阅读说明：本技术 细胞重编程疗法 (Cell reprogramming therapy ) 是由 B·帕雷卡旦 M·李 于 2019-01-11 设计创作，主要内容包括：提供了用于动态共培养两个细胞群的系统和方法。所述系统包括被设置为将置于容器内的刺激细胞群与应答细胞群物理分隔开的屏障。所述屏障可使至少一种细胞群的分泌因子透过。因此所述应答细胞群可通过暴露于分泌因子而被改变以产生重编程细胞群,所述重编程细胞群包含来自刺激细胞群的生物分子(核酸)和/或表现出一种或多种不同于所述重编程细胞的亲本细胞群的额外的或修饰的功能活性。(Systems and methods for dynamic co-culture of two cell populations are provided. The system includes a barrier configured to physically separate a stimulating cell population from a responding cell population disposed within the container. The barrier is permeable to secreted factors of at least one cell population. The responder cell population may thus be altered by exposure to a secreted factor to produce a reprogrammed cell population that comprises a biomolecule (nucleic acid) from a stimulatory cell population and/or exhibits one or more additional or modified functional activities that are distinct from the parental cell population of the reprogrammed cell.)

细胞重编程疗法

相关申请

本申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请No.62/616,930的权益。上述申请的所有教导通过引用并入本文。

政府支持

本发明是在美国国立卫生研究院授权的R01EB012521和T32EB016652-01A1号政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

造血细胞因其在人体中重建血细胞的能力而常用于细胞疗法(Lorenz等人,1951)。骨髓、外周血动员的造血干细胞(HSC)、脐带HSC、血红细胞、血小板及白细胞是可用的细胞来源，其采自患者并制备以用于静脉施用以修复其造血功能。随着造血细胞疗法的持续发展，需要改进的生物加工系统，以用于体外维持和工程化造血细胞以适应临床应用。

发明概述

本申请提供了动态共培养刺激细胞和应答细胞，如成纤维细胞刺激细胞和HSC应答细胞，以支持如体外扩增和生物加工治疗细胞的系统和方法。

在一些实施方案中，共培养系统包括被置于容器内的应答细胞群和刺激细胞群。屏障被设置为将应答细胞群与刺激细胞群物理隔开，所述屏障对所述刺激细胞群的分泌因子是可渗透的。所述系统还包括被设置为引导液体悬浮液流经所述容器的射流驱动器，所述液体悬浮液包含所述应答和刺激细胞群中的至少一种。

在其他实施方案中，提供了重编程细胞的方法。所述方法包括将应答细胞群暴露于刺激细胞群的分泌因子中。所述应答细胞群和刺激细胞群被置于容器内，且所述分泌因子散布于在容器中分隔所述应答细胞群和刺激细胞群的屏障中，使得所述应答细胞群在暴露于分泌因子后被修饰。所述方法还包括在所述容器中引导细胞培养基流，所述细胞培养基流包含所述应答和刺激细胞群中的至少一种。

在其他实施方案中，提供了组合物，其包含重编程细胞群。所述重编程细胞包括源自不同细胞群的核酸。与亲本重编程细胞群相比，所述重编程细胞还表现出一种或多种额外的或修饰的功能活性。所述组合物可被施用于有需要的患者。

在其他实施方案中，提供了向需要其的患者(如具有自身免疫疾病、炎症疾病或移植物的患者)施用重编程细胞组合物的方法。所述组合物可经静脉施用或局部施用递送，并可包括约500万-约10亿个重编程细胞的剂量。

具体实施方式

中，细胞调节持续时间为约60小时-约120小时、或约96小时、或约24小时以上。延长应答细胞暴露于刺激细胞能有利地为应答细胞提供足够的时间来重编程。调节方案结束后，可立即向患者施用重编程细胞。或者，可产生大批细胞，其中将其他细胞“剂量”低温保存以备后用。

细胞调节方法、或重编程细胞方法的实例如35图所示。在第一方案、或操作阶段，生物反应器(如存放通过屏障分隔的应答细胞群和刺激细胞群的容器)接种有刺激细胞。通过将细胞液体悬浮液通过超滤流体入口流入生物反应器中，可将刺激细胞群引入生物反应器中。然后，将细胞孵育一段时间，例如约6-24小时。生物反应器中，以至少1个细胞/cm²，例如约1-约1,100,000个细胞/cm²的密度接种刺激细胞群。刺激细胞还可补充一种或多种生长因子、血清、血小板裂解液和/或抗生素。

接种刺激细胞后，第二方案中将应答细胞导入系统中。具体地，应答细胞可通过循环流体入口导入，并保存在生物反应器的流体密封室内。流体密封室可作为气体交换工具，尤其是在还使用细胞培养袋时。接种和或共培养期间，包括刺激细胞和应答细胞的细胞可保存在约0.1％-约21％的氧分压中。

在第三方案中，允许所述共培养系统运行一段足以进行细胞重编程的时间，例如约24小时或更久。在第三方案期间，可能发生停流过程，其中含有刺激细胞或应答细胞或两者的细胞培养基流导入一段时间，然后基本静止一段时间。可将数个感应单元整合入流动回路中，以实时监测该系统并能调节系统参数(如添加新鲜培养基)。传感器和模块可以包括：氧气、二氧化碳、葡萄糖、pH、细胞密度工具、通风孔和排气室。

然后，共培养期间结束时，应答细胞群以及任选的刺激细胞群可在第四方案中从系统获得。

系统可包含一个或更多的泵以将任何应答细胞群、刺激细胞群、新鲜培养基和/或试剂的流导入或导出生物反应器。例如，泵可为蠕动泵或磁力泵(如

泵)。如实施例3所示，显示停流条件相比连续的共培养条件增加了应答细胞的增殖。如实施例4所示，相比由蠕动泵引导的流，由磁力泵引导的流也显示增加应答细胞的增殖。

所述生物反应器或延伸至/自生物反应器的管道还可包括排气室和/或通风孔以用于从封闭系统中排出气体。排气室和/或通风孔也可用于去除或捕获系统内对细胞有害的气泡。

动态共培养系统中包括的刺激细胞可为基质细胞、病毒包装细胞、抗原暴露细胞、年轻血细胞、微生物细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、癌细胞和/或神经元。所述刺激细胞可置于组织内。

应答细胞可为免疫细胞、骨髓细胞和/或红细胞。在一个具体实施方案中，所述应答细胞为造血干细胞或造血祖细胞。在另一个具体实施方案中，所述应答细胞为白细胞。

在另一个实施方案中，所述刺激细胞为间充质干细胞，且所述应答细胞为T细胞。

所述应答细胞暴露的分泌因子可为核酸分子，例如mRNA、微小RNA、环状RNA和DNA。或者，所述分泌因子可为生长因子、趋化因子和/或细胞因子。所述分泌因子可包括在刺激细胞的外泌体中，所述外泌体之后可被所述应答细胞内吞。

刺激细胞与应答细胞对的实例如表2所示。白细胞可被认为是一种免疫细胞且包括在表2中反映的免疫细胞类别内。年轻细胞包括取自胚胎、新生儿或***早期阶段期间的受试者，例如直至18岁的人类受试者的细胞。脂肪细胞包括白色、棕色和米色脂肪细胞。

表2.刺激细胞与应答细胞对

在另一实施方案中，提供了具有重编程细胞群的组合物。所述重编程细胞包含源自不同细胞群(如刺激细胞)的生物分子(如核酸分子、蛋白)。与其亲本群相比，所述重编程细胞可表现出一种或多种额外的或修饰的功能活性。如本文所用，“亲本群”为尚未暴露于所述不同细胞群的分泌因子的细胞群。术语“重编程细胞”是指已暴露于所述不同细胞群的分泌因子的亲本细胞群。所述重编程细胞还可表达不由其亲本群表达的细胞表面标志物。与其亲本群相比，所述重编程细胞可具有额外的或修饰的功能活性，例如修饰的T细胞体外增殖活性。

所述组合物可配制于可接受的载体中以施用给患有免疫疾病的受试者。方法可包括将所述组合物施用给需要其的患者。例如，可根据治疗方案提供所述组合物以增加或减少一种或多种抗炎细胞的产量或治疗炎症相关的疾病、失调或病症。所述疾病、失调或病症包括，例如类风湿性关节炎、I型和II型糖尿病、强直性脊柱炎、肌萎缩侧索硬化症、硬皮病、***、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)和巨噬细胞活化综合征(MAS)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泻、多发性硬化症、心肌梗塞、肿瘤、慢性感染性疾病、系统性红斑狼疮、骨髓衰竭、急性肾损伤、败血症、多器官功能障碍综合征、急性肝衰竭、慢性肝功能衰竭、慢性肾衰竭、胰腺炎和格雷夫氏病。

生物反应器系统的实例如本文实施例1和2中所述。特别地，造血干细胞和祖细胞(HSPC)通过间接的成纤维饲养共培养固定并富集(实施例1)。此外，数据还表明使用间充质干细胞(MSC)获得了免疫细胞的重编程(实施例2)。

免疫细胞重编程的理论机制是MSC分泌的外泌体。外泌体含有来自其宿主细胞(在实施例2中为MSC)的遗传物质，如RNA。随后，外泌体能被受体细胞(在实施例2中为T细胞)内吞。所述T细胞可通过吸收并整合MSC衍生的物质经历构象变化。相比于对照，在培养的MSC:PBMC中观察到测量的外泌体的明显变化。也可参见实施例5。该原始数据证明MSC确实在生物反应器中释放了可检测的外泌体。

具体实施方式

实施例1.中空纤维生物反应器系统

建立一个可扩展的中空纤维生物反应系统，其中已知能提供造血支持的小鼠胚胎成纤维细胞系(Roberts等人,1987)与小鼠HSC在连续、浓缩和循环流中间接共培养为饲养层，以稳定并富集用于短期生物加工的HSC细胞。由于饲养细胞通过本系统的中空纤维膜与HSC分离并且经历循环流，HSC的分离被简化。进行概念-验证研究以筛选合适的纯化的基质饲养细胞，在微反应器系统中开发共培养方法，并评估小鼠骨髓HSC的间接稳定和富集效果。

动物与骨髓细胞悬液

通过使用28号针和3ml注射器冲洗中央骨髓，已从6-8周龄的雌性C57 BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离小鼠原代全BM细胞。冲洗的骨髓使用22号针和和3ml注射器研磨成单细胞悬液，然后通过70μM尼龙网筛过滤以从细胞制品中除去组织碎片。用培养基洗涤细胞，然后进行胺-氯化物-钾(ACK)裂解缓冲液(Biolegend,CA,USA)处理以移除血红细胞。然后，使用细胞活性染色、台盼蓝(ThermoFisher Scientific,USA)和血细胞计数器对BM细胞进行实验计数。用添加有10％FBS，1％青霉素/链霉素，10mM HEPES(ThermoFisher Scientific,USA)和1mM丙酮酸钠(ThermoFisher Scientific,USA)的RPMI(Roswell Park MemorialInstitute Medium；Gibco,USA)制成培养基。

2-D迁移皿共培养

在2-D迁移皿共培养中进行初始优化实验，以实现更高程度的通量和参数评价，以确定优化的培养标准：基质细胞类型和剂量。将含有0.4μM孔的Corning 24孔迁移皿(Grenier Biosciences,Austria)用于这些培养物。在加入全骨髓细胞(BMC)24小时前，用2E5(低基质剂量:1:10)或4E5(高基质剂量:1:2)接种基质细胞。将BMC分别接种于2E6或8E5细胞中，然后将共培养物在37℃孵育72小时。通过流式细胞仪计数并分析细胞的HSPC群。如前所述，使用标准RPMI细胞培养基培养细胞。

3-D微反应器建立

所述中空纤维微反应器购自Spectrum实验室(CA,USA)。用无菌过滤的0.5M氢氧化钠(NaOH)填充所述微反应器中空纤维的内和外毛细管空间，并在37℃放置1-2小时以进行反应器灭菌。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma,USA)多次冲洗以去除NaOH。所有流体连接器和管(MasterflexBPT管和铂金硫化硅胶管,IL,USA)类似地用0.5M NaOH浸泡并冲洗至少1个小时，然后用无菌过滤的PBS洗涤。图3A显示了用于共培养的装置的建立。

3-D微反应器接种和取样

在开始共培养前24小时，用7E6(高基质剂量:1:2)或3-4E6(低基质剂量:1:10)3T3基质细胞接种微反应器。在24小时，用培养基轻轻地洗涤接种的微反应器，然后将其吸附到分别含有14E6(高基质剂量:1:2)或30-40E6(低基质剂量:1:10)全BMC的细胞培养袋(Origen)上。使用Masterflex(IL,USA)蠕动泵以4mL/min的速度导入流体。在1、24、48小时的时间点，采集250-500μL样品等分试样进行细胞定量和流式细胞仪分析。施加流体后72小时收获共培养物，然后类似地进行分析。

基质细胞培养

小鼠间充质干细胞购自Gibco。将细胞在由添加有10％热灭活胎牛血清(FBS；Atlanta Biologicals,GA)、1％青霉素/链霉素(Gibco,MA)、1％抗细菌-抗真菌素(Gibco,MA)的无菌α-MEM(Gibco,MA)组成的培养基中培养，然后在从供应商得到原始细胞的1-3代之内进行实验。3T3细胞购自ATCC(American Type Culture Collection)，然后按照其推荐的指示进行扩增；在DMEM中添加10％FBS(Atlanta Biologicals,GA)和1％青霉素/链霉素(Gibco,MA)。

流式细胞仪分析

在4℃下、黑暗中，使用直接标记的偶联至生物素的针对CD11b-、CD11c-、Gr1-、CD3-、CD4-、CD8a-、CD19-、B220-、NK1.1和TER119的人单克隆抗体、cKit(CD117)-APC、Sca1-PECy7和链霉亲和素APC Cy7(BD Biosciences和eBiosciences,USA)对细胞染色20-30分钟。用添加2％FBS和2mM乙二胺四乙酸(EDTA；Gibco,USA)的PBS洗涤并重悬细胞。使用FACSLSRII(BD Biosciences,USA)和FlowJo软件(USA)进行流式细胞仪分析。

在共培养开始时，使用羧基荧光素(CFSE)掺入评估细胞周期。使用流经无基质支持的微反应器的BMC对照样品测定F0峰。

统计分析

用GraphPad Prism进行所有的统计检验。通过Student’s t检验来检验组间差异，其中p值≤0.05被认为是统计学显著差异。相对于单独BM微反应器共培养物进行所有比较。所有实验进行至少三次生物学重复。

结果：在2-D无接触依赖性共培养中鼠胚胎成纤维细胞系支持LSK富集。

之前已表明基质细胞增强了全BMC体外造血支持。本研究中，应用选择优化的基质细胞类型的两个标准：1)易于细胞分离、维持和扩增以“现成”使用，以及2)HSPC的造血支持潜力。为确定使用哪种基质细胞类型用于体外支持全BMC，比较骨髓间充质细胞(MSC)和3T3小鼠胚胎皮肤成纤维细胞系的支持HSPC的能力。包括无基质细胞组作为对照。为筛选优化的共培养条件，调整了2-D无接触依赖性迁移皿设置以模拟具有更高通量实验优势的间接共培养。

有或没有基质支持的共培养72小时后，枚举全BMC的隔室。3天内，基质支持使全BMC的总数量(图2A)维持在其初始接种数量2x10⁶个输入细胞。然后，分析BMC各亚群中与治疗更相关的LSK群，其表型上定义为谱系^阴性Sca^阳性cKit^阳性(LSK)(图2B)。有趣的是，3T3成纤维细胞系表现了出色的能力以从谱系^阴性及全BMC库内富集LSK群(图2B-C及图7)。3T3基质细胞支持的BMC的LSK谱中不存在表型异常(图2C)。在3T3细胞与全BMC的比例为1:2和1:10的范围内观察到了这些LSK富集的发现(图7)，提示了规模扩大的动态工作范围。该结果揭示了之前未发现的3T3成纤维细胞支持从全BM富集小鼠HSPC的能力。在我们的中空纤维微反应器中的所有后续实验中，“现成的”特性和优异的造血支持潜力导致3T3的规模扩大。

结果：在中空纤维生物反应器中的全骨髓接种和稳定

图3A-C图示了所述中空纤维生物反应器。生物反应器通常用于单细胞类型的规模扩大。中空纤维系统用于流线化交换和补给新鲜的培养基以支持大规模细胞扩增。该系统改为共培养工具，其中外腔空间中接种基质细胞而BMC流经纤维内腔，以研究连续悬液培养期间工程化的组织层支持LSK的潜力(图3A-C)。

微反应器装置由通过专用管从气体交换袋通过Masterflex泵向下流动的细胞组成，所述泵驱动细胞经由其毛细管内入口穿过中空纤维(图3A-B)。基质细胞通过标记的入口接种毛细管外表面(图3B)。中空纤维膜由亲水的聚醚砜(PES)构成，且各纤维的截留分子量为0.2μM孔，其允许仅非细胞的流体可双向交换(图3C)。因其在高温下和恒定的流体暴露下具有高度耐用性而选择PES。MasterflexBPT管用于使BMC循环通过(loopthrough)Masterflex泵头从袋中流向微反应器(图3A)。该PharMed BPT管由铂金硅胶制成，因其具有散裂水平低、对酸碱耐受度高、且能耐具有最小的细胞剪切的高压而被使用。测试14x 10⁶个细胞的密度的造血细胞以不同流速(5mL/min、10mL/min和5mL/min)在毛细管内隔室中循环时的活力。由于单核细胞的吸附，全BMC经过1小时内流动后细胞总计数下降，然后72小时培养期间保持相对不变。72小时后，更低的流速下观察到更高的细胞计数，因此选择Masterflex泵的最低流速为4mL/min(图3D)。

结果：基质细胞支持挽救中空纤维生物反应器中的细胞丢失

静态共培养显示，3T3成纤维细胞表现出比MSC和非支持的BMC更优异的造血支持(见图2)。为在微反应系统中证实这种结果，将新冻融的3T3接种到中空纤维的外腔表面24小时，然后再向设备中加载主要BMC，以使3T3有时间附着并具有稳定的功能。相比非基质细胞支持的骨髓，含有3T3的共培养物比BMC具有统计学上显着的保护优势(图4A)。一直持续观察到72小时时间点。为维持LSK细胞数量需要高剂量的基质细胞支持，即1个3T3细胞对2个BMC细胞(图4A-B)。随着时间的推移，检测到的死细胞数量没有可观察到的差异，说明循环的细胞很可能附着于系统组件，而不占悬液中细胞计数(图8A-B)。

与相对1小时样品标准化计数所观察到的相似，在1、24、48和72小时的时间点时的原始计数也表明，1个基质细胞对2个BMC的3T3成纤维细胞的剂量能够阻止在非支持BMC的情况下观察到的细胞数量下降趋势(图9A-B)。基于这些结果，所有从微反应器中分离出BMC的造血隔室的后续实验均使用1:2高基质剂量模式进行。

结果：3T3成纤维细胞富集LSK

接种3T3的微反应器在48小时内稳定细胞计数的能力为其探索扩增源自BM的细胞奠定了坚实的基础；但是，该细胞库内的主要治疗性关注点是造血干细胞及祖细胞隔室。为评估HSPC群，通过流式细胞仪分析取样时间点的LSK表型(图5A-B)。结果表明，来自接种3T3的微反应器的全BMC细胞群内LSK细胞富集的趋势非常强烈(图5A)。相比非基质细胞支持的骨髓，用3T3支持的LSK细胞数量以类似方式扩增(图5B)。还用低基质剂量装置进行了类似的分析(图9A-B)。这种LSK富集潜力仅见于用更高剂量的1个3T3细胞对2个BMC细胞(图9A-B及图5A-B)。

然后，评估了全BMC细胞库中的基质群谱系^阳性和谱系^阴性细胞。有趣的是，全BMC群内谱系^阳性和谱系^阴性造血支持细胞的数量没有可检测的变化(图5C-D)。

结果：3T3支持的LSK表现出增强的固有细胞循环。

由于流经接种3T3的微反应器的全BMC的基质隔室内未检测出差异，推测观察到的LSK细胞群的富集是固有变化的结果。因此，微反应器上样前，将全BMC用CFSE脉冲，以研究与3T3支持相关的固有细胞循环模式。图6A显示了分析的LSK的CFS^lo库。正如预期，在0-1小时的时间点，几乎没有LSK循环(图6B)。随后在48和72小时的时间点(仅48小时的时间点具有统计学显著差异)，当3T3支持BMC时，作为CFSE^lo的LSK库明显更大(图6B)。

为评估这是否只是接种3T3的微反应器中的所有BM细胞扩增的结果，进一步分析了基质细胞谱系^阳性和谱系^阴性的循环特性(图6C-D)。虽然这两种细胞类型中CFSE的掺入量随着微反应器中时间的增加而逐渐增加，但有或没有基质细胞支持的BMC之间没有差异(图6C-D)。

实施例2.使用间充质基质细胞重编程免疫细胞的实例

进行一组实验以表明间充质基质细胞(MSC)能通过间接共培养灭活T细胞，从而形成一种新型抗炎细胞组合物。减少MSC的剂量、共培养的时间、共培养的体积、以及T细胞发生的表型变化，以在体外系统中实践。所述体外系统包括结合有迁移皿***物的标准的组织培养多孔板。将T细胞置于孔底，而将MSC置于迁移皿***物中。所述迁移皿***物允许在两种细胞群之间运输分泌因子，但消除细胞直接接触和相互作用的可能性。

已知与MSC共培养时(直接的、或通过迁移皿***物而间接的)，MSC抑制激活的T细胞(***素，CD3/CD28)的CD3+T细胞增殖。这可在代差异中进一步观察到，因此在MSC存在下培养的T细胞可检测到增殖代数的明显减少。证实这种功能具有剂量依赖功能。T细胞激活标志物还显示出与增殖水平的良好相关性。共培养条件下，MSC能以剂量依赖方式抑制CD38和CD25(中期和后期标志物)。与T细胞激活和增殖相关，MSC在刺激下还改变T细胞分泌组。间接共培养期间，观察到促炎因子(TNFa、IL1b、IL17)剂量依赖性减少。

剂量应答与体积

图10显示了MSC:PMBC相互作用的剂量应答和体积。可以剂量依赖方式直接调节MSC/PMBC相互作用。表明培养物体积的变化明显影响增殖产出量。图10A中的组如下：组A:1.5M PBMCs,0.8mL；组B:1.5M PBMCs,1.6mL；组C:3.0M PBMCs,0.8mL；组D:3.0M PBMCs,1.6mL；组E:0.75M PBMCS,0.8mL。

MSC:PMBC时机

表明MSC存在持续时间明显影响PBMC增殖，如图11所示。

另外，免疫增殖作用增强，但不特异于MSC。通过与其他细胞类型一起孵育，同样存在增强的增殖，如图12所示。

24小时BrefA PBMC

表明布雷菲德菌素A处理PBMC降低MSC效率，其揭示了交互机制。在PBMC上进行24小时BrefA处理，其结果如图13所示。另外，表明布雷菲德菌素A处理MSC降低MSC效率，支持分泌因子的治疗性。在MSC上进行24小时BrefA处理，其结果如图14所示。

相比对照，布雷菲德菌素A处理的MSC证实了增强的功能。在共培养前3小时以及在第1、2、3天处理MSC，其结果如图15所示。

MSC:PMBC生物反应器

动态培养中，观察到PBMC动态流下免疫抑制效果增强。PBMC刺激24小时后进行共培养，说明MSC挽救炎症损伤的能力。结果如图16所示。

MSC:PMBC预刺激

表明具有炎症信号的MSC许可不显著增强功能。结果如图17所示。

IFN-γ似乎是唯一在1:10时具有良好效果的细胞因子。在1:50时，表明主要影响因素是不能通过许可克服的细胞数量。

增殖追踪

使用标准CFSE染色进行增殖追踪。共培养开始前，使用该染料给PBMC群染色。细胞***时，该染料在亲本群和子代群之间分配，因此导致整体信号减少。可从随着代增加信号强度左移容易地看出这一点(图18A)。通过标准流式细胞仪分析可以容易地检测并允许检测各代。

药动力学模型的实例如图18A-18I所示。图18A显示了基于CFSE的增殖追踪的实例。药代动力学模型和控制方程如图18B-18C所示。建模结果如图18D-F所示，阴影区以任意单位(a.u.)计。模型的预测能力如图18G-I所示。

图19A-19F显示了来自MSC:PBMC共培养实验的流式细胞仪数据。顶行显示了整个增殖群的表达。底行显示了各单个增殖群的表达。Y轴为标准化的增殖。图19A为各种MSC:PBMC比例的CD3增殖的图。图19B为各种MSC:PBMC比例的CD3代的图。图19C为CD4增殖的图。图19D为CD4代的图。图19E为CD8增殖的图。图19F为CD8代的图。在图19A-19F中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。

图20A-20H显示了MSC:PBMC共培养实验的流式细胞仪数据。顶行(包括图20A、20C、20E及20G)显示了整个增殖群的表达。底行(包括图20B、20D、20E及20F)显示了各单个增殖细胞群的表达。X轴为标准化的增殖，并且Y轴为表面标志物表达水平。图20A为不同MSC:PBMC比例的CD4增殖和CD38表达的图。图20B为显示高线性/相关性的CD4增殖和CD38表达的图。图20C为各种MSC:PBMC比例的CD4增殖和CD25表达的图。图20D为显示高线性/相关性CD4增殖和CD25表达的图。图20E为各种MSC:PBMC比例的CD8增殖和CD38表达的图。图20F为显示高线性/相关性CD8增殖和CD38表达的图。图20G为各种MSC:PBMC比例的CD8增殖和CD25表达的图。图20H为显示高线性/相关性CD8增殖和CD38表达的图。在图20A-20F20H中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。

图21A-21K显示了分泌的细胞因子的多剂量应答。图21A显示了各种MSC:PBMC比例的IFNa的应答。图21B显示了INFg的应答。图21C显示了IL1b的应答。图21D显示了IL1ra的应答。图21E显示了IL4的应答。图21F显示了IL10的应答。图21G显示了IL12p40的应答。图21H显示了IL17的应答。图21I显示了IP10的应答。图21J显示了PGE2的应答。图21K显示了TNFa的应答。在图21A-21K中，St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。

在图19A-21K,St＝stim,Ct＝对照,A＝1:10,B＝1:20,C＝1:100,D＝1:200,E＝1:1000,F＝1:2000。

图22为PBMC的标准化增殖vs暴露于MSC的时间的图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。共培养1、2和3天后将MSC***物移除。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。需要大量的治疗性MSC持续时间以引起完全反应。发现有效MSC剂量下4天中3天是必要的。在第1天和第2天存在明显的免疫抑制，但水平明显降低。

图23A-23K为标准化细胞因子分泌vs暴露于MSC的时间的柱状图。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。共培养1、2和3天后将MSC Transwell***物移除。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。如在之前章节中所述，调查细胞因子谱，观察到一致的关联。较长暴露于MSC导致更大程度地抑制炎症细胞因子，对于短期暴露，反之亦然。图23A显示了IFNa随MSC暴露延长而增加。图23B显示了INFy随MSC暴露延长而降低。图23C显示了IL1b随MSC暴露延长而无显著变化。图23D显示了IL1ra随MSC暴露延长的略微增加。图23E显示了IL4随MSC暴露延长而降低。图23F显示了IL10随MSC暴露延长而降低。图23G显示了IL12p40随MSC暴露延长而无显著变化。图23H显示了IL17随MSC暴露延长而降低。图23I显示了IP10随MSC暴露延长而无显著变化。图23J显示了PGE2随MSC暴露延长而增加。图23K显示了TNFa随MSC暴露延长而降低。

图24为标准化增殖vs培养体积条件的图。如图24所示，体积是驱动MSC效性的潜在微环境因素。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。发现加倍共培养体积显著降低MSC效性。

图25A-25K为标准化细胞因子分泌vs培养体积条件的柱状图。如图25A-25所示，体积是驱动MSC效性的潜在微环境因素。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。明显地，该作用通过内因子的稀释通过药代动力学驱动。有趣的是，未观察到对MSC主导因子的影响，说明由于两个体积的分泌水平相似，缺乏这些特定因子的功效以及潜在的自分泌调节。主导的PBMC因子提高到2倍，说明缺乏MSC作用。这也反映出缺乏足够的初始细胞因子水平以许可MSC。

在图24-25K中,S1＝stim 1x vol,S2＝stim 2x vol,C1＝ctrl 1x vol,C2＝ctrl2x vol,M1＝共培养1x vol,M2＝共培养2x vol

图26显示了关键性的MSC:PBMC交互作用，如使用蛋白转运抑制剂所示。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。正如预期，发现使用BA处理MSC消除了治疗功能。

图27A-K显示了关键性的MSC:PBMC交互作用，如使用蛋白转运抑制剂所示。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。正如预期，结果显示MSC分泌的因子极大减少。也观察到促炎因子显著增多，其与MSC免疫抑制功能直接相关。

图28显示了布雷菲德菌素A处理MSC:PBMC共培养物的结果。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。还观察到，BrefA处理PBMC导致MSC功能极大降低，这支持需要MSC许可。

图29A-K显示了布雷菲德菌素A处理MSC:PBMC共培养物的结果。在共培养开始前使用布雷菲德菌素A处理PBMC或MSC24小时。PBMC增殖通过用ConA和IL2刺激4天实现。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。标准化细胞因子分泌vs BrefA条件的柱状图。发现了PBMC主导因子的显著抑制，其可能导致MSC许可不足，导致免疫抑制缺乏。

图30A-30D显示了不同生物反应器培养条件下分泌的粒径分布。图30A显示了刺激的PBMC培养物的颗粒计数。图30B显示了刺激的PBMC培养物的颗粒计数。图30C显示了刺激的PBMC:MSC培养物的颗粒计数。图30D显示了刺激的PBMC:MSC培养物的颗粒计数。NoMSC＝刺激的PBMC；B-M＝刺激的PBMC；PlusMSC＝刺激的PBMC+MSC；B+M＝刺激的PBMC+MSC。

实施例3.停流培养

在气体透过性细胞培养袋中用50ng/mL CD3、50ng/mL CD28和50ng/mL IL-2刺激PBMC(停与续_3，图31)和纯化的T细胞(续_1与续_3，图31)长达336小时(14天)。培养条件为使用RPMI 1640和10％FBS在37℃和5％CO₂的标准培养孵育器中。连续流培养的整个时期中，循环连续流保持在50-100mL/min。除了在台盼蓝排除细胞计数(蓝色线/点)当天以50-100mL/min持续5分钟，停流培养保持静态培养。

如图32A-B所示，静态培养能够聚集，而添加短暂的流体脉冲导致剪切诱导的细胞分散体。这被证明是有利的，因其1)减弱了大的聚集体，其可造成营养物质扩散受限，因而导致非理想的细胞培养条件；及2)允许细胞枚举，这对于完整的大细胞聚集体而言是不可能的。

实施例4.停流培养的磁力泵

在气体透过性细胞培养袋中，用50ng/mL CD3、50ng/mL CD28和50ng/mL IL-2刺激PBMC(磁力泵，图33)，并用5μg/mL PHA-L和100ng/mL IL-2刺激PBMC(蠕动泵，图33)，长达240小时(10天)。引入磁力流并与蠕动泵流比较。在不同时间点从细胞培养袋中获取细胞计数。使用连续的磁力流10天后，发现产量更多。蠕动流中观察到明显的细胞碎片，说明由于蠕动机制相关的机械破坏而导致细胞死亡。

实施例5.暴露于MSC外泌体和纯化的MSC外泌体的PBMC中表达的miRNA

在中空纤维生物反应器中，在4天的培养期内将PBMC暴露于MSC外泌体。将MSC接种到腔外表面，而允许PBMC以50-100mL/min的流速在腔内空间内流动。刺激培养物诱导炎症环境。

培养期间MSC外泌体中和暴露于MSC外泌体的PBMC中表达的miRNA结果如表3所示。两栏中所示的数字代表来自测定的MFI(平均荧光密度)并指示样品中存在的miRNA量。上清液：

体系中仅有MSC的生物反应器实验的浓缩样品。沉淀：体系中有MSC和PBMC两者的生物反应器中PBMC沉淀样品。

表3.重编程的PBMC中表达的miRNA

实施例6.在迁移皿工程化体系中通过生产细胞转导慢病毒颗粒

慢病毒衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)，这使其成为有效的递送体系。但是，使用其将遗传物质递送入目标细胞之前，生产这些病毒的常规操作涉及冗长的收集和量化过程。已证明，迁移皿体系中生产细胞HEK293T具有同时产生慢病毒颗粒和转导(感染)靶细胞的能力，这消除了对单独的病毒收集和定量过程的需求。对于各实验，评估HEK293T的变体以及靶细胞类型密度以及迁移皿***物孔径，以鉴定吸附和悬液细胞类型的颗粒生产速率与感染动力学之间的重要关系。本实验成功表明在本系统的调控下，使用RFP构建体能够在六天内工程化人PBMC。这些研究表明能够结合并使转染/转导过程更接近自动化，以促进人靶细胞类型的及时和成本效益的转导。这样的研究可以为向病毒生产和随后的细胞疗法工程的改进的制造系统提供过渡。

基因工程化和治疗领域已应用三种初级病毒载体体系(腺相关病毒(AAV)、γ-逆转录病毒和慢病毒)，其中使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞在X连锁性严重混合免疫缺陷症(SCID-X1)、B型血友病以及血液系统恶性肿瘤的多种疾病中取得日益增加的成功(Rogers等人,2015；Hacein-Bey-Abina等人,2014；Porter等人,2011)。特别地，慢病毒载体已用于治疗罕见疾病，包括原生性免疫缺陷症和神经退行性贮积疾病(Mukherjee等人,2013；Aiuti等人,2013；Cartier等人,2009；Biffi等人,2013)。过去的几十年内，慢病毒已被使用和优化并且由于其能够转导***期和非***期细胞、其整合谱更安全且能以高滴度的载体产生，可作为优选的病毒载体体系(Merten等人,2016)。慢病毒载体的强大的感染性归因于基于HIV-1骨架，以及通过使用VSV-G包膜蛋白进行假分型，其允许通过病毒载体与大多数哺乳动物细胞类型的靶细胞表面之间的直接接触改进遗传物质的向性和转移(Durand等人,2011；Farley等人,2007)。

小规模生产慢病毒载体颗粒的常规方法涉及将3到4个质粒加入汇合度>90％的HEK293T细胞的2D培养系统中，然后是细胞培养上清液的收集过程，其进一步纯化、定量并储存在-80℃，(Ausubel等人,2012)。如图36所示，从HEK293T细胞的初始接种到其可用于后续转导靶细胞类型的时间，取决于优选使用的定量方法需要大约7到10天(Ausubel等人,2012；Geraerts等人,2006)。随着越来越多的使用慢病毒载体的临床试验收到临床批准，需要过渡到常规的用于细胞治疗的大规模制备方法，其限制需要过长的生产时间、减少试剂消耗和昂贵手工操作(Merten等人,2016；Geraerts等人,2006；Sheu等人,2015；Gandara等人,2018；Merten等人,2010)。使用目前所用的体系，病毒颗粒在转染期间不处于其滴度峰值，因为转染和转导过程作为两个不同的事件处理，意味着病毒并没有立即用于递送目标基因。相反，允许产生颗粒并立即转导靶细胞的单一低操作体系可将对单独的病毒收集和处理步骤的需求最小化。目前产生慢病毒并基因递送给细胞的方法需要优化，以将产生的病毒的滴度和数量最大化，同时保持制备过程中的终产物(靶细胞)的无菌性。该体系的重要性在于限制污染的可能性，同时允许更精简地过渡为大规模、封闭体系细胞工程化制造平台。

本研究显示了通过结合基于迁移皿的装置，一步法慢病毒颗粒生产和靶细胞转导体系的潜力。基于迁移皿的体系的操作能提供对靶细胞治疗产品参数的进一步了解，其中通过改变体系参数(例如***物孔径和细胞密度)可确定颗粒输出以及后续的感染倍数(MOI)的控制。本文收集的数据表明，可以确定基于迁移皿的装置中的附着和悬液细胞类型的颗粒输出和后续感染的优化范围，以匹配细胞治疗产品的需求。另外，转染和转导两个重要过程的结合可以解决目前许多与更及时且更具成本效益的使用慢病毒载体的细胞制备方法相关的问题(Milone等人,2018)。

分泌慢病毒颗粒的HEK293T细胞可感染迁移皿体系中的靶细胞

在添加慢病毒颗粒包装质粒前24小时，产生慢病毒颗粒的细胞系HEK293T细胞以45％汇合度接种到0.4μm***物中，以在转染开始时达到90％的最优密度。初始实验使用附着的胰腺癌细胞(病人1319)以及悬液Jurkat T细胞以评估基于迁移皿的体系的可行性。在添加质粒前24小时，将靶细胞以1.8x10⁵个细胞/mL接种到6孔中，以当HEK293T细胞开始产生慢病毒颗粒时(如图37A-E中所示，第24-48天)达到预期的25-30％的转导汇合度。在添加质粒后的第0天，将板放回37℃、5％CO₂的孵育器中。24小时后，将迁移皿***物中的培养基变更为收集培养基(仅DMEM/F12)，然后在HEK293T细胞开始产生子代慢病毒颗粒时(如图37A-E中所示，24-72小时)进行标准转染方案。在48小时，向所有板中加入8ug/mL聚凝胺转导剂，在25℃以600rpm震摇90分钟，以模拟悬浮液Jurkat T细胞的标准自旋接种(spinoculation)方案，然后移入孵育器中8-12小时。然后，将各孔中培养基变更为针对靶细胞类型的完全生长培养基并允许再生长48小时。然后，通过ZEISS显微镜评估各孔中转导的GFP表达，如分别对应于1319和Jurkat T细胞的图27C-D所示。

改变HEK293T和Jurkat T靶细胞的密度

一旦确定了迁移皿中靶细胞的转导，评估靶细胞和HEK293T细胞的接种密度的变化。在添加质粒一天前接种HEK293T细胞，以使转染当天达到目标汇合度的90％、75％、60％、45％和30％。在转导开始时，在6孔的每孔中接种Jurkat T细胞以达到30％的最优密度。使用流式细胞仪分析(FACS)测定各***物中HEK293T细胞密度对Jurkat T靶细胞转导效率的影响。

孔中Jurkat T靶细胞密度在10％、20％、30％、40％、50％之间变化以评估对转导效率的影响，同时HEK293T细胞以最优的90％汇合度维持在***物中。图38A比较了HEK293T细胞密度的变化，以及图38B比较了Jurkat T细胞密度的变化。

在转染时以90％汇合度接种于***物中的HEK293T细胞显示出颗粒产生以及后续转导底孔中的Jurkat T靶细胞的最高水平。如图38C所示，尽管观察到最多GFP阳性细胞，但在迁移皿底孔中还存在HEK细胞，这是不期望的副作用。因此，对于下游应用，***物中的较低密度(例如45％)的HEK293T可能更合适，例如在图38D中。在转导前以10％汇合度初始接种的Jurkat T细胞显示产生最多的GFP阳性细胞。

迁移皿***物孔径变化

选择待操作的另一个变量是迁移皿***物的孔径。使用理想的转导汇合度的HEK293T细胞和Jurkat T细胞，用不同孔径的***物评估其对迁移皿体系的转导效率的影响。选择孔径在0.4、1、3和8μm之间变化的***物。使用流式细胞仪分析来测定各组的转导效率。结果如图39A1-C所示。

对于更小的孔径，例如0.4和1μm，同时产生的病毒颗粒可能会堵塞孔，这限制其渗透和转导孔中靶细胞的能力。对于8μm孔径，尽管观察到更高的转导效率，更大的孔径使HEK293T细胞穿过膜，这是不理想的。

转导人PBMC

为了评估迁移皿体系的效率以转导目标人细胞类型，将来自供体PM的人外周血单核细胞(PBMC)在接种前按照材料与方法部分所述的CellTrace^TM CFSE细胞增殖染色法进行染色。转染开始前1天和转导开始前3天用PHA和IL-2刺激细胞。用流式细胞仪来测定利用基于迁移皿体系PMBC的转导效率和增殖潜力。使用RFP构建体，以区别转导与增殖的荧光。

讨论

本工作中，我们研究了基于迁移皿的细胞工程化体系是否允许以一个体系方式以最少的操作和试剂应用，使HEK293T同时产生慢病毒颗粒并转导目标的粘附的1319胰腺癌细胞和悬浮Jurkat T细胞和PBMC。

目前的许多纯化方案涉及使用超离心以浓缩病毒，但这些方法存在规模限制性，耗时且经常杂质和病毒一起被浓缩，之后所述杂质和病毒会引起免疫反应或干扰转导。常常采用一系列微滤步骤，基于一系列减小孔径的过滤器以最小化与过滤相关的颗粒衰减。切向流过滤(TFF)提供选择并可用于成功浓缩并部分纯化慢病毒，该方法比之前讨论的方法更可扩展且高效。本报道中，这几种策略在一步法体系中解决。为了完全除去由于目前实施的很多操作条件导致的与颗粒滴度损失和损伤相关的作用，使用HEK293T细胞连续产生高滴度的慢病毒颗粒，其立即与靶细胞接触。通过使用有孔的迁移皿膜，颗粒渗透穿过的程度是可控的，且已鉴定哪些孔会造成顶层的HEK293T细胞也透过(这种透过是不期望的)并可以固定。

目前，可以在将质粒加入HEK293T细胞后的两个不同的时间点收集病毒以用于进一步下游加工，这发生在转染后48和72小时。在收集过程中，许多HEK293T细胞受到干扰并将上清液留在板上，也因为一旦FBS从培养基中去除然后转移到收集液(仅含有DMEM/F12的培养基)中，HEK293T细胞也容易去除，因此第二轮收集可包括少于理想数量的产生病毒颗粒的HEK293T细胞。建议3天后不再进行进一步收集，因为上清液可含有少量质量差的病毒颗粒。根据本研究，建立了一种连续产生高质量的慢病毒的方法，所述慢病毒可立即与靶细胞接触用于转染。

在本研究中，显示了在基于迁移皿的体系中成功转导人Jurkat T细胞。另外，使用PBMC评估基于迁移皿的体系工程化可用于下游临床装置的人靶细胞的能力。

材料与方法

产生载体

使用表达SV40大T抗原突变版本(ATCC:CRL-3216)的人293T肾成纤维细胞系(HEK293T)基于各实验以各种密度接种于细胞***物和孔中，以产生慢病毒载体。慢病毒转移载体pLVEC-EFNB1-Fc-IRB来自于Rick Cohen的馈赠，其包含GFP或RFP报告基因。在存在DMEM/F12(Gibco)+10％FBS(Gibco)+1％青霉素/链霉素(Gibco)的存在下，使用包装质粒psPAX2和表达VSV-G的包膜质粒pMD2.G来进行转染。在37℃在相应的培养基(详见下文)中，在8ug/mL聚凝胺(Millipore Sigma)存在下，将转导进行指定的时长。

细胞培养

在添加有10％FBS(Gibco)和1％Pen/Strep(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)中生长HEK293T和1319细胞。在含10％FBS(Gibco)和1％Pen/Strep(Gibco)的RPMI-1640培养基(Gibco)中培养Jurkat细胞和PBMC。将PBMC用CFSE染色以用于增殖，并用PHA和IL-2刺激。

PBMC染色

通过将每2mL密度为2-4x10⁶个细胞/mL的全部细胞与总共1μL CFSE结合，用CellTrace^TM CFSE进行PBMC染色以用于增殖。在15mL圆锥管中将细胞以1700rpm离心5分钟，然后重悬于5mL的PBS中。加入3μL的CFSE并混合，并将管用箔覆盖并室温孵育5分钟。在管中的细胞悬浮液顶部加入2mL培养基来重构，并将管再次离心5分钟。一旦从细胞沉淀除去上清液后，用5mL的PBS短暂冲洗细胞一次，细胞第三次离心5分钟。用培养基替换上清液，进行细胞计数并将3mL的3.3x10⁶个细胞铺在6孔中。

PBMC刺激

用植物凝集素(PHA)和IL-2刺激PBMC以增殖。简言之，在往各***物中接种HEK293T细胞的同一天，往各孔中添加3μL PHA(1000ng/mL)和6uL IL-2(100ng/mL)并轻轻混合。

迁移皿体系

迁移皿***物获自于Grenier Bio-One，孔径尺寸在8、3、1和0.4μm范围内。膜由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成，且根据尺寸为半透明的或透明的。***物的培养表面积平均为456.05mm²。

流式细胞仪

使用BDFacsCanto II(BD Biosciences)和Flow Jo软件通过GFP表达分析靶细胞的慢病毒转导。各实验收集10000个事件/样品。无活性细胞排除在分析之外。

荧光显微镜

使用ZEISS显微镜定性分析样品的绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)标记物的表达。

实施例7.PBMC增殖

通过用ConA和IL2刺激4天时间获得PBMC增殖。显示研究的时间线的流程图如图40所示。通过流式细胞仪和CFSE染色测量增殖。

与剂量应答相关的结果如图41和42所示。MSC:PBMC比值显示出剂量应答样曲线。NHDF显示出免疫抑制能力，但不如MSC。

与共培养对T细胞增殖的影响相关的结果如图43所示。以150k/孔且与PBMC比例为1:10条件下，培养EC或MSC。术语EGM-2代表EGM-2细胞培养基。缩写50/50代表EGM-2+PBMC培养基(50/50混合)。缩写EC代表内皮细胞。缩写M代表即充质干细胞。缩写EC_M代表150k个ECS和150k个MCS。单独的ES显示适度的免疫调节效果。MSC显示明显的免疫抑制。EC+MSC仅显示比单独的MSC略微的改进。

与T细胞增殖中EC表型相关结果如图44所示。以150k/孔且与PBMC比例为1:10条件下，培养EC。动脉粥样硬化易发性和抗动脉粥样硬化性EC表型之间不存在可观察到的差异。两者均证明免疫抑制表型。

表明与NFDF(皮肤成纤维细胞)、HepG2(肝)和EA.hy296(内皮细胞)共培养的PBMC的标准化增殖应答的结果如图45所示。相比MSC，非MSC细胞显示出抑制PBMC增殖的能力显著下降。有趣的是，HepG2和EA.hy296细胞显示出增强的增殖。

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尽管已经具体示出和描述了示例实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的实施方案的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。