳性比例分别为31.3％、41.2％，可知LPS与Au DENPs组中双阳性比例细胞明显增加，说明两者均成功诱导巨噬细胞的M1型分化，Au DENPs比LPS诱导M1型巨噬细胞分化效果稍明显一些。

实施例6

将RAW264.7细胞按照每孔1×10⁵/mL的密度种植于六孔板中，培养24h，弃掉培养液，换新鲜培养液，并加入Au DENPs([Au]＝200μM)、LP(10ng/mL)，空白组作为对照，继续培养24h。ELISA检测Au DENPs、LPS以及PBS孵育RAW264.7细胞24h后的上清液中TNF-α的含量，结果如附图9所示，相比Blank组，Au DENPs组以及LPS组中TNF-α的表达量明显增加(p＜0.001)。可知LPS与Au DENPs组中TNF-α表达量明显增加，说明两者均成功诱导巨噬细胞的M1型分化。

实施例7

将RAW264.7细胞按照每孔1×10⁵/mL的密度种植于六孔板中，培养24h，弃掉培养液，换新鲜培养液，并加入Au DENPs([Au]＝200μM)、LPS(10ng/mL)，空白组作为对照，继续培养24h。使用免疫荧光检测各细胞表达iNOS的量，结果见附图10。与Blank组相比，LPS组与Au DENPs组中iNOS蛋白表达均有明显增加，尤其是Au DENPs组蛋白量表达比LPS组多。可知LPS与Au DENPs组中iNOS表达量明显增加，说明两者均成功诱导巨噬细胞的M1型分化。

实施例8

将RAW264.7细胞按照每孔1×10⁵/mL的密度种植于六孔板中，培养24h，弃掉培养液，换新鲜培养液，并加入Au DENPs([Au]＝200μM)、LPS(10ng/ml)，空白组作为对照，继续培养24h。将不同处理组的巨噬细胞与K7细胞共培养24h后，收集K7细胞培养液上清；使用不含EDTA的胰酶消化细胞，用培养液终止消化；室温下，1000rpm离心3min，使用不含P、Mg²⁺的PBS(dPBS)洗涤细胞；将凋亡试剂盒中的Binding buffer(10x)使用双蒸水稀释10倍；弃去Dpbs，每个样品用300μl的binding buffer(1x)重悬细胞；设置FITC与PI单独染色组以及一组不添加任何荧光染剂组(单染组用于调节补偿，不染组用于调节电压)，从每组中各取100μl细胞悬液到新的EP管中；FITC与PI标记的燃料分别加入单独染色组以及各处理组，不染色组不加任何染料，室温下避光孵育20min；向各个EP管中加入400μL的1x Bindingbuffer，重悬细胞，上机检测。结果如附图11：可以看到，在对照组中几乎检测不到凋亡；单独巨噬细胞组凋亡率为9％，低于10％；LPS+Macs组中凋亡率为14.38％；而Au DENPs组中的K7细胞凋亡率明显增加，多达29.5％。由此可见，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以促进K7细胞凋亡。

实施例9

Caspase 3在细胞凋亡中起到了关键性作用，属于凋亡的效应子，它被激活后可以使得细胞发生一些生化反应，还可以使得细胞的形态发生改变，最终导致细胞的凋亡。所以，我们选择使用免疫荧光与免疫蛋白印迹进一步检测与各种巨噬细胞共同孵育后K7细胞中活化型Caspase 3的表达情况。将RAW264.7细胞按照每孔1×10⁵/mL的密度种植于六孔板中，培养24h，弃掉培养液，换新鲜培养液，并加入Au DENPs([Au]＝200μM)、LPS(10ng/mL)，空白组作为对照，继续培养24h。将不同处理组的巨噬细胞与K7细胞共培养24h后使用免疫荧光与蛋白印迹检测各组巨噬细胞对骨肉瘤细胞凋亡的影响，结果如附图12和附图13所示，可以看出Control组与巨噬细胞组未见明显的Caspase 3的表达，而LPS+巨噬细胞组与Au DENPs-巨噬细胞复合物组中可以检测到蛋白的表达，其中，Au DENPs-巨噬细胞复合物组中Caspase 3的表达量较LPS+巨噬细胞组的高。结合上述研究结果，可以看出，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以促进K7细胞的凋亡。

实施例10

将不同浓度([Au]＝7.5，15，30，60，80mM)的Au DENPs装在EP管中，使用120KV，层厚为0.625mm的条件对其进行CT成像。结果如附图14。可以看到，随着金纳米粒子浓度的增加，Au DENPs的CT图像亮度也在增加，CT值呈现出线性增加。以上结果说明，Au DENPs具有良好的CT成像效果。

实施例11

将RAW264.7细胞与不同浓度([Au]＝25，50，75，100，200μM)的Au DENPs共培养24h。之后用PBS冲洗3次，将细胞胰蛋白酶化，离心，并再悬浮在1.5mL的EP试管中。使用与实施例10同样的扫描条件进行CT成像。结果见附图15。可以看到随着[Au]增加，Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT图像亮度在增加，当[Au]达到200μM时，Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT值可以达到85HU，表明Au DENPs-巨噬细胞复合物可以用于CT成像。

实施例12

使用Balb/C小鼠建立小鼠骨肉瘤原位动物模型，用于Au DENPs-巨噬细胞复合物的CT成像。小鼠骨肉瘤K7细胞培养于37℃、5％CO₂的培养箱中，选取对数生长期的细胞，弃去培养液，PBS冲洗3遍，离心获得细胞沉淀，加入适量PBS调整细胞密度为1×10⁸/mL。酒精棉球擦拭小鼠膝关节并使其保持屈膝状态，使用微量注射器吸取细胞悬液，从胫骨平台处刺入胫骨骨髓腔内，每只小鼠注射10μL细胞悬液，轻柔缓慢完成注射。2周后，可见小鼠膝盖部位肿瘤的形成。分成两组，一组注射Au DENPs([Au]＝200μM)，另一组注射Au DENPs-巨噬细胞复合物。获取与Au DENPs([Au]＝200μM)后经尾静脉注射Au DENPs-巨噬细胞复合物(200μL PBS稀释的细胞悬液)后，获取不同时间点的图像并测量肿瘤部位的CT值，结果见附图16。附图16A为注射Au DENPs-巨噬细胞复合物组，附图16B为注射Au DENPs组，图中虚线圈出部位为肿瘤部位，可以看到，Au DENPs组CT值在注射后90min达到峰值，随后CT值出现了下降趋势；而Au DENPs-巨噬细胞复合物组，肿瘤部位的CT值一直在增加，直到4h，未见CT值的下降。以上结果说明，在金纳米粒子等量情况下，Au DENPs-巨噬细胞复合物在肿瘤部位聚集的时间比单独Au DENPs更长可以实现对肿瘤的CT成像，附图16C为Au DENPs组以及Au DENPs-巨噬细胞复合物组动物成像的CT值随时间变化趋势图。

实施例13

阿霉素(DOX)为骨肉瘤治疗的常规化疗药物，为进一步增强治疗效果，我们将DOX与Au DENPs-巨噬细胞复合物联合应用于治疗。细胞层面上，采用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞与Au DENPs共同孵育24h后，获取细胞培养液上清。将不同浓度的DOX(0、1、5、10、25、50μg/mL)单独以及与Au DENPs-巨噬细胞复合物上清液按照1:1混合(50％V/50％V)后，分别与K7细胞共同孵育24h后，采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测各组K7细胞的存活率，结果见附图17。可以看到，随着DOX浓度的增加，两组K7细胞的存活率都在下降。整体看来，DOX联合Au DENPs-巨噬细胞复合物组的K7细胞存活率都要比单独应用DOX组的低，表明，Au DENPs-巨噬细胞复合物可以增强DOX对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。

实施例14

使用Balb/C小鼠建立小鼠骨肉瘤原位动物模型，用于Au DENPs-巨噬细胞复合物的在体治疗。动物模型构建方式与实施例12相同。待模型建成后，将成瘤的小鼠进行分组，分为4组，分别为空白对照(Control)组、化疗(DOX)组、Au DENPs-巨噬细胞治疗组以及联合治疗(Au DENPs-巨噬细胞复合物+DOX)组。其中Control组(给予100μL生理盐水)、DOX组(尾静脉给药DOX，浓度为4.0mg/kg体重)、Au DENPs-巨噬细胞复合物治疗组(尾静脉注射AuDENPs-巨噬细胞复合物1×10⁶个细胞/100μL)、联合治疗组(先给与等量的Au DENPs-巨噬细胞复合物，1小时后，给与相同剂量的DOX)，隔天注射，共一周。观察2周，在此期间，对各治疗组的小鼠的膝关节体积(附图18)以及体重(附图19)进行测量以评价治疗效果。可以看到Control组的膝盖体积最大，Au DENPs-巨噬细胞复合物+DOX治疗组的膝盖体积明显较其他组小。由于骨肉瘤的恶性程度高，总体上，各组小鼠的体重都较治疗初期有降低。Control组的体重下降幅度最大，而Au DENPs-巨噬细胞复合物治疗组的降幅最小。治疗周期结束后，采用眼球取血的方式获取各组小鼠的血清用于血清TNF-α的定量检测，后获取各组小鼠的肿瘤以及重要内脏器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏)用于病理检测。可以看到，各组肿瘤组织的H&E以及荧光TUNEL检测(附图20)中，Au DENPs-巨噬细胞复合物+DOX组的肿瘤组织结构最为稀疏，凋亡荧光强度最强，DOX组、Au DENPs-巨噬细胞复合物组、Control组依次减弱。血清TNF-α的ELISA检测结果(附图21)显示，Control组与DOX组的TNF-α的水平较低，Au DENPs-巨噬细胞复合物治疗组中TNF-α的水平较前两组有所增加，Au DENPs-巨噬细胞复合物+DOX组的TNF-α含量最高，明显高于其他三组。另外，四个治疗组小鼠的主要脏器H&E染色结果显示(附图22)，与Control组相比，其他三个治疗组未对小鼠的内脏产生损害，说明Au DENPs-巨噬细胞复合物未对机体正常组织产生伤害。总体上，Au DENPs-巨噬细胞复合物对骨肉瘤具有一定的治疗效果，Au DENPs-巨噬细胞复合物与DOX联合使用的治疗效果优于单独化疗组，说明Au DENPs-巨噬细胞复合物还可以进一步增强DOX对于骨肉瘤的治疗作用。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。