Aldh1抗原冲击树突状细胞
阅读说明：本技术 Aldh1抗原冲击树突状细胞 (ALDH1 antigen-pulsed dendritic cells ) 是由 Q·李 于 2019-01-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于产生和使用ALDH1抗原冲击树突状细胞(DC)的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中,用包含ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的组合物在体外对初始DC进行冲击,以产生ALDH1抗原冲击DC,其中所述组合物不含肿瘤细胞、细胞裂解物和全长ALDH1蛋白。在一些实施方案中,向受试者施用所述ALDH1抗原冲击DC,以便至少部分地治疗癌症(例如,杀死所述受试者中至少一些癌症干细胞)。(The present invention relates to compositions, systems, kits and methods for generating and using ALDH1 antigen to impinge Dendritic Cells (DCs). In certain embodiments, the initial DCs are pulsed in vitro with a composition comprising ALDH1a1 and/or ALDH1A3 immunogenic peptides to produce ALDH1 antigen-pulsed DCs, wherein the composition is free of tumor cells, cell lysates, and full-length ALDH1 protein. In some embodiments, the ALDH1 antigen is administered to a subject impinging DCs so as to at least partially treat cancer (e.g., kill at least some cancer stem cells in the subject).)
本申请要求2018年1月8日提交的临时申请序列号62/614,591的优先权，其全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于产生和使用ALDH1抗原冲击树突状细胞(DC)的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，用包含ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的组合物在体外对初始DC进行冲击，以产生ALDH1抗原冲击DC，其中所述组合物不含肿瘤细胞、细胞裂解物和全长ALDH1蛋白。在一些实施方案中，向受试者施用ALDH1抗原冲击DC，以便至少部分地治疗癌症(例如，杀死受试者中至少一些ALDH高癌症干细胞)。
背景技术
使用过继转移的T细胞或树突状细胞治疗癌症患者的临床试验已经显示出对晚期疾病患者的治疗效果。然而，对此类免疫治疗方法的临床响应仅限于有限百分比的治疗患者。一般来说，具有异质癌细胞群的大块肿瘤肿块已经被用作抗原来源，以产生效应性T细胞或引发DC疫苗。人肿瘤由在增殖、分化和引发子肿瘤的能力方面不同的异质肿瘤细胞克隆构成。目前的免疫方法不能靶向癌症干细胞(CSC)可能是治疗失败的一个重要因素。
人CSC的鉴定为癌症治疗的开发提供了新的范例。这些干细胞已经被证实对常规化疗方案和放射治疗具有相对抗性，并被认为是导致此类疗法后癌症复发和发展的细胞。以类似的方式，CSC现象可能不利地影响癌症的有效免疫疗法的开发。这些疗法包括靶向表达分化肿瘤抗原的细胞。然而，此类抗原可以在分化的肿瘤细胞上选择性表达。因此，不表达这些抗原的CSC可能逃脱这些免疫干预。
发明内容
本发明提供用于产生和使用ALDH1抗原冲击树突状细胞(DC)的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，用包含ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的组合物在体外对初始DC进行冲击，以产生ALDH1抗原冲击DC，其中所述组合物不含肿瘤细胞、细胞裂解物和全长ALDH1蛋白。在一些实施方案中，向受试者施用ALDH1抗原冲击DC，以便至少部分地治疗癌症(例如，杀死受试者中至少一些ALDH高癌症干细胞)。
在一些实施方案中，本文提供了产生抗原冲击树突状细胞的方法，其包括：使初始树状细胞(DC)与包含长度为8至100或8至250个氨基酸的ALDH1A1和/或ALDH1A3(例如，人ALDH1A1和/或ALDH1A3)免疫原性肽的组合物在体外接触(例如，负载)，其中所述组合物不含(例如，可检测地不含)i)全长ALDH1A1和ALDH1A3蛋白，和ii)肿瘤细胞和细胞裂解物或肿瘤细胞裂解物。在特定实施方案中，所述方法进一步包括，在接触之前，i)从受试者(例如，人受试者)收集初始DC和，ii)(例如，用IL-4和/或GM-CSF)培养所述初始DC。在某些实施方案中，所述收集包括从来自受试者(例如，动物)的血液(例如，人)或骨髓中分离初始DC。
在特定实施方案中，本文提供了治疗受试者中癌症的方法，其包括：向具有癌细胞的受试者施用ALDH1A抗原冲击树突状细胞(DC)，使得至少一些癌细胞(例如，ALDH高癌细胞)被杀死(例如，任何肿瘤的大小减小，或者癌细胞的总群体大小的数量减少，或者肿瘤复发减少，或者转移随着宿主存活率的增加而减少)，其中所述抗原冲击DC是已经用包含长度为8至100个或8至250个氨基酸的人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的组合物在体外冲击的初始DC，其中所述组合物不含：i)全长ALDH1A1和ALDH1A3蛋白，和ii)肿瘤细胞和细胞裂解物。在特定实施方案中，初始DC来自待治疗的受试者。在其他实施方案中，受试者先前已经移除了实体肿瘤(例如，外科手术移除一个或多个可见肿瘤)。在某些实施方案中，与没有施用的存活时间相比，对受试者的施用增加了受试者的存活时间。在其他实施方案中，所述方法进一步包括：向受试者施用免疫检查点抑制剂(例如，PD-1或PD-L1的抑制剂)。在某些实施方案中，所述受试者是人。
在其他实施方案中，本文提供了包含以下的组合物：树突状细胞(DC)，以及长度为8至100或8-250个氨基酸的人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽，其中所述组合物不含：i)全长ALDH1A1和ALDH1A3蛋白，和ii)肿瘤细胞和细胞裂解物。
在一些实施方案中，本文提供了包含以下的组合物：抗原冲击DC，其是已经用包含长度为8至100个或8至250个氨基酸的人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的冲击组合物在体外冲击的初始DC，其中所述冲击组合物不含：i)全长ALDH1A1和ALDH1A3蛋白，和ii)肿瘤细胞和细胞裂解物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含生理学上可耐受的缓冲液。
在其他实施方案中，本文提供了包含以下的系统和试剂盒：a)树突状细胞(DC)，和b)包含长度为8至100个氨基酸的人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的组合物，其中所述组合物不含：i)全长ALDH1A1和ALDH1A3蛋白，和ii)肿瘤细胞和细胞裂解物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含生理学上可耐受的缓冲液。在其他实施方案中，所述系统和试剂盒进一步包含：c)培养基(例如，包含IL-4和/或GM-CSF)。
在某些实施方案中，所述初始DC包括未成熟DC。在进一步的实施方案中，所述人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的长度在8与50个氨基酸之间(例如，长度为8…15…37…或50个氨基酸)。在某些实施方案中，所述人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽是人ALDH1A1(登记号NM_000689；SEQ ID NO:61)的一部分，或人ALDH1A3(登记号NM_000693，SEQ ID NO:62)的一部分。在一些实施方案中，所述人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的长度在8与23个氨基酸之间(例如，长度为8…10…12…15…19…21…和23个氨基酸)。在一些实施方案中，所述人ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的长度在8与10个氨基酸之间(例如，长度恰好为8、9或10个氨基酸)。
在一些实施方案中，所述组合物进一步不含长度大于250或大于100个氨基酸的ALDH1A1和ALDH1A3肽。在某些实施方案中，所述组合物进一步不含长度大于35个氨基酸的ALDH1A1和ALDH1A3肽。在其他实施方案中，所述组合物进一步不含长度大于10个氨基酸的ALDH1A1和ALDH1A3肽。在特定实施方案中，所述ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽包含SEQID NO:1-60中所示的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽包含SEQ ID NO:1和/或6中所示的氨基酸序列或由其组成。在进一步的实施方案中，所述ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽共同以至少50μg/ml(例如至少50…100…150…200…250…300…350…400…450…500…550…650…850…1000μg/ml或更高)的浓度存在于组合物中。
在某些实施方案中，施用抗原冲击DC的受试者患有选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、乳腺癌、***癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑癌、皮肤癌、鳞状细胞癌和结肠癌。在进一步的实施方案中，所述方法进一步包括用化疗剂治疗受试者。在其他实施方案中，所述方法进一步包括用放射治疗来治疗受试者。在特定实施方案中，所述癌细胞是癌症干细胞。
在进一步的实施方案中，所述受试者患有选自由以下组成的组的癌症：黑素瘤、乳腺癌、***癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌和结肠癌。在其他实施方案中，所述方法进一步包括用免疫剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)进一步治疗受试者。在其他实施方案中，所述方法进一步包括用化疗剂(例如，小分子)进一步治疗。在其他实施方案中，所述方法进一步包括用放射疗法(例如，外部束放射疗法)进一步治疗。在某些实施方案中，所述放射疗法包括内部放射疗法。在其他实施方案中，所述方法进一步包括先前用手术移除肿瘤进一步治疗受试者。
附图说明
图1示出了来自实施例1的程序，其用于产生暴露于ALHD1A1和/或ALDH1A3肽的DC以活化T细胞。
图2示出了在体外用ALDH1A1和/或ALDH1A3肽-DC刺激的CD3+T细胞对ALDH高CSC和ALDH低非CSC靶的细胞毒性。
图3示出了来自实施例2的方案，其用于在体内用ALHD1A1和/或ALDH1A3肽-DC疫苗预防肿瘤生长。
图4示出了ALDH1A1或ALDH1A3肽-DC疫苗如何显示出对D5肿瘤生长的显著抑制作用。
图5示出了组合的ALDH1A1和1A3肽-DC疫苗如何显示出对D5肿瘤生长的增加的抑制作用。
图6示出了ALHD1A1和/或ALDH1A3肽-DC疫苗如何显示出对D5肿瘤生长的增加的抑制作用。
图7示出了从用ALDH 1A1或1A3肽-DC疫苗处理的携带D5的小鼠的TIL分离的CD3+T细胞如何显示出对D5 ALDH高CSC的显著升高的杀伤作用。
图8示出了从用ALDH 1A1和/或1A3肽-DC疫苗处理的携带D5的小鼠分离的脾T细胞的细胞毒性，因为它们显示了对D5 ALDH高CSC的显著杀伤作用。
图9，第二行，示出了由ALDH 1A1和/或1A3肽-DC疫苗引发的脾T细胞响应于ALDH高D5 CSC分泌的IFN-γ的细胞内染色的流式细胞仪散点图。第一行示出了抗IFN-γ单克隆抗体的同种型对照的流式细胞仪散点图。
图10，第二行，示出了由ALDH 1A1和/或1A3肽-DC疫苗引发的脾T细胞响应于ALDH低D5非CSC分泌的IFN-γ的细胞内染色的流式细胞仪散点图。第一行示出了抗IFN-γ单克隆抗体的同种型对照的流式细胞仪散点图。
图11示出了为SEQ ID NO:61的全长人ALDH1A1(NM_000689)的氨基酸序列。在ALDH1A1肽SEQ ID NO:1周围示出了一个方框。
图12示出了为SEQ ID NO:62的全长人ALDH1A3(NM_000693)的氨基酸序列。在ALDH1A3肽SEQ ID NO:6周围示出了一个方框。
定义
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长动物、啮齿动物等(例如，其有待成为特定治疗的接受者，或从其收获癌症干细胞)。典型地，除非本文另外指明，否则术语“受试者”和“患者”可互换使用。
如本文所用，术语“受试者被怀疑患有癌症”是指呈现一种或多种指示癌症的体征或症状(例如，明显的块状物或肿块)或正在进行癌症筛查(例如，在常规体检期间)的受试者。被怀疑患有癌症的受试者也可能具有一种或多种风险因素。被怀疑患有癌症的受试者通常没有进行癌症检测。然而，“被怀疑患有癌症的受试者”涵盖已经接受初步诊断(例如，显示肿块的CT扫描)但尚未进行确认性测试(例如，活组织检查和/或组织学)或其癌症分期未知的个体。所述术语进一步包括曾经患有癌症的人(例如，缓解期的个体)。“被怀疑患有癌症的受试者”有时被诊断患有癌症，并且有时被发现没有癌症。
如本文所用，术语“被诊断患有癌症的受试者”是指已经被测试并发现具有癌细胞的受试者。可以使用任何合适的方法来诊断癌症，包括但不限于活组织检查、x射线、血液测试和本发明的诊断方法。“初步诊断”是仅基于视觉(例如，CT扫描或块状物的存在)和抗原测试的诊断。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或希望效果的组合物或治疗的量。有效量可以一个或多个施用、应用或剂量来施用并且不旨在限于具体制剂或施用途径。在某些实施方案中，给受试者施用有效量的ALDH1肽-DC。
如本文所用，术语“施用”是指向受试者给予ALDH1肽-DC疫苗、药物、前药或其他药剂或治疗性治疗的行为。施用至人体的示例性途径可以经由眼睛(眼用)、嘴(口腔)、皮肤(经皮)、鼻(鼻腔)、肺(吸入剂)、口腔粘膜(口腔)、耳、注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)和类似途径。
“共施用”是指向生理系统(例如，受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官)施用多于一种的化学药剂或治疗性治疗(例如，放射疗法)或手术或免疫检查点(例如，PD-1/PD-L1)抑制剂。相应化学药剂和治疗性治疗(例如，放射疗法)或手术或免疫检查点抑制剂(例如，PD-1/PD-L1)的“共施用”可以同时进行，或者以任何时间顺序或物理组合进行。
如本文所用，术语“药物”和“化疗剂”是指用于诊断、治疗或预防生理系统(例如，受试者，或体内、体外或离体细胞、组织和器官)中的疾病或病理状况的药理学活性分子。药物通过改变已向其施用所述药物的活生物体、组织、细胞或体外系统的生理机能来起作用。术语“药物”和“化疗剂”旨在涵盖抗过度增殖和抗肿瘤化合物以及其他生物治疗化合物。
具体实施方式
本发明涉及用于产生和使用ALDH1抗原冲击树突状细胞(DC)的组合物、系统、试剂盒和方法。在某些实施方案中，用包含ALDH1A1和/或ALDH1A3免疫原性肽的组合物在体外对初始DC进行冲击，以产生ALDH1抗原冲击DC，其中所述组合物不含肿瘤细胞、细胞裂解物和全长ALDH1蛋白。在一些实施方案中，向受试者施用ALDH1抗原冲击DC，以便至少部分地治疗癌症(例如，杀死受试者中至少一些ALDH高癌症干细胞)。
在某些实施方案中，采用下表1中示出的ALDH1A1或ALDH1A3肽(例如，长度为8-50个氨基酸)，其包含SEQ ID NO:1-60中所示氨基酸序列中的至少一个或由其组成。
表1-来自ALDH1A1和ALDH1A3的肽
在某些实施方案中，所述肽由SEQ ID NO:1-60之一中所示的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，所述肽更长，并且包括添加到SEQ ID NO:1-60中所示氨基酸序列的一端或两端中的另外的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述另外的氨基酸序列来自全长人ALDH1A1(SEQ ID NO:61)或ALDH1A3(SEQ ID NO:62)序列。
本发明不受在受试者中治疗的癌症干细胞类型的限制。癌症的实例包括但不限于：淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性粒单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，以及肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms'tumor)、子***、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。本发明也适用于肉瘤和上皮癌，诸如卵巢癌和乳腺癌。
在某些实施方案中，在用包含ALDH1肽冲击DC的组合物治疗患者之前，测试来自受试者的样品以确定患者是否拥有癌症干细胞(以及癌症干细胞的类型和数量)。可以分析和筛选受试者(例如，特定癌症患者的)癌症干细胞(例如，一旦分离并允许体外增殖)。例如，在一些实施方案中，分析受试者的癌症干细胞被用作受试者的诊断和治疗效果评估的参数。因此，在一些实施方案中，本发明提供了检测癌症干细胞生物标志物表达的方法，以鉴定患者是否具有特定的癌症干细胞或其组合。在一些实施方案中，直接测量表达(例如，在核酸或蛋白质水平)。在一些实施方案中，在组织样品(例如，活组织检查组织)中检测表达。在其他实施方案中，在体液(例如，包括但不限于血浆，血清，全血，粘液和尿液)中检测表达。在一些优选的实施方案中，通过测量细胞和组织(例如，癌细胞和组织)中癌症干细胞生物标志物的水平来检测癌症干细胞生物标志物。例如，在一些实施方案中，使用抗体或通过检测癌症干细胞生物标志物蛋白/核酸(例如，CD44、CD24、EpCam、CD49f、ALDH、mir-221、mir-110和/或mir-93)来监测癌症干细胞生物标志物。在一些实施方案中，在将细胞或组织从受试者移除后，对所述细胞或组织进行检测。在其他实施方案中，通过可视化存在于受试者体内的细胞和组织中的癌症干细胞生物标志物来进行检测。在一些实施方案中，通过测量组织样品(例如，癌组织)中对应mRNA的表达来检测癌症干细胞生物标志物。在一些实施方案中，通过Northern印迹分析检测RNA。Northern印迹分析包括RNA的分离和互补标记探针的杂交。
在某些实施方案中，将另外的治疗剂与本文的ALDH1肽-DC组合物一起施用。可以与本发明的药剂共施用或与本发明的药剂缔合的任何治疗剂均适用于本发明的方法。本发明的一些实施方案提供了用于施用至少一种另外的治疗剂(例如，包括但不限于化疗抗肿瘤剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗炎剂)和/或治疗技术(例如，手术介入、放射疗法)的方法。在某些实施方案中，治疗剂是免疫检查点抑制剂，诸如PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂(例如，抗PD-1和/或抗PD-L1 mAb)。在某些实施方案中，所述检查点抑制剂是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗。
预期在本发明的某些实施方案中使用各种抗肿瘤(例如，抗癌)剂。适用于本发明的抗癌剂包括但不限于：诱导细胞凋亡的药剂、抑制腺苷脱氨酶功能的药剂、抑制嘧啶生物合成的药剂、抑制嘌呤环生物合成的药剂、抑制核苷酸相互转化的药剂、抑制核糖核苷酸还原酶的药剂、抑制胸苷单磷酸(TMP)合成的药剂、抑制二氢叶酸还原的药剂、抑制DNA合成的药剂、与DNA形成加合物的药剂、损伤DNA的药剂、抑制DNA修复的药剂、嵌入DNA的药剂、使天冬酰胺脱氨基的药剂、抑制RNA合成的药剂、抑制蛋白质合成或稳定性的药剂、抑制微管合成或功能的药剂等。
在一些实施方案中，适用于本发明的示例性抗癌剂包括但不限于：1)生物碱，包括微管抑制剂(例如，长春新碱、长春碱和长春地辛等)、微管稳定剂(例如，紫杉醇(TAXOL)和多烯紫杉醇等)和染色质功能抑制剂，包括拓扑异构酶抑制剂，诸如表鬼臼毒素(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等)，以及靶向拓扑异构酶I的药剂(例如，喜树碱和伊立替康(CPT-11)等)；2)共价DNA结合剂(烷化剂)，包括氮芥类(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和白消安(MYLERAN)等)、亚硝脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)和其他烷化剂(例如，达卡巴嗪、羟甲基三聚氰胺、噻替哌和丝裂霉素等)；3)非共价DNA结合剂(抗肿瘤抗生素)，包括核酸抑制剂(例如，更生霉素(放线菌素D)等)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(红比霉素和柔红霉素(cerubidine))、阿霉素(亚德里亚霉素)和伊达比星(idarubicin、idamycin)等)、蒽二酮类(例如，蒽环类类似物，诸如米托蒽醌等)、博莱霉素(BLENOXANE)等，和普卡霉素(光神霉素)等；4)抗代谢物，包括叶酸拮抗剂(例如，甲氨蝶呤、FOLEX和MEXATE等)、嘌呤抗代谢物(例如，6-巯基嘌呤(6-MP、PURINETHOL)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷(CdA)和2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁)等)、嘧啶拮抗剂(例如，氟尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等)，以及胞嘧啶***糖苷(例如，CYTOSAR(ara-C)和氟达拉滨等)；5)酶，包括左旋门冬酰胺酶和羟基脲等；6)激素，包括糖皮质激素、抗***(例如，三苯氧胺等)、非甾体类抗雄激素(例如，氟他胺等)和芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑(ARIMIDEX)等)；7)铂化合物(例如，顺铂和卡铂等)；8)与抗癌药物、毒素和/或放射性核素等缀合的单克隆抗体；9)生物反应调节剂(例如，干扰素(例如，IFN-α等)和白细胞介素(例如，IL-2等)等)；10)过继免疫疗法；11)造血生长因子；12)诱导肿瘤细胞分化的药剂(例如，全反式维甲酸等)；13)基因疗法技术；14)反义疗法技术；15)肿瘤疫苗；16)针对肿瘤转移的疗法(例如，巴马司他等)；17)血管生成抑制剂；18)蛋白体抑制剂(例如，VELCADE)；19)乙酰化和/或甲基化抑制剂(例如，HDAC抑制剂)；20)NFκB的调节剂；21)细胞周期调节抑制剂(例如，CDK抑制剂)；22)p53蛋白功能调节剂；23)放射；和24)手术。
实验
提供以下实施例以展现并且进一步阐明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应理解为限制其范围。
实施例1
体外ALDH1肽-DC疫苗产生
本实施例描述了为产生树突状细胞-肽疫苗而进行的体外工作。
材料和方法
产生暴露于ALDH1A1和/或1A3肽的DC以活化CD3+T细胞的一般程序在图1中示出。
ALDH肽-DC的制备
树突状细胞(DC)获自正常雌性C57BL/6(B6)小鼠(杰克森实验室)的骨髓。在非组织培养皮氏培养皿(康宁公司(Corning))中以2-4×105个细胞/mL的浓度，将鼠骨髓来源的细胞在10-mL补充有20ng/mL GM-CSF的完全培养基(CM)中培养。在第3、6和8天，用GM-CSF更新半量CM。在第10天，用0.5mg/ml ALDH 1A1(SEQ ID NO:1)或/和1A3(SEQ ID NO:6)肽或ALDH高CSC裂解物(作为阳性对照)上样DC，并在5％CO2下于37℃孵育24小时。
用ALDH肽-DC引发了脾T细胞
从正常B6小鼠收获脾，并制成脾细胞单悬液。通过包括抗CD3偶联的微珠的MACS分离器试剂盒(加利福尼亚州奥本的MiltenyiBiotec.公司(MiltenyiBiotec.Inc.Auburn,CA))从脾细胞分离脾T细胞。然后，将脾CD3+T细胞与单个或双ALDH肽-DC，或与ALDH高CSC裂解物-DC共培养(活化和扩增)3天，如图1所示。
检查了CTL对ALDH高CSC的细胞毒性
然后，我们将ALDH高CSC作为靶细胞与如上所述引发的脾T细胞共培养6小时。之后，我们根据制造商的方案，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定(CytoTox 96非放射性细胞毒性测定，威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))检测了CTL的细胞毒性。
结果
在体外用ALDH 1A1或/和ALDH 1A3肽DC刺激的CD3+T细胞对ALDH高CSC对比ALDH低非 CSC的细胞毒性。
通过CD3微珠纯化来自正常B6小鼠的脾CD3+T细胞，并分别用PBS、ALDH 1A1肽-DC、ALDH1A3肽-DC、ALDH 1A1+1A3肽-DC或D5 CSC裂解物-DC刺激6小时。通过LDH释放测定测量由此类靶向ALDH高 CSC对比ALDH低 非CSC产生的CTL介导的细胞毒性。如图2所示，用ALDH 1A1和/或1A3肽引发的CTL表现出对ALDH高D5细胞的杀伤作用显著高于阴性对照：无负荷-DC引发的T细胞(所有p值<0.05)。重要的是，双(ALDH 1A1+1A3)肽-DC活化的T细胞高于单肽-DC活化的T细胞显著地杀死ALDH高CSC(分别为p＝0.0067和p＝0.0226)。然而，当ALDH低非CSC用作阴性靶对照时，未观察到由ALDH肽DC引发的T细胞引起的这些增加的杀伤作用。
实施例2
ALDH肽-DC的体内用途
本实施例描述了在小鼠体内使用ALDH肽-DC作为疫苗。
材料和方法
用ALDH肽-DC疫苗预防体内肿瘤生长的一般方案在图3中示出。
建立ALDH肽-DC疫苗保护性动物模型
为了在体内测试ALDH肽-DC疫苗对黑素瘤的保护作用，建立了相应的保护性动物模型。将所有小鼠分成5组，并且分别用PBS、ALDH 1A1肽-DC、ALDH 1A3肽-DC和ALDH 1A1+1A3肽-DC接种疫苗两次(第-14天和第-7天)。每只小鼠皮下接种2×106个DC/疫苗。在第0天，如图3所示，将0.5×106个D5细胞皮下注射到每只小鼠的侧腹中。
结果
ALDH 1A1或1A3肽-DC疫苗显示出对抑制D5肿瘤生长的显著保护作用。
在ALDH肽-DC疫苗保护性D5肿瘤模型中，在皮下接种每只小鼠0.5×106个D5细胞前两周，如图3所示用不同的疫苗对小鼠进行疫苗接种，并在一周后重复疫苗接种。如图4所示，与PBS处理的小鼠相比，ALDH 1A1或1A3肽-DC疫苗各自显著抑制皮下肿瘤生长(p<0.0001)。
ALDH 1A1加1A3肽-DC疫苗显示出对抑制D5肿瘤生长的累加保护作用
在上述实验的基础上，我们在保护性D5肿瘤模型中测试了由组合的双ALDH肽-DC疫苗产生的对肿瘤生长的影响。与之前一样，在肿瘤细胞注射前两周接种两次疫苗。如图5所示，与PBS处理的小鼠相比，ALDH 1A1或1A3肽-DC疫苗显著抑制皮下肿瘤生长(p<0.0001)，这很好地复制了如图4所示的我们的早期发现。重要的是，与单个ALDH 1A1肽-DC疫苗相比，ALDH 1A1+1A3肽-DC疫苗对肿瘤生长发挥显著的(p＝0.018)抑制，并且当与单个ALDH 1A3肽-DC疫苗相比时，明显更强地(p＝0.082)抑制肿瘤生长。图6示出了实验结束时切除肿瘤的代表性图片，证实了双肽-DC疫苗可以诱导比单肽-DC疫苗更高的肿瘤生长抑制。
实施例3
免疫功能测定
本实施例描述了免疫功能测定，以关联ALDH 1A1和1A3肽-DC疫苗效率。
材料和方法
TIL扩增和分离
在实验结束时，从所有小鼠移除肿瘤。将所有肿瘤切成小块(1-8mm3)，同时用1×胶原酶/透明质酸酶(Stem Cell Technologies)进一步消化30分钟，并且最终制成单细胞悬液。然后在非组织培养六孔(康宁公司)中以1-2×106个细胞/mL的浓度，将所述单细胞悬液在5mL补充有3000IU/mL IL-2的完全培养基(CM)中培养7-10天。每3天用具有IL-2的CM更换六孔板。收集悬浮细胞，并通过40μm尼龙细胞过滤器过滤。通过如上所述的MACS分离器试剂盒(加利福尼亚州奥本的MiltenyiBiotec.公司)从所述悬浮细胞分离CD3+TIL。
细胞内IFN-γ染色
为了测定IFN-γ细胞内分泌，用预先冷冻的Perm缓冲液III(BD生物科学公司(BDBioscience))在4℃下对如上所述用肽-DC引发的T细胞进行30分钟的渗透。在用PBS洗涤一次后，将细胞用FITC标记的抗小鼠IFN-γ在4℃下染色30分钟。使用LSRII流式细胞仪(BD生物科学公司)监测所有样品，并且最后通过FlowJo TM版本10软件(美国俄勒冈州阿什兰市的Tree Star公司(Tree Star,Inc.,Ashland,OR,USA))进行分析。
结果
来自用ALDH 1A3肽-DC进行疫苗接种的D5荷瘤小鼠的CD3+TIL显示出对ALDH高CSC 的显著提高的杀伤作用
分别从用PBS、ALDH 1A1肽-DC或ALDH 1A3肽-DC进行疫苗接种的小鼠的切除的残余肿瘤组织分离CD3+TIL。在一周的IL-2扩增后，将这些TIL与作为靶细胞的D5 ALDH高CSC或ALDH低非CSC一起孵育。通过LDH释放测定测量由靶向ALDH高CSC对比ALDH低非CSC的CD3+TIL介导的细胞毒性。如图7所示，与PBS对照相比，来自ALDH 1A3肽-DC疫苗接种小鼠的CD3+TIL显著杀死了ALDH高D5 CSC(p＝0.0055)。重要的是，来自ALDH 1A3肽DC疫苗接种小鼠的CD3+TIL表现出对ALDH高CSC的杀伤作用明显高于对ALDH低非CSC的杀伤作用(p＝0.0297)。
ALDH 1A1 +1A3肽-DC疫苗赋予脾T细胞对D5 ALDH高CSC的显著更高的细胞毒性
如实验结束时所示(图8)，从经受各种处理的动物收获脾。如图8所示，以10:1的E(效应)与T(靶)比率，从ALDH 1A1、1A3或1A1+1A3肽DC疫苗接种小鼠分离的脾T细胞对ALDH高D5细胞所发挥的杀伤作用分别强于来自PBS处理小鼠的脾T细胞(p＝0.125，p＝0.0369和p＝0.0294)。此外，与单肽(ALDH1A1)-DC疫苗相比，双(ALDH1A1+1A3)肽-DC疫苗展示出更好的对CSC的细胞毒性(p＝0.0656，接近p<0.05)。重要的是，双肽-DC疫苗诱导的对ALDH高CSC的细胞毒性明显优于ALDH低非CSC(p＝0.0073)。
通过IFN-γ分泌确定对D5 ALDH高CSC对比ALDH低非CSC的CTL响应
将来自不同免疫小鼠的脾CTL与ALDH高CSC和ALDH低非CSC共培养过夜。然后将CTL用IFN-γ进行细胞内染色，以通过流式细胞术分析来评价针对CSC对比非CSC的免疫响应。如图9所示，与来自PBS处理小鼠的1.79％IFN-γ细胞内染色的T细胞相比，当靶向CSC时，分泌IFN-γ的脾T细胞的比例明显增加是由ALDH肽：1A1(2.76％)、1A3(3.83％)和双1A1+1A3(7.18％)-DC疫苗赋予的。然而，这些增强的T细胞响应不能由非CSC引起(图10)。
以上说明书中提到的所有公布和专利以引用方式并入本文。本发明的所描述组合物和方法的各种改进和变化对于本领域技术人员是显而易知的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定优选实施方案描述了本发明，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于此类特定实施方案。事实上，相关领域技术人员显而易知的执行本发明的所描述模式的各种改进预期在本发明的范围内。
序列表
<110> 密歇根大学的董事会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN)
<120> ALDH1抗原冲击树突状细胞
<130> UM-35523/WO-1/ORD
<150> US 62/614,591
<151> 2018-01-08
<160> 62
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Met Ala Thr Ala Asn Gly Ala Val Glu Asn Gly Gln Pro Asp Arg Lys
1 5 10 15
Pro Pro Ala Leu Pro Arg Pro Ile Arg Asn Leu Glu Val Lys Phe Thr
20 25 30
Lys Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Glu Ser Lys Ser Gly Lys Lys
35 40 45
Phe Ala Thr Cys Asn Pro Ser Thr Arg Glu Gln Ile Cys Glu Val Glu
50 55 60
Glu Gly Asp Lys Pro Asp Val Asp Lys Ala Val Glu Ala Ala Gln Val
65 70 75 80
Ala Phe Gln Arg Gly Ser Pro Trp Arg Arg Leu Asp Ala Leu Ser Arg
85 90 95
Gly Arg Leu Leu His Gln Leu Ala Asp Leu Val Glu Arg Asp Arg Ala
100 105 110
Thr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Met Asp Thr Gly Lys Pro Phe Leu His
115 120 125
Ala Phe Phe Ile Asp Leu Glu Gly Cys Ile Arg Thr Leu Arg Tyr Phe
130 135 140
Ala Gly Trp Ala Asp Lys Ile Gln Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asp Asp
145 150 155 160
Asn Val Val Cys Phe Thr Arg His Glu Pro Ile Gly Val Cys Gly Ala
165 170 175
Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Leu Val Trp Lys Leu Ala
180 185 190
Pro Ala Leu Cys Cys Gly Asn Thr Met Val Leu Lys Pro Ala Glu Gln
195 200 205
Thr Pro Leu Thr Ala Leu Tyr Leu Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ala Gly
210 215 220
Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly Phe Gly Pro Thr Val
225 230 235 240
Gly Ala Ala Ile Ser Ser His Pro Gln Ile Asn Lys Ile Ala Phe Thr
245 250 255
Gly Ser Thr Glu Val Gly Lys Leu Val Lys Glu Ala Ala Ser Arg Ser
260 265 270
Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Cys Ile
275 280 285
Val Cys Ala Asp Ala Asp Leu Asp Leu Ala Val Glu Cys Ala His Gln
290 295 300
Gly Val Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Thr Ala Ala Ser Arg Val
305 310 315 320
Phe Val Glu Glu Gln Val Tyr Ser Glu Phe Val Arg Arg Ser Val Glu
325 330 335
Tyr Ala Lys Lys Arg Pro Val Gly Asp Pro Phe Asp Val Lys Thr Glu
340 345 350
Gln Gly Pro Gln Ile Asp Gln Lys Gln Phe Asp Lys Ile Leu Glu Leu
355 360 365
Ile Glu Ser Gly Lys Lys Glu Gly Ala Lys Leu Glu Cys Gly Gly Pro
370 375 380
Ala Met Glu Asp Lys Gly Leu Phe Ile Lys Pro Thr Val Phe Ser Glu
385 390 395 400
Val Thr Asp Asn Met Arg Ile Ala Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val
405 410 415
Gln Pro Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ile Glu Glu Val Ile Lys Arg Ala
420 425 430
Asn Ser Thr Asp Tyr Gly Leu Thr Ala Ala Val Phe Thr Lys Asn Leu
435 440 445
Asp Lys Ala Leu Lys Leu Ala Ser Ala Leu Glu Ser Gly Thr Val Trp
450 455 460
Ile Asn Cys Tyr Asn Ala Leu Tyr Ala Gln Ala Pro Phe Gly Gly Phe
465 470 475 480
Lys Met Ser Gly Asn Gly Arg Glu Leu Gly Glu Tyr Ala Leu Ala Glu
485 490 495
Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Ile Lys Leu Gly Asp Lys Asn Pro
500 505 510