使用球状体的细胞系统以及制造和使用它们的方法
阅读说明：本技术 使用球状体的细胞系统以及制造和使用它们的方法 (Cell systems using spheroids and methods of making and using them ) 是由 M·J·穆尔 J·L·科尔里 A·D·沙尔玛 D·波泽尔 J·本恩 于 2018-12-04 设计创作，主要内容包括：本公开总体上涉及细胞培养系统,并且特别地涉及用于神经元细胞的三维细胞培养系统,所述三维细胞培养系统促进模拟体内神经纤维的结构与功能特征的结构与功能特征,包括细胞髓鞘形成。利用双重水凝胶构建体以及包含神经元细胞的球状体,本公开提供了用于允许细胞内和细胞外电生理学测量和记录的体外空间受控的三维模型的方法、装置和系统。所述三维水凝胶构建体允许掺入的细胞类型、几何制造以及电操纵的灵活性,从而提供了用于培养、干扰以及测试具有生理相关结果的仿生神经生长的可行的系统。(The present disclosure relates generally to cell culture systems, and in particular to three-dimensional cell culture systems for neuronal cells that facilitate structural and functional features that mimic structural and functional features of nerve fibers in vivo, including cell myelination. The present disclosure provides methods, devices and systems for spatially controlled three-dimensional models in vitro that allow for intracellular and extracellular electrophysiological measurements and recordings, using dual hydrogel constructs and spheroids comprising neuronal cells. The three-dimensional hydrogel constructs allow flexibility in the type of cell incorporated, geometric fabrication, and electrical manipulation, providing a viable system for culturing, perturbing, and testing biomimetic nerve growth with physiologically relevant results.)
关于联邦资助研究的声明
本发明是NIH STTR批准号R42-TR001270的政府支助下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请是指定***合众国并根据35 U.S.C.§120提交的国际申请，其要求2017年12月4日提交的美国临时申请号62/594,525的优先权，该临时申请通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及细胞培养系统，并且具体地涉及针对球状体的三维细胞培养系统，该三维细胞培养系统促进模拟体内神经纤维的结构与功能特性的结构与功能特性，包括细胞髓鞘形成和复合动作电位的传播。
发明背景
复制生理学的功能方面以进行台式评估对于外周神经元组织尤其具有挑战性，在外周神经元组织中，长距离的生物电传导是最相关的生理结果之一。因此，外周神经的三维组织模型滞后于上皮组织、代谢组织以及肿瘤组织的模型，在这些模型中，可溶性分析物可充当适当的指标。电生理技术的应用最近已有可能通过多电极阵列技术用于环境毒素的筛查以及疾病建模和治疗测试。该应用对外周神经系统(PNS)和中枢神经系统(CNS)应用的研究是突破性的，但培养物的离解性质未能复制对外周组织至关重要的群体水平环境和指标。取而代之的是，研究外周神经病变和神经保护的临床方法包括通过利用皮肤活检物的形态测定分析测量复合动作电位(CAP)和神经纤维密度(NFD)来进行神经传导测试。
发明内容
本公开涉及神经系统的微生理模型，该模型提供了3D构造以及指定的组织。其他模型系统往往只允许其中一种。器官型组织切片可提供3D构造以及按性质指定的组织，但这些模型不适合很高的通量的分析。
本公开涉及包含细胞球状体的组合物，该细胞球状体包含选自以下的细胞和/组织中的一种或组合：神经元细胞、神经系统神经节、干细胞以及免疫细胞。在一些实施方案中，该球状体包含选自以下的组织：背根神经节以及三叉神经节。在一些实施方案中，该球状体包含选自以下的一个或多个细胞：胶质细胞、胚细胞、间充质干细胞、衍生自诱导多能干细胞的细胞、交感神经元、副交感神经元、脊髓运动神经元、中枢神经系统神经元、外周神经系统神经元、肠神经系统神经元、运动神经元、感觉神经元、胆碱能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、羟色胺能神经元、中间神经元、肾上腺素能神经元、三叉神经节、星形细胞、少突细胞、施万(Schwann)细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、卫星细胞、肠胶质细胞以及垂体细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个胶质细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个胚细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个间充质干细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个衍生自诱导多能干细胞的细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个副交感神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个脊髓运动神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个中枢神经系统神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个外周神经系统神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个肠神经系统神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个运动神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个感觉神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个中间神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个胆碱能神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个γ-氨基丁酸能神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个谷氨酸能神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个多巴胺能神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个羟色胺能神经元。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个三叉神经节细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个星形细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个少突细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个施万细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个小胶质细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个室管膜细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个放射状胶质细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个卫星细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个肠胶质细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个垂体细胞。
在一些实施方案中，该球状体包含选自以下的免疫细胞中的一种或组合中的一者或多者：T细胞、B细胞、巨噬细胞以及星形细胞。在一些实施方案中，该球状体包含选自以下的干细胞中的一种或组合中的一者或多者：胚胎干细胞、间充质干细胞以及诱导多能干细胞。在一些实施方案中，该神经元细胞衍生自选自以下的干细胞：胚胎干细胞、间充质干细胞以及诱导多能干细胞。实施方案包括上述细胞类型中的每一种，它们彼此独立或组合在一起。
在一些实施方案中，该球状体具有约200微米至约700微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约150微米至约800微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约200微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约300微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约400微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约500微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约600微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约700微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约800微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约900微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约350微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约450微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约550微米的直径。在一些实施方案中，该球状体具有约650微米的直径。
在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个神经元细胞以及一个或多个施万细胞，细胞类型的比率等于每1个施万细胞约4个神经元细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个神经元细胞以及一个或多个星形细胞，其比率等于每1个星形细胞约4个神经元细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个神经元细胞以及一个或多个星形细胞，其比率等于每1个星形细胞约1个神经元细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个神经元细胞以及一个或多个施万细胞，其比率等于每1个施万细胞约10个神经元细胞。在一些实施方案中，该球状体包含一个或多个神经元细胞以及一个或多个胶质细胞，其比率等于每1个胶质细胞约4个神经元细胞。
在一些实施方案中，本文所述细胞中的任一个或多个是从诱导多能干细胞分化而来。在一些实施方案中，该球状体不含诱导多能干细胞和/或免疫细胞。在一些实施方案中，该球状体不含未分化的干细胞。
在一些实施方案中，该球状体包含不少于约30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000或75,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于75,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于65,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于60,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于100,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于125,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于150,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于175,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于200,000个细胞。
在一些实施方案中，该球状体包含不少于225,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于250,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含不少于12,500个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含约12,500个细胞至约250,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含约12,500个细胞至约100,000个细胞。在一些实施方案中，该球状体包含约12,500个细胞至约75,000个细胞。
在一些实施方案中，该球状体进一步包含一个或多个磁性颗粒。在一些实施方案中，该磁性颗粒包含一个或多个中空的内部。在一些实施方案中，该磁性颗粒包含一层或多层聚合物，所述细胞在其上形成球状体。
本公开还涉及系统，该系统包括：(i)细胞培养容器，其包含水凝胶；(ii)一个或多个球状体，该球状体包含一个或多个神经元细胞和/或分离的组织外植体；(iii)放大器，其包括电流发生器；(iv)电压表和/或电流表；以及(v)至少第一刺激电极和至少第一记录电极；其中放大器、电压表和/或电流表和电极通过电路彼此电连接，在电路中电流从放大器被馈送到至少一个刺激电极，并且电流被接收在记录电极处并被馈送到电压表和/或电流表；其中刺激电极被定位在神经元细胞和/或分离的组织外植体的一个或多个胞体处或其邻近处，并且记录电极被定位在该胞体远端的预定距离处，以使得跨越所述细胞培养容器建立电场。在一些实施方案中，该球状体是本文所述的球状体中的任一种。
在一些实施方案中，该培养容器包括96、192、384个或更多个内部腔室。在一些实施方案中，该96、192、384个或更多个内部腔室包括一个或多个分离的施万细胞和/或一个或更多个少突细胞，其与所述一个或多个分离的组织外植体和/或所述一个或多个神经元细胞足够邻近，使得施万细胞或少突细胞沉积髓磷脂以使轴突从组织外植体和/或神经元细胞生长。
在一些实施方案中，该系统进一步包括水凝胶基质交联于其上的固体衬底，所述固体衬底包括至少一个具有直径为约1微米至约5微米的孔隙的塑料表面。在一些实施方案中，该固体衬底包括连续外表面和内表面，此类固体衬底包括至少一个呈圆柱形或基本圆柱形的形状的部分和至少一个中空内部，该中空内部在其边缘处由所述内表面的至少一部分限定，所述内表面包含一个或多个直径约0.1微米至约1.0微米的孔隙，其中该固体衬底的中空内部可从该固体衬底外部的点通过至少一个开口进入；其中中空内部部分包括邻近所述开口的第一部分和位于所述开口的远端的至少第二部分；其中所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体被定位在中空内部的第一部分处或其邻近处，并且与水凝胶基质物理接触，并且其中所述至少一个中空内部的第二部分与第一部分流体连通，使得轴突能够从一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体生长到中空内部的第二内部部分中。
在一些实施方案中，该系统或组合物不含海绵。在一些实施方案中，该水凝胶包含至少第一细胞不可穿透的聚合物和第一细胞可穿透的聚合物。在一些实施方案中，所述至少一种细胞不可穿透的聚合物包含不大于约15％的PEG，并且所述至少一种细胞可穿透的聚合物包含约0.05％至约1.00％的选自以下的自组装肽中的一种或组合：RAD 16-I、RAD16-II、EAK 16-I、EAK 16-II以及dEAK 16。在一些实施方案中，该组合物不含聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，该水凝胶包括第一区域和第二区域，该第一区域是以圆柱体或矩形棱柱体的形状形成，以其纵轴穿过细胞培养容器的顶部和底部，并且圆柱体或矩形棱柱体中的每一者均包括由圆柱体或矩形棱柱体的内表面限定的空间，所述空间可经由一个或多个开口通过细胞培养容器的顶部进入；其中该第二区域包括以其内壁形状形成的空间，其侧面上的开口与该第一区域毗邻并与第一区域流体连通。在一些实施方案中，该水凝胶包含至少1％的聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，该系统进一步包括细胞培养基，该细胞培养基包含约5至约20皮克/毫升的浓度的神经生长因子(NGF)，和/或约0.001％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。
在一些实施方案中，该系统包含一个或多个球状体，所述球状体包含选自以下的细胞的至少一种或组合：胶质细胞、胚细胞、间充质干细胞、衍生自诱导多能干细胞的细胞、交感神经元、副交感神经元、脊髓运动神经元、中枢神经系统神经元、外周神经系统神经元、肠神经系统神经元、运动神经元、感觉神经元、胆碱能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、羟色胺能神经元、中间神经元、肾上腺素能神经元、三叉神经节神经元、星形细胞、少突细胞、施万细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、卫星细胞、肠胶质细胞以及垂体细胞。在一些实施方案中，该系统进一步包括一个或多个干细胞、多能细胞、成肌细胞以及成骨细胞。在一些实施方案中，该一个或更多个神经元细胞包括源自哺乳动物的外周神经系统的原代哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，该球状体的培养时间不少于约3、30、90或365天。
在一些实施方案中，固体衬底的至少一部分是圆柱形或基本上是圆柱形，使得固体衬底内表面的至少一部分限定了球状***于其中的圆柱形或基本圆柱形的中空内部腔室。在一些实施方案中，该水凝胶包含一系列两个或更多个通过一系列通道彼此流体连通的腔体，至少一个腔体包含球状体，并且至少第二腔体包含第二球状体、细胞的悬浮液，或DRG；其中该球状体和第二球状体、细胞的悬浮液，或DRG是通过三维轴突连接的。在一些实施方案中，该腔体是具有定位于固体衬底的水平或基本上水平的面中的U形孔或圆形孔的孔，其中每个通道包括一个或多个轴突，其连接一个或多个球状体。
在一些实施方案中，该一个或多个球状体包含一个或多个神经元细胞，其轴突在宽度上生长了约100微米至约500微米，并且在长度上生长了约0.11微米至约10000微米。在一些实施方案中，三维轴突在其最低点处的高度为至少约10微米，或者在高度上为至少三个细胞单层。
在一些实施方案中，该系统包括第一球状体，该球状体包含：(i)一个或多个神经元细胞；和/或(ii)一个或多个施万细胞或少突细胞；并且第二球状体包含：(i)一个或多个外周神经元；其中每个球状体均定位于腔体中。在一些实施方案中，该系统包括第一腔体、第二腔体以及第三腔体，每个腔体均被配置成容纳球状体和至少50微升的细胞培养基，其中该腔体对齐，使得第一腔体被定位在第二腔体的近端并且在第三腔体的远端。在一些实施方案中，该系统包括至少第四腔体，各腔体按使得每个腔体限定正方形的角的图案定位于其中。在一些实施方案中，该腔体对齐成线，使得源自第一腔体中第一球状体的轴突延伸至第二腔体，并且来自第二腔体中球状体的轴突延伸至第三腔体中的轴突。
本公开还涉及在培养容器中制造一个或多个球状体的三维培养物的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)使一个或多个神经元细胞与固体衬底接触，所述衬底包括至少一个外表面、至少一个内表面以及至少一个由至少一个内标限定并且可从固体衬底外部的点通过至少一个开口进入的内部腔室；(b)将一个或多个包含神经元细胞的球状体定位到至少一个内部腔室中；以及(c)将细胞培养基施加到培养容器中，细胞培养基的体积足以覆盖至少一个球状体；其中内表面的至少一部分包括第一细胞不可穿透的聚合物以及第一细胞可穿透的聚合物。在一些实施方案中，步骤(b)包括定位包含选自以下中的一种或组合的组织外植体的球状体：分离的背根神经节、脊髓外植体、视网膜外植体以及皮质外植体。
在一些实施方案中，该球状体是作为选自以下中的一种或组合的神经元细胞的悬浮液形成的：运动神经元、感觉神经元、交感神经元、副交感神经元、皮质神经元、脊髓神经元、外周神经元，其任选地衍生自干细胞。在一些实施方案中，该球状体是由选自以下中的一种或组合的神经元细胞的悬浮液形成的：运动神经元、感觉神经元、交感神经元、副交感神经元、皮质神经元、脊髓神经元、外周神经元，其任选地衍生自干细胞。在一些实施方案中，该球状体进一步包含分离的施万细胞和/或少突细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括步骤(d)：让所述球状体在步骤(c)后生长神经突和/或轴突持续约12小时至约1年的时间。在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在步骤(a)之前从样本分离一个或多个神经细胞；和/或如果所述一个或多个球状体包含DRG，则在步骤(b)之前从一个或多个哺乳动物分离背根神经节(DRG)；和/或如果所述一个或多个球状体包含施万细胞或少突细胞，则分离一个或多个施万细胞和/或一个或多个少突细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括将至少一个刺激电极定位在一个或多个神经元细胞或组织外植体的胞体处或其邻近处，并且将至少一个记录电极定位在距该胞体最远的点处的轴突处或其邻近处，使得在将电流引入到刺激电极中后，记录电极能够接收到对应于一个或多个能够在记录电极处被测量的电生理指标的信号；其中所述一个或多个电生理指标是以下中的一种或组合：电导速度、动作电位、与沿一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、沿一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期，以及沿一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。
本公开还涉及评价剂的毒性和/或神经保护效应的方法，其包括：(a)在本文公开的任何组合物中培养一个或多个球状体；(b)使至少一种剂暴露于所述一个或多个球状体；(c)测量和/或观测所述一个或多个球状体的一种或多种形态测定变化和/或一种或多种电生理指标；以及(d)将所述一个或多个球状体的一种或多种形态测定变化和/或一种或多种电生理指标与所述剂的毒性关联，使得如果该形态测定变化和/或电生理指标指示细胞活力降低，则所述剂被表征为有毒性，并且如果形态测定变化和/或电生理指标指示细胞活力无变化或增大，则所述剂被表征为无毒性和/或有神经保护作用。
本公开还涉及测量一个或多个球状体的一个或多个轴突的髓鞘形成或髓鞘脱失的方法，其包括：(a)在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下，在剂存在或不存在的情况下，在本文公开的任何组合物中培养一个或多个球状体；以及(b)检测来自一个或多个球状体的一个或多个轴突上的髓鞘形成量；其中检测任选地包括以下步骤：(i)测量和/或观测在剂存在或不存在的情况下所述一个或多个球状体的一种或多种形态测定变化和/或一个或多个电生理指标；以及(ii)将在剂存在或不存在的情况下所述一个或多个球状体的一种或多种形态测定变化和/或一个或多个电生理指标与该球状体的髓鞘形成的定量或定性变化关联。
本公开还涉及检测和/或定量神经元细胞生长和/或轴突变性的方法，其包括：(a)定量一个或多个球状体和/或从球状体生长的轴突数目或密度；(b)将所述一个或多个球状体培养在本文公开的任何组合物中；以及(c)在培养该球状体一段足以允许该球状体中一个或多个轴突生长或细胞生长的时间后，计算该球状体内细胞的数目和/或从该组合物中的球状体生长的轴突的数目或密度。在一些实施方案中，步骤(b)任选地包括使一个或多个球状体与一种或多种剂接触。在一些实施方案中，步骤(c)任选地包括在培养一个或多个球状体后检测此类一个或多个球状体的内部和/或外部记录，以及将该记录与对应于已知或对照数目的细胞的相同记录的测量结果关联。在一些实施方案中，步骤(c)任选地包括以下附加步骤：(i)在使所述一个或多个球状体与一种或多种剂接触的步骤之前以及之后测量胞内记录和/或胞外记录和/或形态测定变化；以及(ii)将在使一个或多个球状体与一种或多种剂接触之前的记录和/或形态测定变化和在使所述一个或多个球状体与一种或多种剂接触之后的记录和/或形态测定变化的差异，与细胞数目和/或轴突的数目或密度的变化相关联。
本公开还涉及测量或定量剂的神经调节作用的方法，其包括：(a)在所述剂存在以及不存在的情况下，在本文公开的任何组合物中培养一个或多个球状体；(b)在所述剂存在以及不存在的情况下，跨越一个或多个球状体施加电压电位；(c)测量在所述剂存在以及不存在的情况下来自所述一个或多个球状体的一个或多个电生理指标；以及(d)将通过所述一个或多个球状体的一个或多个电生理指标的差异与所述剂的神经调节作用相关联，使得在存在所述剂的情况下的电生理指标与在不存在所述剂的情况下测得的电生理指标相比的变化指示神经调节作用，并且在存在所述剂的情况下的电生理指标与在不存在所述剂的情况下测得的电生理指标相比无变化指示所述剂未赋予神经调节作用。
本公开还涉及测量或定量剂的神经调节作用的方法，其包括：(a)将一个或多个球状体在所述剂存在以及不存在的情况下培养在本文公开的任何组合物中；(b)测量和/或观测在所述剂存在以及不存在的情况下所述一个或多个球状体的一种或多种形态测定变化；以及(c)将一种或多种形态测定变化与所述剂的神经调节作用相关联，使得在所述剂存在的情况下的形态测定结果与在所述剂不存在的情况下测得和/或观测到的形态测定结果相比的变化指示神经调节作用，并且在所述剂存在情况下的形态测定结果与在所述剂不存在的情况下测得和/或观测到的形态测定结果相比无变化指示所述剂未赋予神经调节作用。
附图说明
图1A至图1B示出了用于神经芯片(nerve-on-a-chip)设计的制造的3D水凝胶支架(scaffolding)。
图2示出了水凝胶内的代表性球状体和轴突生长。水凝胶构建体能够指导并限制3D轴突生长和细胞定位以便模拟神经纤维束。
图3示出了可在背根神经节的神经节处、近端束处、该束的中点处以及远端束处进行的形态学和生理学测量的列表。
图4示出了在背根神经节近端、中点以及神经节远端的无髓鞘神经纤维束的共聚焦图像叠层：用β-III微管蛋白染色以显示神经突，用DAPI染色以显示核，以及用S100染色以显示施万细胞。
图5示出了显示出3D神经突密度的共聚焦深度图。
图6A至图6C示出了神经培养物横截面的透射电子显微镜检查(TEM)。图6A示出了在通道中距离神经节约1.875mm的高密度的平行、成束的无髓鞘神经突。图6B示出了以距离神经节约1mm的由施旺细胞(SC)封装的轴突(Ax)为中心的焦点。图6C示出了25天培养物中单个神经纤维周围的髓鞘。
图7A至图7B示出了共聚焦图像的三维渲染。图7A示出了MBP蛋白的免疫组织化学。图7B示出了MAG的免疫组织化学。二者的培养物厚度均为190μm，证实了该体外系统的三维髓磷脂形成能力。
图8示出了神经突从由衍生自诱导多能干细胞的人神经元形成的球状体长出。神经突从与星形细胞(左)和施万(Schwann)细胞(右)一起共培养的人运动神经元球状体起在2D表面上延伸。
图9示出了在3D水凝胶系统中生长的运动神经元和星形细胞的球状体。这些球状体显示出稳健的3D神经突长出(约5mm)。
图10示出了从人运动神经元/施万细胞球状体(上图)和人感觉神经元(下图)起在3D上延伸的神经突。
图11示出了96孔球状体印刷驱动器(printing drive)。96孔板位于驱动器顶部，在每个孔的中心有效地放置一块磁体。然后，磁化细胞被磁体吸引，从而导致聚集并允许球状体形成。
图12示出了用于制备大鼠脊髓球状体的方案。可以通过将磁性纳米颗粒添加到培养的细胞中并在磁体上方的非粘附板中培养来形成球状体。(未示出：也可通过在存在磁性纳米颗粒的非粘附圆形底板中旋转而形成球状体。)在添加水凝胶生长基质的同时，可用磁体将一个或多个磁性细胞球状体维持在适当的位置。
图13示出了用于将磁性球状体放入水凝胶空隙的装置。这种设计的外部部分的中心有磁体。深灰色部分允许在y方向上移动，并且内部/最上方的零件容置玻璃载玻片，对准该***物，并允许在x方向上移动。中心处的单个磁体允许控制需要单个磁体的构建体的放置，而无需考虑构建体的形状。其他装置设计包含多个磁体，用于将球状体放置在连接的孔中。
图14A至图14B示出了球状体在水凝胶构建体中的放置。如β-III微管蛋白染色所指示的，神经突从大鼠胚胎脊髓球状体的长出符合外模的水凝胶形态。图14A示出了当不使用磁体时球状体的错误放置。图14B示出了使用图13中所示装置时的正确放置。
图15示出了显示球状体生产再现性的条形图。相同的球状体形成方法达到了批次间一致性。27,000个细胞的球状体的平均直径为0.47±0.03mm，在xy方向上的圆形度为0.72±0.15。
图16A至图16B示出了细胞球状体的代表性相位图和活力。这些图示出了来自原代胚胎大鼠脊髓细胞的可再现、成形良好的球状体形成的实例，其显示出一致的大小和形状。
图17示出了在1:20稀释的基质胶中神经突从球状体长出。神经突被局限于3D环境中生长允许通道。神经突生长到厚度为大约100-150μm。
图18示出了在明胶甲基丙烯酸酯水凝胶中使用与施万细胞球状体组合在一起的背根神经节(DRG)外植体创建的限定回路。这种配置允许DRG神经突单向长出。
图19示出了在1:20稀释的基质胶中用多个施万细胞球状体创建的被布置成矩形形式的限定回路。
图20示出了使用磁性球状体生产神经微生理系统的方法的示意图。数字投影光刻技术可用于固化允许生长的水凝胶包含在其中的水凝胶“模具”。
图21示出了使用纳米梭将球状体放置在微图案化水凝胶内的3D球状体接种。可以通过将磁性纳米颗粒添加到培养的细胞中并在磁体上方的非粘附板中培养来形成球状体。当添加水凝胶生长基质时，可用磁体将一个或多个磁性细胞球状体保持在适当的位置。
图22示出了条形图，其显示接种的细胞数目影响球状体的直径。
图23A至图23B示出了球状体的活力和3D结构。图23A：钙黄绿素染色指示由原代大鼠胚胎脊髓组织形成的球状体中的细胞具有高活力。图23B：用荧光片显微镜检查获得的水凝胶构建体中β-III微管蛋白染色的球状体的横截面图证明了球状体的3D结构。
图24示出并入了不同细胞类型的球状体。如抗体染色所指示的，球状体中存在神经元(β-III)、少突细胞系细胞(Olig2)、星形细胞(GFAP)以及小胶质细胞和巨噬细胞(CDIIb)。
图25示出了使用球状体和微图案化水凝胶的3D神经网络形成。如钙黄绿素染色所示，由大鼠胚胎DRG细胞(左)形成的球状体使神经突向甲基丙烯酸化明胶中的脊髓球状体(右)延伸，但反之则不然。
图26示出了多个处于固定位置和与外模几何形状一致的神经网络中的脊髓球状体的放置。
图27示出了在人肌肉肌细胞和肌管的顶部上生长的共培养iPSC衍生的运动神经元的共聚焦图像(顶部为10x，底部为20x)。允许肌细胞在生长培养基中分化3天，然后添加运动神经元并将培养基切换为运动神经元培养基。
图28描绘了形成表达重链肌球蛋白的3D鞘的成熟肌管的2D培养物的共聚焦图像(10x)。将肌管培养3周：在生长培养基中培养3天，在分化培养基中培养7天，其余时间在生长培养基中培养。
图29示出了在培养物中3周后封装在5％GelMA中的3D肌肉细胞的10x相衬图像。
图30示出了在培养物中3周后表达结蛋白的人骨骼肌管的255μM 10x最大强度投影Z-堆栈。
图31示出了在GelMA培养物中3周后表达重链肌球蛋白的人骨骼肌管的96μM 10x最大强度投影Z-堆栈。
图32示出了诱导的神经元在不同视密度(seeing density)下在悬垂液滴中的3D球状体生成。
图33示出了诱导的神经元在不同视密度下在U底孔中的3D球状体生成。
图34示出了运动神经元在不同视密度下在悬垂液滴中的3D球状体生成。
图35示出了运动神经元在不同视密度下在U底孔中的3D球状体生成。
图36示出了在24或48小时内运动神经元在不同视密度下在悬垂液滴中的3D球状体生成。
图37示出了在24或48小时内运动神经元在不同视密度下在U底孔中的3D球状体生成。
图38示出了按25,000个iPSC衍生的运动神经元接种并在4天后按25,000个星形细胞接种的悬垂液滴球状体的生长。
图39示出按25,000个iPSC衍生的运动神经元接种并在4天后按25,000个星形细胞接种的U底孔球状体的生长。
图40示出了按40,000个iPSC衍生的运动神经元接种并在4天后按10,000个星形细胞接种的悬垂液滴球状体的生长。
图41示出了在24小时内神经元和胶质的不同组合。
图42示出了4X(上图)和10X(下图)的少突细胞前体细胞的球状体。
图43A至43J示出了在体外2天后由人神经元(hN)和/或人施万细胞(hSC)组成的球状体的制备。hSC的存在促进了共培养系统中球状体的形成，而仅hN条件在2天内没有形成球状体。以三种不同的细胞密度制备hSC球状体：25,000(a)、50,000(b)和75,000(c)。以恒定hN密度(75,000)但变化的hSC密度：25,000(d)、50,000(e)和75,000(f)创建共培养球状体。平行地，以三种不同的密度：50,000(g)、75,000(h)和100,000(i)制备hN球状体。(j)不同球状体的直径比较揭示，共培养球状体与单培养球状体相比更致密(compact)，表明hSC对hN的亲和力导致细胞簇填充更紧密。K(千倍)。N＝4，误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。比率尺：100μm。****(p值≤0.0001)，***(p值≤0.001)，**(p值≤0.01)，*(p值≤0.05)。
图44示出了由单独人神经元(hN)组成的球状体的形成。开始仅hN培养后>2天时的定性检查显示，随着细胞的总数目增大(25K、50K、75K和100K)，球状体尺寸呈现出一致的显著增大。比较单个球状体直径的图表支持该定性检查。K(千倍)。N＝4，误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。比率尺：100μm。****(p-值≤0.0001)，**(p-值≤0.01)。
图45A和45B示出了施万细胞迁移出球状体并沿轴突伸长。(45A)图显示了针对hSC标记物S100染色的人施万细胞(hSC)(浅灰色)如何在4周的时间内与针对βIII-微管蛋白染色的生长中的轴突(灰色)一起迁移出球状体。用DAPI标记核(深灰色)。比率尺：1000μm。(45B)图A中插图的高倍放大图像。比率尺：25μm。
图46A至图46C示出了从培养物中的球状体生长的轴突的记录。图46B'和图46B”示出了所收集记录的图形表示。这些图表示出了随时间以米/秒测量的两个球状体的神经传导速度(NCV)。图46C示出了相同的NCV实验，其中条形图示出了在两个时间点：电流开始的起始值和峰值时的NCV。
图47A至47F.在体外重建的人神经中观测到的髓磷脂形成的各个阶段。(47A)非致密髓磷脂。(47B)致密髓磷脂。(47C)压实(compaction)过程中的髓磷脂。(47D)无轴突存在的情况下的髓磷脂形成。(47E)胞质内层状体。(47F)裸(无髓鞘)轴突。
图48A至48D.背角球状体表征。(48A)显微照片显示了在14DIV下典型的DRG至DH突触培养物。(48B)荧光图像显示了在28DIV下突触培养物的β3-微管蛋白染色。(48C)显微照片显示了E-phys装备(rig)上的突触培养物。蓝色箭头表示刺激电极和记录电极之间的距离，该距离为3.1mm。此图像显示了在DRG轴突处的刺激电极和在DH球状体处的记录电极。(48D)作为对在DRG轴突处的20V刺激的响应，在DH球状体处记录了电活动。X轴以毫秒为单位；y轴以毫伏为单位。
具体实施方式
在整个说明书和权利要求书中使用了与本公开的方法和其他方面有关的各个术语。此类术语将以其在本领域的普通含义给出，另有指示的除外。其他特殊定义的术语将按与本文提供的定义一致的方式解读。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该/所述(the)”包括复数形式，该内容另有明确规定的除外。
如本文所用的术语“大于2”定义为大于数字2的任何整数，例如3、4或5。
当提及可测量的值，如量、时距等时，如本文所用的术语“大约/约”意在涵盖与指定值有±20％、±10％、±5％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％或±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所公开的方法。
如本文在说明书中以及权利要求书中所用，短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素(即,在一些情况下结合地存在而在其他情况下分开存在的要素)中的“任一个或二者”。除了通过“和/或”句型具体标识的要素以外，其他要素也可任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关或无关，除非有相反的明确说明。因l此，作为非限制性实例，“A和/或B”的提及，当结合开放式用语诸如“包含”使用时，在一个实施方案中可以指代A且不存在B(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中可以指代B且不存在A(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中可以指代A和B(任选地包括其他要素)；等等。
如本文在说明书中以及在权利要求书中所用，“或”应当理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，在清单中分开各项时，“或”或者“和/或”应当被解释为是包含性的，即，包括多个要素或要素清单中的至少一项，但也包括多个要素或要素清单中的多于一项，并且任选地包括额外的未列出的项。只有明确表示相反意思的术语，如“其中的仅一个”或“其中的恰好一个”，或在权利要求书中使用时，“由……组成”将指代包括多个要素或要素清单中的恰好一个要素。一般而言，如本文所用的术语“或”仅在前面有排他性措辞，“两者中的任一个”、“其中的一个”、“其中的仅一个”或“其中的恰好一个“时方可被解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个而不是二者”)，“本质上由……组成”在权利要求书中使用时应具有专利法领域中所使用的一般含义。
如本文所用，术语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”和“包含(comprised)”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)，或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)均为包含性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。
如本文所用，短语“从X到Y的整数”意指包括端点的任何整数。即，如果公开了范围，则公开了包括端点在内的范围内的每个整数。例如，短语“从X到Y的整数”公开了1、2、3、4或5以及范围1到5。
如本文所用的术语“多种/个”被定义为大于或超过1的任何数量或数目。
如本文所用，“基本上等同”可以例如在已知与在给定测量指标下的异常或正常范围相关的范围内。例如，如果对照样品来自患病的患者，则基本上等同是在异常范围内。如果对照样品来自已知未患有待测试病状的患者，则基本上等同是在该给定指标的正常范围内。
本公开一般地涉及能够容置和培养在三维培养物中的一个或多个球状体的系统。在一些实施方案中，该系统使用固体衬底，例如塑料或类似的聚合物，其包括孔隙，孔隙上能够驻留任何形状或大小的水凝胶。该系统的水凝胶在一些实施方案中充当本公开的细胞的支持物，以便在足够让神经系统的成熟细胞生长、***和/或增殖轴突(以球状体形式或以悬浮浮液形式)的条件下生长和增殖神经突和/或形成轴突。在一些实施方案中，该系统包括水凝胶，该水凝胶形成具有至少两个区域的腔体：第一区域，其类似于具有平底或曲底且直径跨越固体支持物纵向平面的孔，该第一区域还包括位于该区域的顶部并且可从该系统的外部进入的开口，以及位于该第一区域的至少一个侧面上且与第二区域流体连通的开口。在一些实施方案中，该第一区域的直径为约1mm或更小。该第二区域是从第一区域侧向延伸的通道的形式，其侧面限定了该通道的高度。在一些实施方案中，该通道的宽度为约10至约750微米。在一些实施方案中，该通道的长度从约100至约10000微米。在从本公开中鉴定的细胞的任何一种或组合中生长出球状体之后，可以将该球状体放置到含有细胞培养基的第一区域中。在放置后，神经突可自发生长或因暴露于一种或多种生长刺激分子而被促进生长。神经突和/或轴突生长可以发生在第二区域中，发源于该系统的第一区域并穿过该水凝胶侧面上的至少一个开口并进入该第二区域。在该神经突或轴突生长至所需长度后，可将剂暴露于细胞培养物中以确定所述剂如何影响轴突或神经突的生长、形态或动作电位。
在一些实施方案中，容纳球状体并限定第一区域的腔体或孔可以处于通过相应的第二区域连接的图案或网络中，使得球状体可通过从一个或多个球状体生长出的轴突的通道连接。在一些实施方案中，球状体处于通过定位于每个球状体之间的通道连接的正方形或矩形图案中。在一些实施方案中，该图案为“L”形状，其中球状体限定“L”构造的末端和拐角。在一些实施方案中，球状体可以按三角形或有角的图案定位，其中在三个包括球状体的腔体中的每个腔体之间具有三个通道。在水凝胶网络的一端，第一腔体可包括具有中枢神经系统特征的球状体。在这些实施方案中，通常填充中枢神经系统的细胞组成了球状体。此类细胞可以选自包含单个神经元细胞的任何组合或组合物，并且还可以包括星形细胞或免疫细胞。在相同的实施方案中，位于该第一腔体最远端的腔体可容纳具有感觉特征的球状体，例如包括感觉神经元的那些球状体。因此，第一球状体和第一球状体最远端的球状体之间的轴突连接模拟感觉神经纤维，在这里，轴突从具有中枢神经系统特征的球状体延伸到包括外周感觉神经元的球状体。通过将电极放置在电路的任一端处并测量记录，可以进行此类球状体之间的电生理测量。
在一些实施方案中，球状体包含神经元细胞和非神经元细胞的混合物。非神经元细胞包括骨骼肌细胞、心肌细胞和平滑肌细胞。非神经元细胞还包括来自器官组织的细胞，例如肾细胞、肝细胞和胰腺细胞。非神经元细胞的实例还包括内皮细胞、皮肤的上皮细胞和眼睛的角膜细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞、非人动物细胞或人细胞。在一些实施方案中，球状体的任何一个或多个细胞是原代人细胞。在一些实施方案中，该细胞取自人受试者。在一些实施方案中，该细胞是大鼠或鼠细胞。在一些实施方案中，该细胞是非人灵长类动物细胞、猪细胞、狗细胞或牛细胞。在一些实施方案中，任何公开的系统可以包括与非神经元细胞混合或不与非神经元细胞混合的神经元细胞的球状体。
本公开的方法包括培养本文公开的球状体的方法，以及在此类分子、药物或治疗剂暴露于系统中球状体和从此类球状体萌发的轴突或神经突的培养物时测量毒素、药物、治疗剂、生物分子或污染物的毒性或生物效应的方法。在一些实施方案中，该方法包括使培养物中轴突和/或神经突从第一球状体向第二球状体单向生长的方法。在一些实施方案中，任何公开的系统均包含刺激、加速、减慢或中止培养物中神经突和/或轴突生长的剂。在一些实施方案中，本公开的任何方法包括刺激培养物中轴突的定向生长。在某些实施方案中，使用剂吸引轴突和/或神经突的导向或阻止轴突和/或神经元的生长。在一些实施方案中，将吸引性导向蛋白添加至选自以下的系统：轴突导向因子、神经营养因子、粘附性细胞外基质蛋白、细胞粘附受体(例如钙粘蛋白、Ig-CAM或整联蛋白)；人们还可以使用模拟这些蛋白质的假定结合位点的肽。在一些实施方案中，阻止轴突和/或神经突生长的蛋白是该系统的组分。排斥蛋白包括：Ephrins(有时)、信号素(Semaphorins)(大部分时间)、Slits；硫酸软骨素蛋白聚糖等。
还公开了制造具有和不具有磁性颗粒或珠的球状体的方法。如果磁性颗粒是球状体的组分，则包括磁体的任何装置都可以用于将一个或多个球状体放置在由水凝胶壁形成的所公开的腔体之一内的某个位置处。本公开总体上涉及一种包括可移动框架的设备，所述可移动框架可在平行于设备在其上操作的水平方向的任何横向方向上移动。该框架附接于一个或多个磁力足以吸引包含磁性颗粒的球状体的磁体。在一些实施方案中，通过胶水、聚合物或紧固件，将可在该装置的纵向平面的x和y方向上移动的框架机械地附接到磁体上，使得框架的运动导致磁体运动，如果球状体在磁体的磁场内，则磁力足以使球状体在任何方向上移动。在一些实施方案中，该装置包括第一框架和第二框架，第一或第二框架中的至少一者可在平行于该装置的纵向平面以及该装置上的水平或基本上水平的方向的横向方向上移动。
术语“生物反应器”是指细胞在其中任选地以悬浮液形式被培养的密闭罩或局部密闭罩。在一些实施方案中，生物反应器是指细胞在其中被培养的密闭罩或局部密闭罩，其中所述细胞可以处于液体悬浮液中，或者替代地，可与另一种非液体衬底(包括但不限于固体生长支持材料)接触、在其上或在其内生长。在一些实施方案中，该固体生长支持材料或固体衬底包含以下的至少一种或组合：二氧化硅、塑料、金属、烃或凝胶。本公开涉及包括生物反应器的系统，该生物反应器包括一个或多个培养容器，可在细胞生长培养基存在或不存在的情况下在其中培养神经元细胞。
如本文所用的术语“培养容器”可以是适合于让细胞生长、培养细胞、培育细胞、使细胞增殖、使细胞繁殖，或以其他方式类似地操纵细胞的任何容器。培养容器在本文中也可以称为“培养***物”。在一些实施方案中，培养容器由生物相容性塑料和/或玻璃制成。在一些实施方案中，该塑料是包含一个或多个孔隙的薄层塑料，所述孔隙允许蛋白质、核酸、营养物(例如重金属和激素)抗生素以及其他细胞培养基组分通过该孔隙扩散。在一些实施方案中，该孔隙的宽度不大于约0.1、0.5、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50微米。在一些实施方案中，培养容器在水凝胶基质中并且没有基底或任何其他结构。在一些实施方案中，培养容器被设计成含有水凝胶或水凝胶基质以及各种培养基。在一些实施方案中，培养容器由或基本上由水凝胶或水凝胶基质组成。在一些实施方案中，培养容器的唯一塑料组件是构成培养容器的侧壁和/或底部的组件，其将细胞生长的孔或区域的体积与培养容器外部的点分开。在一些实施方案中，培养容器包括水凝胶以及一个或多个分离的胶质细胞。在一些实施方案中，培养容器包括水凝胶以及一个或多个分离的胶质细胞，其中接种了一个或多个神经元细胞。
术语“电刺激”是指细胞被暴露于交流电(AC)或直流电(DC)的电流的过程。电流可被引入到固体衬底中或通过细胞培养基或细胞培养系统的其他适宜组分施加。在一些实施方案中，通过将一个或多个电极放置在装置或系统内的不同位置处以跨越细胞培养容器产生电压电位，从而向该装置或系统提供电刺激。电极是通过一根或多根导线与一个或多个放大器、电压表、电流表和/或电化学系统(例如电池或发电机)处于可操作的连接中。此类装置和导线形成电路，通过该电路产生电流并且通过该电路跨越组织培养系统产生电位。
如本文所用的术语“水凝胶”可以是例如聚合物链的任何水不溶性的交联的三维网络，其中聚合物链之间的空隙填充有水或能够被水填充。如本文所用的术语“水凝胶基质”是指例如任何三维水凝胶构建体、系统、装置或类似结构。水凝胶和水凝胶基质在本领域中是已知的，并且例如美国专利号5,700,289和6,129,761以及Curley和Moore,2011；Curley等,2011；Irons等,2008和Tibbitt&Anseth,2009中描述了各种类型的水凝胶和水凝胶基质；这些专利和文献中的每一篇均通过引用的方式整体并入。在一些实施方案中，可以通过使液化的预凝胶溶液经受波长大于约300nm、400nm、450nm或500nm的紫外光、可见光或ay光来使水凝胶或水凝胶基质固化。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶基质可以被固化成各种形状，例如，被设计用于模拟神经束的分叉形状。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶基质包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEG)。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶基质包含肽段水凝胶(Puramatrix)。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶基质包含甲基丙烯酸缩水甘油酯-葡聚糖(MeDex)。在一些实施方案中，将神经元细胞掺入水凝胶或水凝胶基质中。在一些实施方案中，将来自神经系统的细胞掺入该水凝胶或水凝胶基质中。在一些实施方案中，来自神经系统的细胞是施万细胞和/或少突细胞。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶基质包含来自动物(例如哺乳动物)的神经系统的组织外植体和补充细胞群体，所述补充细胞群体源自神经系统，但是被分离和培养以使它的群体在培养物中富集。在一些实施方案中，水凝胶或水凝胶基质包含组织外植体，诸如视网膜组织外植体、DRG或脊髓组织外植体以及分离并培养的施万细胞、少突细胞和/或小胶质细胞。在一些实施方案中，在细胞培养容器中同时使用两种或更多种水凝胶或水凝胶基质。在一些实施方案中，在同一细胞培养容器中同时使用两种或更多种水凝胶或水凝胶基质，但是该水凝胶被壁隔开，从而在组织培养容器例如孔中形成可独立寻址的微环境。在多路复用组织培养容器中，对于一些实施方案来说，可以在细胞培养容器内包括任何数目的前述孔或可独立寻址的位置，使得一个孔或位置中的水凝胶基质与该细胞培养容器的另一个孔或位置中的水凝胶基质不同或相同。
如本文所用的术语“免疫细胞”可以是例如参与受试者的免疫活性的任何细胞，所述免疫活性包括保护受试者以使其免于遭受感染或感染的症状，或者攻击、清除或以其他方式消除受试者中功能障碍的细胞或来自细胞的病原体，或者改善由病原体引起的疾病的症状。在一些实施方案中，免疫细胞包括一个或多个B细胞、T细胞、抗原呈递细胞(诸如星形细胞、树突细胞和巨噬细胞)、星状细胞(stellate cell)、粒细胞、单核细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞和/或肥大细胞。在一些实施方案中，免疫细胞表达CD4或CD8以及一个或多个免疫调节分子。在一些实施方案中，该免疫调节分子选自以下之一：IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ-Ιβ、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2及其功能片段，或其组合。免疫调节蛋白在美国专利号8008265中有例证。
术语“免疫调节剂”是指对免疫系统具有调节作用的物质。此类物质可以使用指示免疫应答的各个方面(诸如细胞因子分泌、抗体产生、NK细胞活化和T细胞增殖)的标准测定法方便地鉴定。参见，例如，WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg等(1995)Nature374:546-549；Yamamoto等(1992)J.Immunol.148:4072-76；Ballas等(1996)J.Immunol.157:1840-45；Klinman等(1997)J.Immunol.158:3635-39；Sato等(1996)Science 273:352-354；Pisetsky(1996)J.Immunol.156:421-423；Shimada等(1986)Jpn.J.Cancer Res.77:808-816；Cowdery等(1996)J.Immunol.156:4570-75；Roman等(1997)Nat.Med.3:849-854；Lipford等(1997a)Eur.J.Immunol.27:2340-44；WO 98/55495和WO 00/61151。因此，这些方法和其他方法均可用于识别、测试和/或确认免疫刺激性物质，诸如免疫刺激性核苷酸、免疫刺激性分离的核酸。
在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可包含不同量的PEG和/或肽段水凝胶。在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可具有各种密度。在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可具有各种能够允许细胞在水凝胶中生长的渗透性。在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可具有各种柔性。在一些实施方案中，本文公开的生物反应器、细胞培养装置或组合物包含水凝胶，该水凝胶包含两层聚合物：细胞可穿透的聚合物和细胞不可穿透的聚合物。在一些实施方案中，该细胞可穿透的层至少在细胞不可穿透的层顶部的一个区域中分层。
术语“细胞可穿透的聚合物”是指具有相同或混合的单体亚基的亲水聚合物，所述聚合物的浓度和/或密度足以在以固态或半固态在固体衬底上交联后形成空间，此类空间具有足够的生物相容性，以使得细胞或细胞的一部分可以在培养物中生长。
术语“细胞不可穿透的聚合物”是指具有相同或混合的单体亚基的亲水聚合物，所述聚合物的浓度和/或密度足以在以固态或半固态在固体衬底上交联后不形成生物相容性空间或隔室。换句话说，细胞不可穿透的聚合物是在特定浓度和/或密度下交联后不能支持培养物中的细胞或细胞的一部分生长的聚合物。
术语“功能片段”可以是相应的全长多肽或核酸涉及的多肽或核酸序列的任何部分，其具有足够的长度并且具有足够的结构，以赋予至少类似于或基本上类似于该片段所基于的全长多肽或核酸的生物学效应。在一些实施方案中，功能片段是编码本文所公开任一种核酸序列的全长或野生型核酸序列的一部分，并且所述部分编码具有一定长度和/或结构的多肽，其小于全长但编码与全长或野生型蛋白相比仍具有生物学功能的结构域。在一些实施方案中，功能片段与该片段所基于的野生型或全长多肽序列相比，可具有降低的生物学活性、大约等效的生物学活性或增强的生物学活性。在一些实施方案中，该功能片段衍生自生物体(诸如人)的序列。在此类实施方案中，该功能片段可以保留该序列所衍生自的野生型人序列的99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％序列同一性。在一些实施方案中，该功能片段可以保留该序列所衍生自的野生型序列的87％、85％、80％、75％、70％、65％或60％序列同源性。
普通技术人员可以理解，细胞不可穿透的聚合物和细胞可穿透的聚合物可以包含相同或基本相同的聚合物，但交联后浓度或密度的差异形成水凝胶基质，该水凝胶基质中的一些部分有利于培养物中的细胞或细胞的一部分生长。
在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质可以具有各种厚度。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约150μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约200μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约250μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约300μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约350μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约400μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约450μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约500μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约550μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约600μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约650μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约700μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约750μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约750μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约700μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约650μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约600μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约550μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约500μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约450μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约400μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约350μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约300μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约250μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约200μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约150μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约300μm至约600μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约400μm至约500μm。
在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质可以具有各种厚度。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约10μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约150μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约200μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约250μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约300μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约350μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约400μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约450μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约500μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约550μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约600μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约650μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约700μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约750μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约800μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约850μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约900μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约950μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约1000μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约1500μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约2000μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约2500μm至约3000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约2500μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约2000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约1500μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约1000μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约950μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约900μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约850μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约800μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约750μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约700μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约650μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约600μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约550μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约500μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约450μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约400μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约350μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约300μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约250μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约200μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约100μm至约150μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约300μm至约600μm。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质的厚度为约400μm至约500μm。
在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种合成聚合物。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种以下合成聚合物：聚乙二醇(聚环氧乙烷)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯、聚丙烯酰胺、硅酮及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种合成和/或天然多糖。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种以下多糖：玻璃酸(hyaluronic acid)、硫酸肝素、肝素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、藻酸盐及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种蛋白质和/或糖蛋白。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种以下蛋白质：胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、肌联蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、角蛋白、丝纤蛋白及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种合成和/或天然多肽。在一些实施方案中，该水凝胶或水凝胶基质包含一种或更多种以下多肽：聚赖氨酸、聚谷氨酸盐或聚甘氨酸。
在一些实施方案中，该水凝胶包含选自以下文献中公布的聚合物的聚合物中的一种或组合：Khoshakhlagh等，“Photoreactive interpenetrating network of hyaluronicacid and Puramatrix as a selectively tunable scaffold for neurite growth”，Acta Biomaterialia，2015年1月21日。
适合于细胞生长的任何水凝胶都可以通过将本文所公开的聚合物中的任一种或组合以足以形成以下两种不同密度的交联聚合物的浓度以及条件和足够的时间段放置而形成：一种细胞可穿透的聚合物，一种细胞不可穿透的聚合物。该聚合物可以是合成聚合物、多糖、天然蛋白质或糖蛋白和/或多肽，诸如选自下面的那些。
合成聚合物
诸如聚乙二醇(聚环氧乙烷)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯、聚丙烯酰胺、硅酮、它们的组合及其衍生物。
多糖(无论是合成的还是源自天然来源的)
诸如玻璃酸、硫酸乙酰肝素、肝素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、藻酸盐、它们的组合，以及它们的衍生物。
天然蛋白质或糖蛋白
诸如胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、肌联蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、角蛋白、丝纤蛋白、它们的组合，以及它们的衍生物。
多肽(无论是合成来源还是天然来源)
诸如聚赖氨酸以及所有已列出的RAD和EAK肽。
如本文所用的术语“三维”或“3D”意味着例如细胞的培养物的厚度使得至少三层细胞彼此毗邻生长。在一些实施方案中，术语三维意味着在所公开系统的背景下，该神经突和/或轴突的厚度或高度为约10至约1000微米。在一些实施方案中，术语三维意味着在所公开系统的背景下，该神经突和/或轴突的厚度或高度为约10至约100微米。
术语“分离的神经元”是指这样的神经元细胞，所述神经元细胞已经从最初长出它们的生物体或培养物中被取出或解离。在一些实施方案中，分离的神经元是在悬浮液中的神经元。在一些实施方案中，分离的神经元是更大的细胞混合物的组分，所述混合物包括组织样品或含有非神经元细胞的悬浮液。在一些实施方案中，当神经元细胞从作为它们的来源的动物中被取出时，例如在组织外植体的情况下，所述神经元细胞已经变成分离的。在一些实施方案中，分离的神经元是从动物中切下的DRG中的那些神经元。在一些实施方案中，该分离的神经元包含来自选自以下的一种物种或物种的组合的至少一个或多个细胞：绵羊细胞、山羊细胞、马细胞、牛细胞、人细胞、猴细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、犬细胞、猫细胞、猪细胞或其他非人哺乳动物。在一些实施方案中，该分离的神经元是人细胞。在一些实施方案中，该分离的神经元是经预处理以具有与人神经元细胞相似或基本相似的分化表型的干细胞。在一些实施方案中，该分离的神经元是人细胞。在一些实施方案中，该分离的神经元是经预处理以具有与非人神经元细胞相似或基本相似的分化表型的干细胞。在一些实施方案中，该干细胞选自：间充质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、从哺乳动物的脐带分离的干细胞，或内胚层干细胞。
术语“神经退行性疾病”在整个说明书中用于描述因中枢神经系统和/或外周神经系统受到损伤所引起的疾病。可作为使用所公开的模型、系统或装置研究的疾病的实例的示例性神经退行性疾病包括，例如，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩侧索硬化(Lou Gehrig病)，阿尔茨海默氏病，溶酶体贮积症(如例如Folkerth,J.Neuropath.Exp.Neuro，58，9，Sep.，1999中所述的“白质病”或胶质/脱髓鞘病)，泰-萨(Tay Sachs)病(β氨基己糖苷酶缺乏症)，其他遗传疾病，多发性硬化，缺血、事故、环境伤害引起的脑损伤或创伤，脊髓损伤，共济失调以及酗酒。此外，本发明可用于测试剂对培养物中神经元细胞的功效、毒性或神经变性作用，以研究针对神经变性疾病的治疗。术语神经变性疾病还包括神经发育性疾病，包括例如自闭症和相关的神经疾病，诸如精神***症等。
如本文所用，术语“神经元细胞”是指例如包含树突、轴突和体细胞中的至少一种或组合的细胞，或从神经系统组织分离的任何细胞或细胞组。在一些实施方案中，神经元细胞是包含轴突或能够形成轴突的任何细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是施旺细胞、胶质细胞、神经胶质、皮层神经元、从神经元组织中分离或获得的或已经分化成具有神经元表型或与神经元细胞的表型基本上类似的表型的细胞的胚胎细胞、已经分化成神经元表型的诱导多能干细胞(iPS)，或源自神经元组织或分化成神经元表型的间充质干细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是来自成年、青少年、幼年或胎儿受试者的背根神经节(DRG)组织、视网膜组织、脊髓组织或脑组织的神经元。在一些实施方案中，神经元细胞是从受试者的神经元组织分离的任一个或多个细胞。在一些实施方案中，该神经元细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞和/或大鼠细胞。在一些实施方案中，该细胞是非人哺乳动物细胞或者衍生自从非人哺乳动物分离的细胞。如果从作为该细胞的来源的原始动物分离或解离，则神经元细胞可包含来自多于一种物种的分离的神经元。在一些实施方案中，球状体不含DRG组织。
在一些实施方案中，神经元细胞是以下中的一种或多种：中枢神经系统神经元、外周神经系统神经元、交感神经元、副交感神经元、肠神经系统神经元、脊髓运动神经元、运动神经元、感觉神经元、自主神经元、体神经元、背根神经节、胆碱能神经元、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、羟色胺能神经元、中间神经元、肾上腺素能神经元和三叉神经节。在一些实施方案中，胶质细胞是以下的一种或多种：星形细胞、少突细胞、施万细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、卫星细胞、肠胶质细胞和垂体细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是以下的一种或多种：巨噬细胞、T细胞、B细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞、天然杀伤细胞和嗜碱粒细胞。在一些实施方案中，干细胞是以下的一种或多种：造血干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、脂肪衍生的干细胞、骨髓衍生的干细胞、诱导多能干细胞、星形细胞衍生的诱导多能干细胞、成纤维细胞衍生的诱导多能干细胞、肾上皮衍生的诱导多能干细胞、角质形成细胞衍生的诱导多能干细胞、外周血衍生的诱导多能干细胞、肝细胞衍生的诱导多能干细胞、间充质衍生的诱导多能干细胞、神经干细胞衍生的诱导多能干细胞、脂肪干细胞衍生的诱导多能干细胞、前脂肪细胞衍生的诱导多能干细胞、软骨细胞衍生的诱导多能干细胞和骨骼肌衍生的诱导多能干细胞。在一些实施方案中，球状体还可以包括其他细胞类型，诸如角质形成细胞或内皮细胞。
如本文所用的术语“神经元细胞培养基”或简称“培养基”可以是适合于支持生长、培养，培育神经元细胞，使神经元细胞增殖，使神经元细胞繁殖或以其他方式操纵神经元细胞的任何营养物质。在一些实施方案中，该培养基包括补充有神经生长因子(NGF)的神经基础培养基。在一些实施方案中，该培养基包含胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，该培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，该培养基包含约0.001％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.001％容重至约0.008％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.001％容重至约0.006％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.001％容重至约0.004％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.002％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.003％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.004％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.006％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.008％容重至约0.01％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.002％容重至约0.006％容重范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，该培养基包含约0.003％容重至约0.005％容重范围内的浓度的抗坏血酸。
在一些实施方案中，该水凝胶、水凝胶基质和/或神经元细胞培养基包含以下组分中的任一种或更多种：青蒿素、抗坏血酸、ATP、β-内啡肽、BDNF、小牛血清(bovine calfserum)、牛血清白蛋白、降钙素基因相关肽、辣椒素、角叉菜聚糖、CCL2、睫状神经营养因子、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、D-丝氨酸、胎牛血清、氟柠檬酸盐(fluorocitrate)、***、胶质细胞系衍生的神经营养因子、胶质纤维酸蛋白、谷氨酸盐、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、胰岛素、层粘连蛋白、脂氧素、mac-1-皂草素、蛋氨酸砜亚胺、米诺环素、神经调节蛋白-1、神经保护素、神经秩蛋白、NGF、一氧化氮、NT-3、NT-4、persephin、血小板裂解液、PMX53、聚-D-赖氨酸(PLL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、丙戊茶碱、消退素(resolvins)、S100钙结合蛋白B、硒、P物质、TNF-α、I-V型胶原蛋白以及酵母聚糖。
如本文所述，术语“光遗传学”是指涉及使用光来控制已经被遗传修饰成表达光敏离子通道的活组织(通常是神经元)中细胞的生物技术。它是神经科学中使用的神经调节方法，其使用光学和遗传学的技术组合来控制和监测活组织中-甚至自由活动的动物体内-单个神经元的活动，并实时精确地测量那些操纵的作用。光遗传学中使用的关键试剂是光敏蛋白。空间精确的神经元控制是使用光遗传学致动器如通道视紫红质、盐细菌视紫红质(halorhodopsin)和古细菌视紫红质(archaerhodopsin)实现的，而时间精确的记录可在钙离子(水母荧光素、卡默莱昂(Cameleon)、GCaMP)、氯离子(克洛梅隆(Clomeleon))或膜电压(Mermaid)的光遗传学传感器帮助下来完成。在一些实施方案中，在本文所述培养系统中使用用光遗传学致动器和/或传感器修饰的神经细胞。
术语“塑料”是指包含烃类的生物相容性聚合物。在一些实施方案中，该塑料选自由以下组成的组：聚苯乙烯(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯(PVP)、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯甲醚(PVME)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(l-乳酸)、聚酯、聚己内酯(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚苯胺(PANI)、聚芴、聚吡咯(PPY)、聚乙烯二氧噻吩(PEDOT)以及前述聚合物中的两种或任意两种或更多种的混合物。在一些实施方案中，该塑料是三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种聚合物的混合物。
如本文所用的术语“接种”是指例如将一定量的细胞转移至新培养容器中。该量可以被限定，并且可以使用细胞的体积或数目作为限定量的基础。该细胞可以是悬浮液的一部分。
如本文所用的术语“序列同一性”是指在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，在特定区域内相同的残基的特定百分比。该术语与“序列同源性”或者序列与另一序列“同源”是同义的。该百分比可通过如下方法进行计算：最佳地比对两个序列，在指定区域上比较该两个序列，确定这两个序列中出现相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中位置的总数，以及将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在该两个序列具有不同长度或该比对产生一个或多个交错末端以及指定比较区域只包括单个序列的情况下，在计算式的分母而不是分子中包括单个序列的残基。当比较DNA和RNA时，可以认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等同的。可手动地或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST 2.0来计算同一性。
如本文所用的术语“固体衬底”是指作为不含或基本上不含细胞毒素的固体支持物的任何物质。在一些实施方案中，该固体衬底包含二氧化硅、塑料和金属中的一种或组合。在一些实施方案中，该固体衬底包括具有足以允许蛋白质、营养物质、以及气体在细胞培养基存在下扩散或非主动转运穿过固体衬底的尺寸和形状的孔隙。在一些实施方案中，该孔隙尺寸为直径不超过约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微米。普通技术人员可以根据细胞培养基的内容物和在特定微环境中在固体衬底上生长的细胞的暴露来确定多大的孔隙尺寸是必要的。例如，本领域普通技术人员可以观测系统或装置中的任何培养的细胞在使用包含各种直径的孔隙的固体衬底的条件下是否是存活的。在一些实施方案中，该固体衬底包含具有预定形状的基底，该预定形状限定了外表面和内表面的形状。在一些实施方案中，所述基底包括二氧化硅、塑料、陶瓷或金属中的一种或组合，并且其中所述基底为圆柱体的形状或基本上类似于圆柱体，使得所述第一细胞不可穿透的聚合物和第一细胞可穿透的聚合物包被该基底的内表面并且限定圆柱形或基本圆柱形的内部腔室；并且其中开口被定位在圆柱体的一端。在一些实施方案中，该基底包括一个或多个孔隙，其大小和形状足以允许蛋白质、营养物和氧气在细胞培养基存在下扩散穿过固体衬底。在一些实施方案中，该固体衬底包括具有直径不大于1微米的孔隙尺寸的塑料基底，并且包括至少一层水凝胶基质；其中所述水凝胶基质包含至少第一细胞不可穿透的聚合物和至少第一细胞可穿透的聚合物；所述基底包括预定形状，所述第一细胞不可穿透的聚合物和至少第一细胞可穿透的聚合物物理粘附或化学键合在所述预定形状的周围；其中所述固体衬底包括至少一个隔室，其至少部分地由所述固体衬底的内表面的形状限定，并且可通过任选地定位于所述固体衬底的一端处的开口从所述固体衬底的外部的点进入。在一些实施方案中，在固体衬底包括由至少一个内表面限定的中空内部部分的情况下，可通过将细胞放置在开口处或开口邻近处以使得细胞可以在生长之前粘附至所述固体衬底的内表面的至少一部分上来接种悬浮液或组织外植体中的细胞。该固体衬底的至少一个隔室或中空内部允许将细胞容纳在由固体衬底的内表面的形状限定的特定三维形状中并且促进细胞远离开口定向生长。在神经元细胞的情况下，至少一个隔室的容纳程度和形状有助于轴突从被定位在至少一个隔室中并在开口处或开口邻近处的胞体生长。在一些实施方案中，该固体衬底是圆柱形的、管状的，或者基本上管状的或圆柱形的，使得内部隔室的形状是圆柱形的或部分圆柱形的。在一些实施方案中，该固体衬底包括一个或多个有分支的管状内部隔室。在一些实施方案中，该固体的中空内部部分的分叉或多重分叉形状被配置用于或允许轴突以多重分支模式生长。当并且如果将电极放置在轴突的远端处至其附近以及神经元细胞胞体处或其邻近处，则可以在装置或系统内测量电生理指标，例如细胞内动作电位。在一些实施方案中，电极可操作地连接到电压表、电流表和/或能够在一段将电极物理连接到电压表、电流表和/或装置的导线上产生电流的装置。
本公开涉及适当填充的水凝胶，其包含细胞可穿透的聚合物和细胞不可穿透的聚合物的混合物。在一些实施方案中，该水凝胶包含约10％至约20％的PEG，并且具有约0.1至约200Pa的总模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约0.5Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约10Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约50Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约75Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约90Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约100Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约125Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约150Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约175Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有约200Pa的模量。在一些实施方案中，该水凝胶具有不大于230Pa的模量。
球状体
如本文所用，“球状体”或“细胞球状体”可以是例如三维形状的细胞的任何分组，所述三维形状一般对应于绕其主轴之一(长轴或短轴)旋转的椭圆形或圆形或凸形或凹形弧，并且包括三维卵形状、扁圆和扁长的球状体、球状体、透镜形或基本等效的形状。
本发明的球状体可以具有任何合适的宽度、长度、厚度和/或直径。在一些实施方案中，球状体可以具有在约10μm至约50,000μm的范围或其中任何范围(诸如但不限于约10μm至约900μm、约100μm至约700μm、约300μm至约600μm、约400μm至约500μm、约500μm至约1,000μm、约600μm至约1,000μm、约700μm至约1,000μm、约800μm至约1,000μm、约900μm至约1,000μm、约750μm至约1,500μm、约1,000μm至约5,000μm、约1,000μm至约10,000μm、约2,000至约50,000μm、约25,000μm至约40,000μm或约3,000μm至约15,000μm)内的宽度、长度、厚度和/或直径。在一些实施方案中，球状体可以具有约50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1,000μm、5,000μm、10,000μm、20,000μm、30,000μm、40,000μm或50,000μm的宽度、长度、厚度和/或直径。在一些实施方案中，生成了多个球状体，并且多个球状体中的每个球状体均可具有变化小于约20％，诸如例如小于约15％、10％或5％的的宽度、长度、厚度和/或直径。在一些实施方案中，多个球状体中的每一个球状体均可具有上述任何范围内的不同宽度、长度、厚度和/或直径。
球状体中的细胞可以具有特定的取向。在一些实施方案中，该球状体可以包括内核和外表面。在一些实施方案中，该球状体可以是中空的(即，在内部可以不包含细胞)。在一些实施方案中，该内核细胞和外表面细胞是不同类型的细胞。在一些实施方案中，该内核包括磁性纳米颗粒。
球状体的刚度可以变化，例如，如通过弹性模量(帕斯卡；Pa)测量。在某些实施方案中，该球状体的弹性模量在约100Pa至约10,000Pa，例如，约100Pa至约12,000Pa或约100Pa至约4800Pa的范围内。在一些实施方案中，该球状体的弹性模量可为约1200Pa。作为另一个实例，该球状体模量可从约至少10Pa、至少约100Pa、至少约150Pa、至少约200Pa或至少约450Pa变化。在一些实施方案中，本公开的组合物或装置包括一个或多个孔，并且每个孔包含一个或多个不同的球状体，第一、第二、第三、第四或第五或更多的球状体群。在一个实施方案中，该第一球状体包含约100Pa至约300Pa的弹性模量，并且第二球状体包含约400Pa至约800Pa的弹性模量。在另一个实例中，该第一球状体的特征在于弹性模量为约50至约200Pa，第二球状体的特征在于弹性模量为约250Pa至约500Pa。
在一些实施方案中，球状体可以由一个、两个、三个或更多个不同的细胞类型(包括一个或多个神经元细胞类型和/或一个或多个干细胞类型)组成。在一些实施方案中，该内核细胞可由一个、两个、三个或更多个不同的细胞类型组成。在一些实施方案中，该外表面细胞可由一个、两个、三个或更多个不同的细胞类型组成。
在一些实施方案中，该球状体包含至少两个类型的细胞。在一些实施方案中，该球状体包含神经元细胞和非神经元细胞。在一些实施方案中，该球状体包含神经元细胞和星形细胞，该神经元细胞与星形细胞的比率为约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1。在一些实施方案中，该球状体包含比率为约5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的神经元细胞和非神经元细胞。在一些实施方案中，该球状体包含比率为约1:5、1:4、1:3或1:2的神经元细胞和非神经元细胞。本文公开的细胞类型的任何组合可在本公开的球状体内以上面鉴定的比率使用。
根据特定的实施方案，细胞组可按照任何适宜的形状、几何形状和/或图案放置。在一些实施方案中，该细胞跨越具有实心或空心核的珠或纳米颗粒的表面区域以球形排列。例如，可以使独立的细胞组沉积为球状体，并且可将该球状体布置在三维网格内或任何其他适宜的三维图案内。该独立球状体可全部包括大约相同数目的细胞，并且具有大约相同的尺寸，或者可替代地，不同的球状体可以具有不同数目的细胞和不同的尺寸。在一些实施方案中，多个球状体可以按诸如L或T形的形状从单一点或多个点径向地布置，顺序球状体可以按单一线或平行线，管，圆柱体，圆环面(toroid)，分层分支的血管网络，高长宽比的物体，薄封闭壳，类器官，或其他可能与组织、血管或其他生物结构的几何形状相对应的复杂形状布置。
该球状体的任何适宜的生理响应都可以在本公开的方法中确定、评价、测量和/或鉴定。在一些实施方案中，该球状体的1、2、3、4或更多种生理响应可在本公开的方法中确定、评价、测量和/或鉴定。在一些实施方案中，该球状体的生理响应可以是该球状体的形态变化。该方法可以包括确定球状体的形态变化，其可以包括在使球状体与剂(诸如化学和/或生物化合物)接触之前估计至少一个形态参数，在使球状体与所述剂接触之后估计所述至少一个形态参数，以及计算在使该球状体与所述剂接触之前和接触之后所述至少一个形态参数之间的差异，以提供该球状体的形态变化。在一些实施方案中，球状体的生理响应可以是响应于与剂的接触的球状体收缩或溶胀。球状体的形态可使用本领域技术人员已知的任何方法，诸如但不限于定量偏心率和/或横截面积来进行测定。
在一些实施方案中，球状体的生理响应可以是球状体的体积变化。该方法可以包括确定球状体的体积变化，其可以包括估计在使该球状体与剂接触之前的第一体积，估计在使该球状体与所述剂接触之后的第二体积，以及计算该第一体积和该第二体积之间的差异以提供该球状体的体积变化。在一些实施方案中，球状体的生理响应可以是响应于与剂的接触的球状体收缩或溶胀。
所述剂可以是任何适宜的化合物，诸如有机化合物、小分子化合物(例如，小分子有机化合物)、蛋白质、抗体、寡核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、基因疗法运载体(例如，病毒载体)及其任何组合。一种或多种(例如1、2、3、4、5或更多种)剂可用于本发明的方法中。例如，本发明的方法可包括使本发明的球状体与两种或更多种不同的剂接触。在一些实施方案中，本发明的方法可诸如例如通过使本发明的球状体与基因疗法运载体(例如，病毒载体)接触来间接地调节球状体中的活性。
本发明的方法可包括培养细胞和/或球状体。培养可使用本领域技术人员已知的方法进行。在一些实施方案中，细胞和/或球状体可以被培养任何所需的时间段，诸如但不限于数小时、数天、数周或数月。在一些实施方案中，细胞和/或球状体可以被培养约1、2、3、4、5、6或7天，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或更多个周。
适用于本发明的方法的细胞培养基是本领域已知的，并且包括但不限于BEGMTM支气管上皮细胞生长培养基、杜尔伯科(Dulbecco)改良伊格尔(Eagle)培养基(DMEM)、高葡萄糖杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM-H)、McCoy's 5A改良培养基、RPMI、Ham培养基、培养基199、mTeSR等。细胞培养基可补充有额外的组分诸如但不限于维生素、矿物质、盐、生长因子、碳水化合物、蛋白质、血清、氨基酸、附着因子、细胞因子、生长因子、激素、抗生素、治疗剂、缓冲剂等。在本发明的方法执行期间可以选择和/或改变细胞培养组分和/或条件，以提高和/或模拟某些细胞特性和/或性质。接种方法和细胞培养方法的实例描述于美国专利号5,266,480、5,770,417、6,537,567和6,962,814以及Oberpenning等“De novoreconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissueengineering”Nature Biotechnology17:149-155(1999)中，它们均通过引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，以逐步方式改变细胞培养基以促进培养物中轴突的髓鞘形成。预髓鞘形成(Pre-myelination)培养基和髓鞘形成培养基包括以下组分：
表1.髓鞘形成诱导培养基方案的组分。
在一些实施方案中，该固体衬底、细胞培养装置或纳米颗粒包括包含本文公开的一种或多种细胞类型的球状体。任何颗粒均可包含本申请中的1、2、3、4、5、6、7、8或更多种细胞类型中的任一种或组合。
术语“纳米颗粒”或“纳米梭(nanoshuttle)”，当每个术语可互换使用时，是包括至少一个区域的颗粒。在约0.7微米至约1.5微米范围内的磁性颗粒已描述于包括例如美国专利号3,970,518、4,018,886、4,230,685、4,267,234、4,452,773、4,554,088、4,659,678、6,623982、6,645,731和美国申请号20110250146的专利文献中，其中每篇专利文献各自均通过引用的方式整体并入本文。纳米颗粒可用于磁化本文所述的任何细胞或球状体，即，使其对磁场有反应。本公开的一些组合物和/或系统包括与磁响应元件接触的细胞或包含磁响应元件的球状体。在一些实施方案中，本公开的组合物和/或系统包括与一个或多个磁性纳米颗粒接触的细胞或包含一个或多个磁性纳米颗粒的球状体。如本文所用，“磁响应元件”可以是将对磁场做出响应的任何元素或分子。一个或多个纳米颗粒必须包含磁响应元件或者是磁响应元件。在一些实施方案中，纳米颗粒可被本文描述的任何细胞吸收或吸附。在一些实施方案中，磁场可以用于操纵细胞或球状体的位置、形状、图案或运动。
在一些实施方案中，带电纳米颗粒具有纳米级尺寸。在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒具有从约5nm至约1000nm或其中任何范围的尺寸。在一些实施方案中，该纳米颗粒的直径尺寸为约5nm至约250nm、约25nm至约225nm、约50nm至约200nm、约75nm至约150nm。在一些实施方案中，该纳米颗粒具有约5nm、约10nm、约20nm、约40nm、约60nm、约80nm、约100nm、约120nm、约140nm、约160nm、约180nm、约200nm、约250nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm或约1000nm的直径。在一些实施方案中，该纳米颗粒的直径不大于约5nm、约10nm、约20nm、约40nm、约60nm、约80nm、约100nm、约120nm、约140nm、约160nm、约180nm、约200nm、约250nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm或约1000nm。在一些实施方案中，纳米颗粒具有基本均匀的尺寸。在一些实施方案中，纳米颗粒具有不同的尺寸。在一些实施方案中，该纳米颗粒的尺寸将取决于正在使用什么类型的细胞。
该磁响应元件可为将对磁场做出响应的任何元素或分子。在一些实施方案中，该磁响应元件是稀土磁体，诸如，例如，钐钴(SmCo)或钕铁硼(NdFeB)。在一些实施方案中，该磁响应元件是陶瓷磁体材料，诸如，例如，锶铁氧体。在一些实施方案中，该磁响应元件是磁性元素，诸如，例如，铁、钴、镍或其任何合金或氧化物。在一些实施方案中，该磁响应元件包含金。在一些实施方案中，该磁响应元件是对磁场起反应的顺磁性材料，而本身不是磁体，因为这使得该材料的组装更加容易。
在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种铁氧化物，包括，例如，铁(III)氧化物、α-Fe2O3、γ-Fe2O3、β-Fe2O3、ε-Fe2O3、铁(II)氧化物，或铁(II,III)氧化物。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种金、铁氧化物和聚赖氨酸。
在本公开的一些方面中，提供了包覆的磁性颗粒，其包含磁性材料的纳米颗粒核以及在磁核上的基底涂层材料，该基底涂层材料的量足以阻碍生物大分子与磁核非特异性结合。这些磁性颗粒的特征在于极低的非特异性结合以及高效的靶捕获，这对于达到有效地分离非常罕见的细胞(诸如神经元或本文公开的其他细胞类型)所需的富集水平是必不可少的。在替代的实施方案中，提供了包覆的磁性颗粒，其包含以下结构：i.磁性材料的纳米颗粒核；ii.基底涂层材料，其在磁核上形成不连续的涂层，从而提供至少一个不连续区域，该不连续区域如果可以被触及，将促使基底被包覆的颗粒与生物大分子的非特异性结合；以及iii.额外的涂层材料，其阻碍生物大分子进入该不连续区域。上面刚刚描述的颗粒的磁核材料可以包含至少一种过渡金属氧化物，并且适宜的基底涂层材料包含蛋白质。适合于包覆磁性颗粒的蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白。额外的涂层材料可以是原始的涂层蛋白或与磁核上的基底材料偶联的特异性结合对中的一个成员。示例性的特异性结合对包括生物素-链亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白A-抗体Fc以及抗生物素蛋白-生物素。在一个实施方案中，该特异性结合对的成员通过双官能连接化合物偶联至基底涂层材料。示例性的双官能连接化合物包括琥珀酰亚胺基-丙酰基-二硫代吡啶(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，但是各种其他此类异双官能接头化合物可从Pierce,Rockford,III获得。
本发明的经包覆的磁性颗粒优选具有70-90％的磁质量。在一些实施方案中，大部分磁性颗粒具有在从约90至约150nm范围内的粒度。可以合成颗粒，使得它们更加单分散，例如，在从约90至约120nm或从约120至约150nm的范围内。通常使本发明的颗粒悬浮在生物相容性介质中。
在一些实施方案中，可将纳米颗粒与支持分子组合。“支持分子”一般是用于将纳米颗粒和细胞紧密混合在一起的聚合物或其他长分子。支持分子可以是带正电的、带负电的或带混合电荷的或中性的，并且可以是多于一种支持分子的组合。在一些实施方案中，该支持分子是天然聚合物或细胞衍生的聚合物。此类聚合物的非限制性实例包括肽、多糖和核酸。在其他实施方案中，该支持分子是合成聚合物。在一些实施方案中，该聚合物是聚赖氨酸。在一些实施方案中，该支持分子可以是以下的一种或多种：聚赖氨酸、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、BSA、透明质酸(hyaluronan)、糖胺聚糖、阴离子非硫酸化糖胺聚糖、明胶、核酸、细胞外基质蛋白混合物、基质胶、抗体，以及它们的混合物和衍生物。在一些实施方案中，纳米颗粒包括Ferridex，其是一种由葡聚糖包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)组成的材料。
纳米颗粒可以是带正电的或带负电的。在一些实施方案中，该带负电的纳米颗粒含有电荷稳定的金属(例如，银、铜、铂、钯、金)。在一些实施方案中，该带负电的纳米颗粒包含金。
在一些实施方案中，该带正电的纳米颗粒含有表面活性剂或聚合物稳定的或包覆的合金和/或氧化物(例如元素铁、铁-钴、镍氧化物、铁氧化物)。在一些实施方案中，该带正电的纳米颗粒含有铁氧化物。
本公开还涉及一种系统，其包括：
(i)水凝胶基质；
(ii)一个或多个球状体；
(iii)电流发生器；
(iv)电压表和/或电流表；
(v)至少第一刺激电极和至少第一记录电极；
其中发生器、电压表和/或电流表以及电极通过电路彼此电连接，其中电流从发生器被馈送到该至少一个刺激电极，并且电流在记录电极处被接收并被馈送至电压表和/或电流表；其中该刺激电极被定位在该神经元细胞的一个或多个胞体处或其邻近处，并且该记录电极被定位在该胞体远端的预定距离处，以使得跨越细胞培养容器建立电位。
在一些实施方案中，该固体衬底由水凝胶或水凝胶基质组成。在一些实施方案中，该固体衬底由水凝胶或水凝胶基质组成，并且不含玻璃、金属或陶瓷。在一些实施方案中，固体衬底被成型成被预定用于接种适合于轴突生长的特定尺寸的细胞的形式或模具。在一些实施方案中，固体衬底或至少一个基底部分经过成型而具有至少一个分支的内部管状结构，其中管的位置越远离接种组织外植体或神经元细胞的位置，直径任选地逐渐变细。举例来说，本公开考虑了在固体衬底的半圆柱形或圆柱形部分的一端处的中心点，所述中心点可在所述固体衬底外部的点处通过外表面处的开口或洞进入。该开口或洞可以用于将细胞(所公开细胞的一种细胞或细胞组合中的任一者的任一个或多个)放置或接种在上述中心点处。当让细胞在培养中生长几天时，细胞被暴露于含本文公开的任何组分的培养基，所述组分的浓度和暴露的时间段足以使得轴突从神经元细胞生长。如果要使细胞形成髓鞘或期望髓鞘形成以进行研究，那么可以将胶质细胞通过相同的洞引入并且在添加神经元细胞或外植体之前接种。当轴突以半圆柱形或管状结构生长时，该轴突突起生长可以在距中心点越来越远处进行。固体衬底中越来越远离中心点(或接种点)的点处的进入点或开口可以用于定位或观测轴突状态的轴突生长。本公开考虑了固体衬底的结构采取促进轴突生长的任何形式。在一些实施方案中，容置轴突突起的内部腔室或隔室包含半圆形或基本圆柱形直径。在一些实施方案中，该固体衬底在远离中心点的点处在两个或更多个内部隔室中分支。在一些实施方案中，这种分支可以类似于钥匙洞形状或树，其中存在2、3、4、5、6、7或8个或更多个管状或基本圆柱形的内部腔室彼此流体连通，使得轴突生长起源于一个或多个胞体的接种点，并且沿着内部腔室纵向延伸并进入一个或多个分支中。在一些实施方案中，可以将一个或多个电极放置在一个或多个开口处或其邻近处，使得可以跨越沿着轴突长度的一个或多个位置获取记录。这也可以用于探查沿着轴突长度的一个或多个位置。
本公开涉及用于准确地测量人工中枢神经系统节点与外周神经系统节点之间的记录的系统，该系统包括至少第一球状体和第二球状体，第一球状体包含背根神经节或来自该中枢神经系统的神经元细胞或哺乳动物胚胎细胞；并且第二球状体包含至少一个来自外周神经系统的神经元细胞或原代哺乳动物干细胞。本公开涉及通过如下过程制造本文公开的任何系统：将包含磁性物质的至少第一或第二球状体定位于由水凝胶限定的孔或通道中，通过将磁体对准在该孔或通道处或其毗邻处来移动该第一或第二球状体。如果该系统模拟在中枢神经系统节点或细胞组与外周神经系统节点或细胞组之间运行的轴突，则在一些实施方案中，该第一球状体被定位于第一孔或通道处或其附近，并且该第二球状体被定位于一定距离处的第二孔或通道处或其附近，所述距离足以允许暴露于细胞培养基后这两个球状体之间的轴突生长。本公开涉及测量中枢神经节点或细胞组与外周节点或细胞组之间的记录，该方法包括将电极放置在第一球状体处或其毗邻处，将电极放置在第二球状体处或其附近，以及使用包括发生器的放大器或发生器用电刺激该系统。在一些实施方案中，该方法进一步包括测量电生理响应。
如本文所用的术语“记录”是指例如测量一个或更多个神经元细胞的响应。此类响应可以是电生理响应，例如，膜片钳电生理记录或场电位记录。
本公开公开了用于获得模拟临床神经传导和NFD测试的体外神经组织的微尺度器官型模型的生理测量结果的方法与装置。通过使用这些方法和器件所获得的结果可以更好地预测临床结果，从而使得更具成本效益的途径能够用于选择具有更高的后期成功可能性的有前途的先导化合物。本公开包括三维微工程系统的制造与利用，该系统能够实现格外密集、高度平行的神经纤维束生长。由于该束的局限性质，因此这个体外模型能够测量CAP和细胞内膜片钳记录两者。此外，随后的共聚焦和透射电子显微镜(TEM)分析允许定量结构分析，包括NFD。总之，该体外模型系统具有评估组织形态测定和群体电生理学的新能力，类似于临床组织病理学和神经传导测试。
本公开还提供了用于测量使用本文所述的体外模型创建的轴突髓鞘形成的方法。与人传入外周神经的结构相似，这些体外构建体中的背根神经节(DRG)神经元向外周伸出长的、平行的、成束的轴突。在天然组织中，不同直径和髓鞘形成程度的轴突以不同的速度将感觉信息传导回中枢神经系统。施万细胞通过使轴突形成髓鞘并为更快的传导提供隔离来支持感觉中继。类似地，由这种体外构建体诱导的三维生长包含在密集的平行取向上横跨长达3mm的距离的各种直径的轴。在共聚焦和TEM成像中观测到施万细胞存在和入鞘(sheathing)。
尽管神经元形态是表型成熟度的有用的指标，但是健康神经元的更明确的标志是它们传导动作电位的能力。单独的细胞凋亡不是神经元健康的全面量度，因为在细胞死亡显现之前可能发生许多病理变化。动作电位生成的电生理学研究可以确定观测到的结构是否支持预测的功能，并且测量临床相关终点的能力产生更具预测性的结果。类似地，由成像收集的信息可以确定髓鞘形成程度的定量指标，同时CAP测量结果显示了髓磷脂的整体健康情况并且有助于进一步深入了解所关注的各种剂或化合物的毒性和神经保护机制。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括小化学化合物。在一些实施方案中，该至少一种剂包括至少一种环境或工业污染物。在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的小化学化合物中的一种或组合：化疗药物、镇痛药、心血管调节剂、胆固醇、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎药和抗微生物药。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的化疗药物中的一种或组合：放线菌素、阿利维A酸、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、卡培他滨、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃博霉素(Epothilone)、厄洛替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、亚硝基脲、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、罗米地辛(Romidepsin)、他氟泊苷(Tafluposide)、替莫唑胺(口服达卡巴嗪)、替尼泊苷、硫鸟嘌呤(以前为硫鸟嘌呤)、托泊替康、维A酸、戊柔比星(Valrubicin)、维莫非尼、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、维莫德吉(Vismodegib)以及伏林司他(Vorinostat)。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的镇痛药中的一种或组合：扑热息痛(Paracetoamol)、非甾体抗炎药(NSAID)、COX-2抑制剂、阿片类药物、氟吡汀、三环抗抑郁药、卡马西平、加巴喷丁以及普瑞巴林。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的心血管调节剂中的一种或组合：奈匹司他(nepicastat)、胆固醇、烟酸、黄芩(scutellaria)、普尼拉明(prenylamine)、脱氢表雄酮、莫那匹尔(monatepil)、艾司***、尼古地平(niguldipine)、阿塞那平、阿托莫西汀、氟桂利嗪、米那普仑、美西律、***、硫喷妥钠、类黄酮、溴苄胺、奥沙西泮以及厚朴酚(honokiol)。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的神经保护剂和/或神经调节剂中的一种或组合：色胺、甘丙肽受体2、苯丙氨酸、苯乙胺、N-甲基苯乙胺、腺苷、京都肽(kyptorphin)、P物质、3-甲氧酪胺、儿茶酚胺、多巴胺、GABA、钙、乙酰胆碱、肾上腺素、去甲肾上腺素以及羟色胺。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的免疫调节剂中的一种或组合：克仑索单抗(clenolizimab)、依诺替单抗(enoticumab)、利格珠单抗(ligelizumab)、西妥珠单抗(simtuzumab)、伐他珠单抗(vatelizumab)、帕撒单抗(parsatuzumab)、伊马妥珠单抗(Imgatuzumab)、曲格利珠单抗(tregalizaumb)、帕替利单抗(pateclizumab)、那洛木单抗(namulumab)、哌拉单抗(perakizumab)、法拉莫单抗(faralimomab)、帕特利单抗(patritumab)、阿替奴单抗(atinumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、弗妥西单抗(futuximab)以及杜利他单抗(duligotumab)。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的抗炎药中的一种或组合：布洛芬、阿司匹林、酮洛芬、舒林酸、萘普生、依托度酸、非诺洛芬、双氯芬酸、氟比洛芬、酮咯酸、吡罗昔康、吲哚美辛、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普秦、酮洛芬、法莫替丁、甲氯芬那酸盐(meclofenamate)、托美丁以及双水杨酯(salsalate)。
在一些实施方案中，该至少一种剂包括选自以下的抗微生物剂中的一种或组合：抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫药、热、辐射以及臭氧。
本公开另外公开了在三维培养平台中测量仿生神经组织的细胞内和细胞外记录两者的方法。先前，电生理学实验是在解离的表面接种的培养物或器官型切片制备物中进行的，具有每一种方法固有的限制。在解离的细胞培养物中进行研究通常受限于单细胞记录，这是因为缺乏有组织的多细胞神经突构造，如将在器官型制备物中所见到的那样。器官型制备物具有完整的神经回路并且允许细胞内研究和细胞外研究这两者。然而，急性脑切片呈现一系列复杂的同时存在的变量而没有控制单个因素的手段并且因此在本质上在通量可能性方面受限。
体外三维培养物中的细胞内记录先前已经被证实。然而，神经元的长出在空间上不局限于支持细胞外群体研究的解剖相关结构。需要更仿生的三维神经培养物，以允许进行群体水平的电生理行为的检查。本公开支持了全细胞膜片钳技术和由呈三维几何形状的受限的神经突生长产生的细胞外场记录中的同步群体水平事件。在本公开之前，这些终点的测量直接类似于临床神经传导测试，尚有待被证实以用于纯细胞体外研究。
使用本文所公开的方法和装置，使用场记录来测量由所有募集的纤维中的信号传导所引起的电位的组合细胞外变化。由电刺激所引出的群体响应是CAP。电诱发的群体峰电位在性质上是分级的，包括慢纤维和快纤维中动作电位的组合效应。峰电位是单个连贯事件，具有快速的起始相和短的持续时间，这是CAP或仅包含在不存在突触输入的情况下具有快速的信号传导的动作电位的响应的特征。本公开所公开的三维神经构建体还支持沿着神经突束或通道从更远的距离刺激的CAP，这证实了神经培养物能够快速地传送来自远距离刺激的信号的能力，这非常像传入外周神经。本公开的三维神经培养物支持了可用于测量传导特性的近端和远端刺激技术。
本公开可以与诱导神经纤维束中典型的许多纤维类型募集的一种或多种生长因子一起使用。特别地，神经生长因子(NGF)优先地募集小直径纤维，所述小直径纤维常常与疼痛信号传导相关，如本文所提供的数据中所证实。已经证实，脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子3(NT-3)优先支持较大直径的本体感受纤维的长出。生长影响因素，如生物活性分子和药理学剂可以与电生理学研究合并以允许系统地操纵用于机制研究的条件。
使用本公开形成的三维神经培养物可以用作平台来研究髓磷脂损害性疾病和外周神经病变潜在的机制，这是通过研究已知的髓鞘形成障碍剂、神经病变诱发性培养条件，以及毒性神经病变诱发性化合物对所述神经培养物的作用来实现的。本公开容许使用传导速度作为在毒性条件和治疗条件下髓磷脂和神经纤维完整性的功能量度，从而有助于对药物安全性和功效进行研究。将遗传突变和药物并入到使用本文所公开的技术产生的神经培养物中可以实现以受控方式再现疾病现象，从而使得更好地了解神经变性和可能的治疗疗法。
本公开提供了涉及产生、维持，以及生理学探查被设计成模拟天然神经组织解剖结构的微工程配置的神经细胞和神经网络的装置、方法和系统。在一些实施方案中，所述装置和系统包括一个或多个培养或分离的施万细胞和/或一个或多个培养或分离的少突细胞，所述细胞在细胞培养容器中与一个或多个神经元细胞接触，所述细胞培养容器包括固体衬底，所述衬底包含至少一个外表面、至少一个内表面以及至少一个内部腔室；所述内部腔室的形状至少部分地由所述至少一个内表面所限定并且可从所述固体衬底外部的点通过所述外表面中的至少一个开口进入；其中所述一个或多个神经元细胞的胞体被定位在所述内部腔室的一端处并且轴突能够在所述内部腔室内沿着所述内部腔室的至少一个长度生长，以使得轴突尖端的位置从胞体向远侧延伸。在一些实施方案中，该固体衬底的内表面为圆柱体的形状或者是基本圆柱形的，使得来自神经元细胞的胞体被定位于该圆柱形或基本圆柱形内表面的一端处的开口近端，并且该神经元细胞的轴突包括一段沿着内表面的长度从胞体边缘处的点延伸至胞体远端点的细胞物质。在一些实施方案中，该固体衬底的内表面为圆柱体的形状或者是基本圆柱形的，使得来自神经元细胞的胞体被定位于该圆柱形或基本圆柱形内表面的一端处的开口近端，并且该神经元细胞的轴突包括一段沿着内表面的长度从胞体边缘处的点延伸至胞体远端点的细胞物质。在一些实施方案中，该固体衬底的内表面为圆柱体的形状或者是基本圆柱形的，使得来自神经元细胞的胞体被定位于该圆柱形或基本圆柱形内表面的一端处的开口近端，并且该神经元细胞的轴突包括一段沿着内表面的长度从胞体边缘处的点延伸至胞体远端点的细胞物质；其中，如果该细胞培养容器包含多个神经元细胞，则多个轴突从多个体细胞(或胞体)延伸以使得多个轴突限定一束能够沿着该内表面的长度从胞体向远端生长的轴突。在一些实施方案中，该神经元细胞在可穿透的聚合物上和可穿透的聚合物内生长。在一些实施方案中，一个或多个电极被定位在至少一个轴突的尖端处或其邻近处，并且一个或多个电极被定位在该胞体处或其邻近处，以使得跨越一个或多个神经元细胞的长度建立电压电位。
本公开的另一个目的是提供神经功能的中至高通量的测定法，以用于筛查化学剂与生物剂的药理学和/或毒理学性质。在一些实施方案中，所述剂是细胞(诸如本文公开的任何类型的细胞)或抗体(诸如用于治疗临床疾病的抗体)。在一些实施方案中，所述剂是用于治疗人类疾病的任何药物或剂，以使得可以在作为所提出的哺乳动物治疗的新剂与人类疾病的现有治疗之间比较毒性、影响或神经调节作用。在一些实施方案中，用于治疗人类疾病的新剂是用于神经退行性疾病的治疗，并且与用于神经退行性疾病的现有治疗相比较。在作为非限制性实例的多发性硬化的情况下，可将新剂(修饰的细胞、抗体或小化学化合物)的影响与多发性硬化的现有治疗诸如克帕松(Copaxone)、利比(Rebif)、其他干扰素疗法、泰斯布里(Tysabri)、富马酸二甲酯、芬戈莫德、特立氟胺(teriflunomide)、米托蒽醌、***、替扎尼定以及巴氯芬的相同影响相比较和对比。
本公开的另一个目的是将诸如二维和三维微工程化神经束的技术的独特集合与神经细胞群体的电生理刺激和记录结合使用。
本公开的另一个目的是提供体外评价神经生理机能的新型途径，所述途径使用复合动作电位(CAP)作为临床上类似的指标以获得比由当前方法所提供的结果更灵敏和更能预测人类生理机能的结果。
本公开的另一个目的是提供微工程化神经组织，其模拟天然的解剖和生理特征，并且易于使用高通量电生理刺激和记录方法来评价。
本公开的另一个目的是提供复制、操纵、修改和评价髓磷脂损害性疾病和外周神经病变潜在的机制的方法。
本公开的另一个目的是允许人神经细胞的神经调节的中至高通量的测定法用于筛查化学剂和生物剂的药理学和/或毒理学活性。
本公开的另一个目的是将诸如2D和3D微工程化神经束的技术的独特集合与人类神经细胞群体的光学和电化学刺激和记录结合使用。
本公开的另一个目的是定量仿生的工程化丘脑皮层回路中诱发的突触后电位。我们观测到神经束中逆行性生成的群体峰电位，这表明它们能够执行群体水平生理机能，如传导复合动作电位和突触后电位。
本公开的另一个目的是利用光遗传学方法、照射的硬件和软件控制，以及荧光成像来允许非侵入性刺激和记录神经回路中对诱发电位的多-单位生理响应。
本公开的另一个目的是使用微工程化回路来测试选择性5-H T再摄取抑制剂(SSRI)和第二-代抗精神病药以观察它们是否改变它们的发育成熟。
在一个实施方案中，利用使用数字微镜装置(DMD)进行的投影光刻来将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和Puramatrix水凝胶的组合微图案化，如图1中所示。这种方法使得能够将一种或多种水凝胶直接快速微图案化到常规的细胞培养材料上。由于光掩模从不与凝胶材料接触，因此多种水凝胶可以连续地快速固化，从而使得能够在没有自动化的情况下在1小时内制备许多凝胶构建体。这种方法使得能够使用聚乙二醇(PEG)(一种机械上稳固的细胞生长限制性凝胶)将神经突生长约束在仿生的生长促进凝胶内。在一些实施方案中，这种生长促进凝胶可以是Puramatrix、琼脂糖、或甲基丙烯酸酯化的葡聚糖(methacrylateddextran)。在使胚胎背根神经节(DRG)外植体在这一受约束的三维环境中生长时，轴突以高密度和束化从神经节长出，如图5和图6中所示。大部分轴突表现为小直径、无髓鞘的纤维，所述纤维在2周至4周内生长到接近1mm的长度。具有从神经节延伸出的密集的、高度平行的、三维的神经纤维束的这一培养模型的结构大致类似于外周神经构造。它的形态可以使用神经形态测定法来评估，从而允许进行对于传统的细胞测定法来说不可用的临床类似的评估。
在一些实施方案中，该培养模型提供了记录由复合动作电位(CAP)产生的电诱发群体场电位的能力。示例迹线显示特征性均匀的、快速的、短潜伏期、群体峰电位响应，它们在高频(100Hz)刺激下保持一致，如在图8B中所看到的那样。该CAP可逆地由河豚毒素(TTX)消除，如图8E和图8F中所示，这证实药物可以被施用并且被证实具有作用。存在与远端神经束刺激相关的起始相延迟时间的可测量的延长，如在图8C和图8D中所看到的那样。所述响应对神经递质阻断剂不敏感，这表明诱发的响应主要是CAP而不是突触电位，如图10中所示。胚胎DRG培养物已经被有效地用作外周神经生物学的模型达数十年。虽然作为模型系统是非常有用的，但是已知常规的DRG培养物在用传统的细胞活力测定评估时对临床毒性的预测性不佳。虽然有可能在DRG培养物中进行单细胞膜片钳记录，但是没有记录CAP的报告，这是因为缺乏组织构造。在优选的实施方案中，本公开提供了类似于临床组织病理学和神经传导测试，评估组织形态测定和群体电生理学的能力。
在一些实施方案中，本公开使用人类神经细胞使神经组织在三维环境中生长，其中神经元细胞体被管束在一起并且位于与轴突纤维束不同的位置处，从而模拟天然的神经构造并且允许测量形态测定和电生理学数据，包括CAP。在一些实施方案中，本公开使用源自原代人类组织的神经元细胞和胶质细胞。在其它实施方案中，神经元细胞和胶质细胞可以衍生自包括诱导多能干细胞在内的人类干细胞。
在另一个实施方案中，本公开使用传导速度作为在毒性条件和治疗条件下神经组织状况的功能量度。有关髓鞘形成程度、髓磷脂健康情况、轴突转运、mRNA转录以及神经元损伤的信息可以通过电生理学分析来确定。结合神经密度、髓鞘形成百分比以及神经纤维类型的形态测定分析，可以确定所关注的化合物的作用机制。在一些实施方案中，本文所公开的装置、方法，以及系统可以合并遗传突变和药物而以受控方式再现疾病现象，从而使得更好地了解神经变性和可能的治疗疗法。
本公开涉及包括任何所公开的组合物的系统，以及使用所述系统捕获所涉及到的与使用二维组织培养系统或未使用多种细胞类型的系统收集的数据相比在生理学上更具相关性的数据的方法。在一些实施方案中，本文公开的系统或组合物包括一个或多个包含任何突变的细胞。在一些实施方案中，至少1、100、500、1,000或更多个细胞包含与人类疾病的特定模型有关的突变。任何所公开的系统均可包括具有下表B中公开的突变的细胞。在一些实施方案中，本公开的细胞包括或表达表B中公开的内源性突变蛋白或至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的那些突变蛋白，因此那些模型细胞可用于测试添加到该系统的某些药物、生物分子或其他治疗剂的功效或毒性。该模型也可用于了解在环境污染物、病原体或内源性表达蛋白的背景下的基本生物学，以及基于此种信息诸如对剂的响应以及细胞本身的轴突生长、髓鞘形成和髓鞘脱失或形态变化了解此类分子如何影响神经系统。
表B-突变
在一些实施方案中，所公开系统中的至少一个细胞包括在表B中标识的基因座处的突变中的任一个或多个。如果表B公开了mRNA序列，则该细胞的一个或多个突变可能位于上面的GenBank序列处公开的互补内源性DNA序列中。在一些实施方案中，该细胞包括上面表B中标识的序列中一个或多个序列的突变，或者包含与表B中公开的任何序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，或者，如果该序列是mRNA序列，则该细胞可包括表B中标识的那些序列的一个或多个互补DNA序列的突变，或者这样的突变，其是包括与表B中公开的任何序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列或与其互补。
在一些实施方案中，本文公开的球状体包含表B中标识的基因中的2、3、4或5个或更多个突变。如果在本文公开的系统内使用包含表B中标识的特定突变的球状体，则该对应系统可以用作上面标识的对应疾病状态的体外模型。
在一些实施方案中，如PCT/US2015/050061中所描述的任何组合物、系统或方法均可用在本公开的实施方案中。
在一些实施方案中，该方法涉及制造用于培养细胞的系统、培养板或装置的方法，该方法包括获得干细胞诸如诱导多能干细胞，将该细胞暴露于一种或多种细胞生长因子中，使该干细胞分化为神经元细胞，以及将该细胞接种到包括第一和/或第二腔体或孔的固体衬底。在一些实施方案中，该第一和/或第二腔体是U形底孔、曲面底孔或平底孔。在一些实施方案中，该方法包括接种约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、125、150、175、200、225或250千个细胞。在一些实施方案中，接种该细胞的步骤包括将一个或多个f细胞接种在固体衬底内隔开的一系列腔体或孔中，并且每个腔体或孔均包含细胞培养基。在一些实施方案中，在该腔体或孔中接种的步骤包括以定位于固体衬底内的图案接种该细胞，以使得每个孔包含细胞的球状体，并且每个球状体以悬浮液或悬滴形式生长。在一些实施方案中，制造用于培养细胞的系统、培养板或装置的方法包括使细胞能够不受干扰地被培养足够的时间，以使其自发地形成一个或多个球状体。
本公开还涉及通过将剂暴露于固体衬底内腔体或孔上或内的一个或多个球状体中来测试所述剂毒性的方法。在一些实施方案中，该方法进一步包括使所述剂暴露于所述一个或多个球状体，持续足以使所述剂被所述一个或多个球状体的一个或多个细胞吸附的时间，以及然后通过记录、观测形态变化或两者的组合来测量该细胞的活力。
本公开还涉及形成衍生自干细胞的细胞或来自受试者神经系统的细胞的球状体的方法。在一些实施方案中，形成球状体的方法包括：(i)使细胞从干细胞分化为一种细胞或多种细胞类型，所述细胞类型是神经元细胞、星形细胞、施万细胞或本文公开的任何其他细胞中的一种或组合，以及然后(ii)将所述一种或多种细胞混合一段足以形成球状体的时间。在一些实施方案中，该方法不包括在形成球状体之后使任何细胞分化的步骤。在一些实施方案中，该方法没有将球状体或任何细胞暴露于一个或多个DRG中。
以下实施例旨在作为如何制备和使用本申请中公开的实施方案的非限制性实施例。在实施例或说明书的主体中公开的任何出版物、专利或专利申请均通过引用的方式整体并入本文。
实施例
实施例1：用于临床前神经毒性测试的人运动神经芯片
目的是开发器官型的微生理模型，以模拟外周神经的形态并支持临床上类似的生理测量结果。神经芯片设计是使用微工程化水凝胶支架(图1A-图1B)制造的。
该设计的目的是引导并限制3D轴突生长以及细胞定位以模拟神经纤维束(图2)。稳健的神经生长、成束和胶质相互作用促进了形态和生理输出作为神经毒性和药理学操作的高内涵筛查测定法(图3)。
结果显示出类似于天然外周神经解剖学的构造。这允许进行神经密度、纤维类型和髓鞘形成的测试以及轴突生长、细胞迁移和胶质分化的研究(图4-图7)。
实施例2：大鼠脊髓纳米梭球状体方案
第1天(图12)：
1.从E15大鼠幼崽分离出6条脊髓，确保除去所有背根神经节。
2.用弹簧剪刀将全部6条脊髓切成小块。
3.使用1000μL移液器，将切成块的脊髓和培养基转移至1.5mL微量离心管中。
4.通过以700rcf离心2分钟30秒来使脊髓块沉淀。
5.将上清液从微量离心管中取出，注意不要破坏沉淀物。
6.向微量离心管中加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA，确保该沉淀物被打散并悬浮在胰蛋白酶中。
7.在37℃下温育15分钟。
8.通过向含有1.5mL胰蛋白酶抑制剂溶液的15mL管中加入胰蛋白酶+细胞悬浮液来淬灭胰蛋白酶-EDTA。
9.通过以700rcf离心5分钟来使脊髓块沉淀。
10.将上清液从15mL锥形管中取出，注意不要破坏沉淀物。
11.向含有沉淀物的15mL锥形管中加入2mL脊髓铺板培养基。
12.用100μL移液器研磨15次(将移液器设置为1mL体积)以便将块打散。
13.向解离的脊髓溶液中再加入3mL脊髓铺板培养基。
14.使全部5mL解离的脊髓溶液通过40μm细胞过滤器，将滤过的培养基收集在培养皿中。
15.在每个12孔PLL盖玻片的顶部上添加300μL解离的脊髓溶液。该培养基应在盖玻片顶部保持鼓泡，而不能溢出盖玻片边缘，从而淹没孔。为确保完全覆盖盖玻片，轻轻地倾斜12孔板以使解离的脊髓溶液铺展在整个盖玻片上。重复此操作，根据需要在其他方向上倾斜以达到完全覆盖。
16.将铺板的细胞在37℃温育2小时。
17.2小时后，轻轻地移出铺板培养基，并用700μL N2:NG培养基替代。将N2:NG培养基添加到该孔的侧面，以防止流体流动将铺板的细胞从衬底上移出。
第2天：
1.通过向孔中加入0.5mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA，牺牲一个孔的铺板的细胞来进行计数。
2.在37℃下温育4分钟。
3.将从衬底上取出的胰蛋白酶和细胞转移到含有0.5mL用于稀释胰蛋白酶的神经基础培养基的1.5mL微量离心管中。
4.研磨10次以将细胞间的粘附打散，从而得到细胞溶液。
5.使用锥虫蓝和血细胞计数器计数该孔中存在的细胞数目。
6.按每60,000个细胞1μL的比率，向剩余的孔中加入纳米梭。尝试将纳米梭溶液分散在盖玻片的整个区域上。
7.放回温育箱作进一步培养。
第3天：
1.向每个孔中加入0.5mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA。
2.在37℃下温育4分钟。
3.将从衬底上取出的胰蛋白酶和细胞转移到含有一定体积的N2:NG培养基的15mL锥形管中，该N2:NG培养基的体积等于胰蛋白酶稀释量。
4.将该细胞溶液以700rcf离心5分钟。
5.除去上清液，并用2mL N2:NG培养基替代。
6.使用1mL注射器和20号针头，通过研磨5次将细胞沉淀物打散。
7.向细胞悬浮液中再添加5.2mL N2:NG培养基(总共7.2mL)。
8.量取该细胞悬浮液的样品10μL，并使用锥虫蓝和血细胞计数器计算每毫升的细胞数。
9.计算需要添加到每个96孔中的细胞悬浮液的体积。
例如：每孔500,000；400,000；或300,000个细胞
10.确保非粘附96孔板位于磁驱动器的顶部(图11)，然后向每个非粘附96孔中加入适当体积的细胞溶液。必要时再向该孔中添加N2:NG培养基，以使每个96孔具有150μL的体积。
11.将该96孔板放回温育箱中，并使球状体不中断地(undisrupted)形成2天。
第5天：
1.制备PEG构建体。如果需要指导，请参阅其他方案。
2.用2％反/反清洗溶液(anti/anti wash solution)洗涤3次。
3.在清洗溶液中在37℃下储存过夜。
第6天：
1.将96孔板从磁驱动器顶部取下。
2.使用1000μL移液器(设置至100μL)，轻轻地吸打(pipet)每个96孔中的流体以使球状体悬浮。
3.使用10μL移液器(设置至10μL)，从该96孔中移出该球状体。
4.将该球状体加入到置于冰上的培养皿中的2mL培养基中。
5.第二次将该球状体转移到置于冰上的空培养皿中。使用设置至4μL的10μL移液器。这有助于清除从96孔转移的任何细胞碎片。
6.通过将基质胶与N2:NG培养基混合来制备用于细胞封装的1:20的基质胶稀释液(必须考虑通过球状体转移加入的培养基)，确保将所有溶液都置冰上保存(低于10℃)以防凝胶化。
例如：对于200μL 1:20基质胶，其具有4个球状体、10μL基质胶、178μL N2:NG培养基以及与球状体一起转移的12μL培养基。因此，在这个步骤中，将10μL基质胶添加到178μLN2:NG培养基中。
7.将混合的基质胶和N2:NG培养基添加到空培养皿中的球状体中。
8.将rain-xed载玻片放入磁性放置装置(magnetic placement device)中(图13)。
9.将含有PEG构建体的Transwell***物放在载玻片的顶部上。
10.操纵该磁性装置，以将磁体对准在需要球状体的地方的空隙下。
11.使用10μL移液器套装，将该球状体和1:20基质胶溶液转移至该空隙。释放在磁体顶部上的球状体(图14B)。
12.对Transwell***物中的所有构建体重复步骤10-11。
13.使该基质胶在37℃胶凝30分钟。
14.将N2:NG培养基添加在该***物下方。
15.根据需要进行培养。
实施例3
用于神经突定向生长的球状体
圆形底/U形底平板：将未处理的球状体微孔板(96孔，带有明显的“U”形圆底(Corning REF：4415)用于一种分化的细胞类型或分化的细胞类型的组合。使用血细胞计数器对重悬的细胞进行重新计数。相应地，使用微量移液器按每个球状体所需的密度(从五千个到十万个细胞)将细胞添加到每个孔中。然后，将球状体微孔板以对应于悬浮液中细胞类型的离心速度离心5分钟，放入37℃温育器中24小时或更长时间，直到球状体形成。
悬滴板：将来自3D bioMatrix的Perfecta3D悬滴板用于球状体制造。将已知量的分化型诱导多能细胞衍生的神经元和胶质细胞(5,000至100,000的任何数量)悬浮在少量培养基中。改变分化细胞的比率以实现球状体形成以及球状体形成后的生长特性。将细胞悬浮于40uL体积中，然后移液到平板顶部上的出入洞(access hole)中。然后，将细胞放入常规5％CO2温育器中自组装至少24小时以使球状体形成。
下表给出了球状体制造的不同方法：
表1：球状体生产
表2：细胞比率
球状体组成
水凝胶的刚度
1.
基质胶
弹性模量<1000Pa
2.
胶原蛋白I
弹性模量<10kPa
3.
明胶甲基丙烯酸酯
弹性模量<30kPa
将球状体转移到神经芯片构建体中
为了移动该球状体以进行3-D构建体放置，通过将6孔经组织培养处理的板(Transwell，直径24mm，孔隙尺寸0.4μm，REF：3450-透明)内使用的每个孔总共1500uL PBS中的500uL移出来对构建体进行干燥，在每个孔中，该膜顶部被部分干燥以供球状体放置用。然后，将8％的基质胶加入到3-D构建体的内部部分中，然后放置在37℃温育器中30分钟。
然后，使用p1000移液器取出该球状体，并以微滴形式放置在35mm经组织培养处理的培养皿(Cell Treat CAT:229635)中。然后，使用已灭菌的Dumont#4镊子(长度11cm，标准的0.13x 0.08mm Dumostar 11294-00)将球状体放入到3D构建体“球泡部分”中。然后，将1500uL培养基放置在该6孔板的膜下，并放置在37℃温育器中。
实施例4
神经肌肉接头(NMJ)的3D肌肉细胞封装部分
将未分化的原代人成肌细胞以供应商指定的密度接种到未包被的组织培养容器上，在第1、2、4天等喂入含血清的生长培养基，以触发细胞***至达到60％融合度。当达到60％融合度时，用胰蛋白酶传代细胞至第6代。在达到P6和60％融合度后，从具有胰蛋白酶的培养容器中移出原代人肌肉成肌细胞，离心并将其重悬于培养基中用于计数目的，再次降速旋转并重悬于DMEM/F12中至细胞浓度为800万/mL。
制备5％GelMA溶液、添加有层粘连蛋白和正乙烯基吡咯烷酮的0.05％LAP溶液，并将其与细胞悬浮液混合，以使细胞浓度达到200万/mL。将成肌细胞/GelMA/LAP溶液吸移到先前制造的细胞不可穿透的聚乙二醇(PEG)构建体的特定腔室中，其中它与任何含运动神经元的腔室是隔开的。通过将腔室中的溶液暴露于UV光，实现含200万细胞/mL的载有细胞的GelMA/LAP的聚合。
可替代方法需要直接将细胞重悬于GelMA/LAP溶液中至200万/mL的浓度。(省略了在培养基中悬浮和第二个离心步骤)。
成肌细胞在三维上的分化是通过培养基更换实现的。第1-3天需要给构建体喂入相同的生长培养基。第4天的培养基更换将培养基更换为由DMEM/F12和马血清制成的分化培养基。
由于培养基和通过高密度封装方法实现的旁分泌信号传导的原因，构建体在最长3周的过程中分化。
通过使用组织学技术(包括利用针对由多核肌管专门表达的蛋白质的抗体(包括抗结蛋白和抗α重链肌球蛋白)以及DAPI荧光标记肌细胞)，或者观察单个细胞体是否含有多于两个细胞核来证实分化。
实施例5：球状体研究
在这项研究中，我们描述了体外、微工程化、仿生、全人外周神经(人神经芯片)[HNoaC])，其包含诱导多能干细胞(iPSC)衍生的神经元(hN)和原代人施万细胞(hSC)，可提供适合于综合神经传导速度(NCV)和组织病理学评估的数据。这种全人系统是我们先前使用胚胎大鼠背根神经节(DRG)神经元和大鼠SC开发的体外“神经芯片”(NoaC)平台的重要扩展5。据我们所知，任何其他基于干细胞的体外神经系统先前都未实现hN和hSC的这种组合。这种模型模拟了稳健的轴突长出(～5mm)，显示了人iPSC衍生的神经元的人施万细胞髓鞘形成的迄今为止的第一个证明以及在全人体外系统(如体内模型)中进行神经传导速度测试的迄今为止的第一个证明。因此，该创新的人外周神经HNoaC模型具有加速人类疾病建模、药物发现和毒性筛查领域的潜力。
施万细胞培养
T-75培养烧瓶(353136；Corning，Corning，NY)是通过用经无菌过滤的0.1％在无菌水(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中的多聚-L-鸟氨酸(PLO；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶液涂布制备的。然后，用无菌水洗涤该烧瓶四次。将7.5mL 10μg/mL在磷酸盐缓冲盐水(PBS；Caisson Labs,Smithfield,UT)中的层粘连蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)加入到该烧瓶中，将其在4℃保持过夜。抽吸该层粘连蛋白溶液，并将15mL培养基直接放入到T-75培养烧瓶中，然后在细胞铺板之前将其置于37℃温育器中进行平衡。
人施万细胞(hSC)培养基购自ScienCell(Carlsbad,CA)。收到的人施万细胞系(货号1700；ScienCell)是放置在冷冻小瓶中的，据报道其具有5x 105个细胞/mL。将该小瓶从冷冻保存中取出，并在37℃水浴中解冻。将该小瓶的内容物均匀分配到PLO/层粘连蛋白包被的T-75烧瓶中。将该培养物不被打扰地置于37℃下的5％CO2气氛中至少16小时，以促进附着和增殖。每24小时更换培养基一次。在达到80％融合度后，使用3mL
运动神经元培养物
使用100mL补加有2mL神经补充剂A(FUJIFILM Cellular Dynamics,Inc)和1mL神经系统补充剂(FUJIFILM Cellular Dynamics,Inc)的神经元基础培养基(FUJIFILM Cellular Dynamics,Inc,Madison,WI)制备运动神经元(hN)培养基。为了为解冻运动神经元作准备，将hN培养基温热至RT，并向无菌的50mL锥形管中加入1mL hN培养基。将一小瓶人运动神经元(hN；FUJIFILM Cellular Dynamics,Inc)在37℃水浴中解冻约2分钟30秒。将小瓶内含物在旋涡运动下以滴加的方式转移到含有1mLhN培养基的50mL锥形管中，以使该细胞溶液完全混合并最大程度地减少对解冻细胞的渗透冲击。然后，用1mL hN培养基冲洗细胞小瓶并转移至50mL管中。然后，通过在旋动的同时向50mL离心管中缓慢滴加(2-3滴/秒)hN培养基来使溶液的体积达到10mL。然后，将细胞溶液转移到15mL锥形管中，并在室温下以200x g离心5分钟。抽吸上清液，并通过轻弹试管，然后上下吸打2-3次，将细胞重悬于1mL hN培养基中。然后，量取10μL细胞溶液样品，以使用血细胞计数器进行细胞计数。
球状体制造
将未经处理的透明“U”形圆底96孔球状体微孔板(4515；Corning)用于人神经元(hN)和人施万细胞(hSC)的单培养以及hN/hSC的共培养。为hSC和hN二者计算出培养基的以细胞/μL表示的浓度，以便计算产生具有以下大小和组成的球状体所需的体积：hN单培养-100000、75000、50000或25000；hSC单培养-75000、50000或25000；以及75000hN与75000、50000或25000hSC的共培养。将计算出的体积添加到微孔板中，然后通过添加温热至37℃的培养基来使每个孔的体积达到200μL。然后，将球状体微孔板以200x g离心5分钟，并放入37℃温育器中在5％CO2气氛中温育，直至观测到球状体形成(通常大约48小时)。每隔一天补充hN培养基，更换一半95μL，然后用100μL新鲜温热(温育至37℃)的hN培养基替换。
3D双重水凝胶神经生长构建体的制造
使用与先前所述方法相似的微光刻技术，在
将球状体转移至水凝胶构建体使用hN培养基(如上所述)制备两类培养基，以在3D构建体中诱导髓鞘形成。使用hN培养基、10％的HyClone优等胎牛血清(FBS；LaCell LLC,New Orleans,LA)和1％抗生素-抗霉菌缓冲液制备预髓鞘形成培养基。用hN培养基、10％FBS、10ng/mL重组大鼠β-神经生长因子(NGF；R&D Systems,Minneapolis,Mn)和50μg/mL L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)制备髓鞘形成培养基。形成后，使用移液管将球状体从微孔板上转移，并置于35mm经组织培养处理的培养皿(Cell Treat,Pepperell,MA)上的hN培养基液滴中。然后，使用已灭菌的Dumont#5尖头镊子(11295-10；Dumont,Montignez,Switzerland)将球状体放入基质胶内的3D构建体“球泡部分”中。最后，将1.5mL预髓鞘形成培养基放在6孔板的膜下，并将加载的水凝胶构建体放入37℃温育器中在5％CO2气氛中温育。每隔一天更换一半培养基。将构建体置于预髓鞘形成培养基中保存1周，然后再切换至髓鞘形成培养基中保存3周。
免疫细胞化学。将6孔培养板中的所有孔用4％多聚甲醛(PFA；ElectronMicroscopy Sciences,Hatfield,PA)pH 7.4在室温下固定30分钟，然后用PBS洗涤4次，每次15分钟。然后，将固定的样品置于含PBS、5％正常山羊血清(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)、0.2％Triton-X-100(Sigma-Aldrich)以及0.4％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)的1X封闭液中在RT下封闭1小时，然后在封闭液中用以下一级抗体在4℃过夜标记：兔-α-s100(ab868,1:400；Abcam,Cambridge,MA)；或小鼠-α-βIII微管蛋白(ab78078,1:500；Abcam)。兔-α-髓磷脂碱性蛋白(MBP,ab133620,1:500；Abcam)也用于相同温育条件下的单独的试验中。第二天，在室温下用PBS洗涤各孔4次，每次8分钟。然后，用二级抗体Alexa488山羊抗兔IgG(1:300,Abcam)或Alexa 568山羊抗小鼠IgG(1:300,Abcam)和DAPI(1:200,Sigma-Aldrich)标记该板。在暗处在室温下，将二级抗体和DAPI溶解于1X封闭液中并保持90分钟。在暗处在室温下，用PBS洗涤该板5次，每次8分钟。然后，将该板用石腊膜封闭，用箔材封闭，并在4℃下保存直至使用Nikon A1共聚焦显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)进行显微镜检查。
塑料树脂包埋。除非另有说明，所有用于包埋的材料均购自Electron MicroscopySciences，并在化学品通风橱下处理并与推荐的个人防护设备一起使用。将水凝胶构建体从培养物中移出，并在室温下用PBS在跨膜孔的两侧洗涤3次，然后固定。然后，将水凝胶构建体浸泡在4％PFA/0.5％戊二醛的溶液中并保持30分钟。通过在黑暗条件下在室温下用1％在PBS pH 7.4中的四氧化锇进行后固定(post-fixation)2小时，实现细胞脂质的二次固定和染色。然后，用PBS洗涤构建体3次，持续15分钟，之后在黑暗条件下在室温下用2％醋酸双氧铀水溶液复染30分钟。在室温下用梯度乙醇清洗液进行脱水，首先用50％乙醇/PBS洗涤10分钟，用70％乙醇/PBS洗涤10分钟，以及用90％乙醇/PBS过夜洗涤。第二天，在室温下用100％乙醇洗涤构建体两次，持续30分钟。在解剖显微镜下，用解剖刀从跨膜孔中单独切下水凝胶构建体，而不移除PEGDMA。将构建体放在Flat Embedding Molds(EMS 70902,Electron Microscopy Sciences)中。给剩余乙醇留出从固定的水凝胶中蒸发的时间，然后用由Spurr树脂(低黏度包埋介质Spurr试剂盒；Electron Microscopy Sciences)和环氧丙烷的1:1混合物组成的入渗(infiltration)介质替代。将入渗介质放置75分钟，然后用100％Spurr树脂替代，将其在70℃烘箱中固化过夜，并在室温下固化48小时，然后再用超微切片机切片。
切片和透射电子显微镜(TEM)
在Louisiana State University(Baton Rouge,LA)的共享仪器机构(SIF)中进行切片和TEM评价。在HNoaC样本内的四个位置将超薄切片切成80-100nm的厚度：在该组织的球泡内、在球泡与通道和近端通道(即在球泡附近)相遇的地方，以及在远端通道。将切片放置在Formvar碳包覆的铜网格(200目)上，并通过在室温下浮于2％醋酸双氧铀液滴上20分钟来浸渍金属。然后，用去离子水液滴将它们冲洗3次，持续1分钟。为进行可视化，在不同放大倍数下按加速电压120kV使用JEOL 1400TEM(Peabody,MA)。
组织形态测定分析从HNoaC横截面的TEM图像获取的指标包括轴突直径和G比率(即，轴突直径与整个纤维[轴突+髓鞘]直径的比率)。轴突直径和G比率由两名不同的独立设盲研究者通过测量无髓鞘的轴突和用3层或更多层深色髓磷脂包装材料包裹的轴突来阐明。使用Fiji7中的标尺、阈值和度量函数(measure function)来测量G比率和轴突直径。通过随机采样10幅图像以查找具有3个或更多个髓磷脂薄片的轴突来计算G比率指标，而无髓鞘的纤维则通过从远端通道随机采样10幅轴突图像来测量。通过使用阈值函数来测量轴突直径，以找到轴突的总面积。然后，通过假定轴突为圆形，从面积计算直径。G比率的计算是基于内部轴突直径的简单线性估计，而整个纤维(由轴突和周围的深色染色的髓磷脂薄片组成)的外径是通过取给定神经纤维的最小直径和最大直径的平均值进行计算。由于在髓鞘的整个圆周上髓磷脂层的接近度不一致，因此需要这种平均化技术获得外径。G比率是取内径与平均外径之比计算的。当测量髓鞘的外部范围时，去除了施万细胞的大的有核体。
电生理学。在共培养一个月后，将含有重建的神经的
统计学使用GraphPad prism软件(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA,USA)，通过图基(Tukey)事后检验进行单因素方差分析(ANOVA)，以评价不同种类的球状体之间的尺寸差异。对于电生理学分析，计算了平均值和标准偏差，并进行了非配对t检验(GraphPad软件)。使用p值≤0.05分配平均值间的显著差异。
结果
施万细胞增强了神经元向球状体的组装。为了产生与神经芯片(NoaC)系统的尺寸(即直径小于1,000μM，并维持大量细胞)相协调的球状体，我们制造了具有不同细胞密度的球状体。我们还比较了不同球状体的尺寸，以了解hN和hSC之间的相互作用。在将所需数目的细胞放入低附着圆底板上之后，我们每天监测球状体的形成。hSC的单培养在约2天内形成球状体，并且发现形状规则且边缘锋利(图43a-43c)。相反，hN的单培养在2天内没有自组装成球状体，相反形成了许多较小的球形结构(图43g-43i)。在共培养中，与由单独hN形成的球状体(～3-9天，图44)相比时，hSC促进hN并入到球状体中(～2天)。与含单独hSC的球状体相比，共培养球状体的边缘(图43d-43f)的清晰度较差，这可能是共培养球状体的非均匀特性所致。有趣的是，发现包含75,000个hN和75,000个hSC的共培养球状体的尺寸(1025±52μm)与单独75,000个hSC的尺寸(967±51μm)非常相似，表明共培养球状体被填充得更密实，从而确认这两种细胞类型彼此具有亲和力。
通过测量不同球状体类型中每一种类型的直径(图43和图44)，我们确定具有75,000个神经元是构成hNoaC系统的最佳hN数目，因为当我们分别用25,000、50,000和75,000个hSC制备共培养球状体时，发现球状体尺寸为约833±108、948±39和1025±52μm。仅神经元的培养物显示，随着细胞数目的增加，球状体的尺寸可预测地增加。全部四个hN条件(图44)均发现球状体尺寸有连续的显著增加，表明跨越四个球状体(25K、50K、75K和100K)的填充密度基本上没有变化，并且细胞总数对球状体尺寸的影响大于球状体中各种细胞类型间的相互作用。
共培养球状体显示出在NoaC系统中稳健的神经突长出
虽然双重水凝胶系统的外部是用抗生长的10％PEGDMA制成的，但该通道的内部却充满了完全浓缩的(8-12mg/mL)基质胶作为促进生长的底物。凝胶形成后，将球状体轻轻地转移到该通道的球泡部分的顶部上，并使其在含有10％FBS但缺乏NGF的培养基中生长以增强hSC的增殖和迁移，同时使神经突从hN延伸延迟。一周后，将温育溶液切换成补加有NGF和L-抗坏血酸的培养基，以便通过使hSC与生长中的轴突接触来促进神经突生长和髓鞘形成。
共聚焦成像揭示了重建的体外神经的3D特性，并显示在通道的整个深度范围内都存在细胞体和轴突(图45)。神经突每周平均生长～1mm。FBS的添加是优化髓鞘形成的关键因素，因为含抗坏血酸但不含FBS的基础培养基不支持hSC迁移和髓鞘形成(数据未显示)。四周后用S100免疫染色显示，hSC细胞迁移至该球状体外部约1-1.5mm处，并沿着生长中的轴突伸长(图45A-45C)，而轴突则到达了充满基质胶的通道的尽头(～5mm)。有趣的是，对于许多共培养的样品，球状体影响轴突的生长，使得它们生长一定距离后似乎往回长，这可能是由于球状体中hSC释放的生长因子所产生的趋化作用所致。随着该球状体中hSC数目的增加，对轴突的影响更加突出。
体外人神经的髓鞘形成和神经纤维结构
最后，连同免疫染色和共聚焦显微镜，我们还进行了塑料树脂包埋和切片，以便用TEM评价系统中髓鞘形成的水平和质量。系统中有效的髓鞘形成的证据包括但不限于未压实的髓磷脂(图47A)、致密的髓磷脂(图47B)和处于压实过程中的髓磷脂(图47C)。对于我们在其中发现髓鞘形成的证据的轴突，有髓鞘的神经纤维的G比率为0.57±0.16。有髓鞘的轴突和无髓鞘的轴突的轴突直径分别为0.55±0.33和0.40±0.15μm。我们还发现了无轴突的薄片状髓磷脂形成(图5D)、胞质内薄片状体的存在(图47E)和裸露的(无髓鞘的)轴突(图47F)的证据。胞质内层状体(由间隔相对规则的膜螺纹组成)的出现被认为代表与衰老细胞器再循环相一致的自噬体的产生。层状体分布稀疏并且未观测到凋亡核，表明受影响的细胞未参与程序性细胞死亡。
体外人神经显示出有效的组成依赖性电导率为了确定我们是否可以测量含或不含人施万细胞(hSC)的iPSC衍生的人神经元(hN)的神经传导速度(NCV)，我们使用类似于脑片电生理学的技术。我们刺激了该通道内的轴突，并记录了来自细胞体的复合动作电位(CAP)(图46A)。在距细胞体约1-3mm处刺激轴突，并计算脉冲在刺激电极和记录电极之间传播的距离。我们评价了两类NCV：起始NCV和峰值NCV，目的是确定最快的信号和峰值信号之间的差异(图46B’-46B”)。令我们惊讶的是，我们发现hN/hSC共培养样品的起始和峰值NCV与hN单培养样品相比略慢。确定了对于75K hN单培养和75K/25K hN/hSC共培养的起始NCV分别为0.28±0.07和0.20±0.02m/s，同时发现峰值NCV分别为0.18±0.04和0.13±0.02m/s(图45C)。从SC数目较高的样品(以75K/75K和75K/50K的hN/SC共培养)很难确定起始和峰值NCV。样品的定性检查揭示，在共培养样品情况下神经突长出不太致密，这可能会降低NCV。
在这项研究中，我们提出了作为神经芯片(NoaC)平台组装的第一个外周神经仿生性全人体外模型。这种微工程化双重水凝胶系统将神经元细胞体保持在限定的位置(即“神经节”)，并将致密的3D轴突长出限制在远离簇状细胞体线性延伸的狭窄通道(即“神经”)内。该系统支持评估与外周神经病变相关的神经病理状况所需要的当前“金标准”功能(例如，电生理学测试)和结构(例如定性和定量显微镜分析)终点，这代表了日益增长的医学关注。这项研究的创新方面包括神经元-施万细胞共培养球状体的可再现的制造、稳健的活力(～4周)和广泛的神经突体外长出(～5mm)、人原代施万细胞(hSC)所致人iPSC衍生的神经元(hN)的有效髓鞘形成，以及在适用于人类疾病建模、药物发现和毒性筛查的体外环境中测量神经传导速度(NCV)的能力。生产体外神经系统的挑战。使用原代hSC的体外髓鞘形成长期以来一直都是一个挑战，部分原因是从成人神经中提取hSC相关的并发症8,9、成纤维细胞所致污染8-10，以及SC在体外向增殖/非髓鞘形成表型的转化11,12。对于胚胎、新生和成年啮齿类动物SC所致的大鼠背根神经节(DRG)感觉神经元的髓鞘形成而言，共培养条件已经确立得相当充分了13-15。但是，类似的共培养条件不能使用与大鼠DRG神经元一起培养的人SC再现髓鞘形成11。严格纯化原代人SC或者使人干细胞或人成纤维细胞分化为SC样细胞会导致大鼠感觉神经元的髓鞘形成水平有限，但在混合物种培养物中观察到的程度与使用胚胎大鼠SC达到的程度相比明显较低11,16，这可能是由于与轴突数目相比的物种差异或SC密度所致。最近，Clark和同事17成功地证明了大鼠SC可以使人干细胞衍生的感觉神经元发生髓鞘形成。然而，显示由人施万细胞引起的人iPSC-衍生的神经元的髓鞘形成的体外系统仍然难以捉摸。
在过去的几年中，许多研究都集中于创建神经元-胶质类器官，以便在体外形成大脑样组织18-22。有趣的是，所有这些策略都集中于将神经祖细胞的聚集体分化为更明确的神经结构。相比之下，我们通过将两种分化的细胞类型集合在一起以评价它们彼此之间的相互作用以及自组装的潜力，对该过程进行了逆向工程改造。为了模拟体外胚胎背根神经节(DRG)的生长，我们使用超低附着96孔板生产神经元-施万细胞球状体，以促进轴突和SC之间的串扰，这对于SC向髓鞘形成表型分化是重要的23,24；因此，通过将轴突和SC在3D球状体中紧密结合，我们增加了交叉交流和成功髓鞘形成的机会。加入抗氧化剂抗坏血酸后，我们观测到原代人施万细胞所致干细胞衍生的人神经元的体外髓鞘形成的有史以来第一个证据。hN和hSC都各自具有不同的自组装和球状体制造速率，但是与仅神经元条件相比，将hSC组合在一起提高了球状体自组装的质量并改善了球状体自组装的速度。基于球状体直径，发现共培养球状体与hN或hSC球状体相比更为致密，表明两种细胞类型之间的相互作用增强。
施万细胞迁移出球状体。施万细胞迁移是受伤后发育和外周神经再生期间的关键现象25。将神经嵴细胞的命运引导到施万细胞前体并最终引导到施万细胞的线索大体上仍然未知；然而，数十年来已知的是前体细胞和施万细胞都依赖于生长中的轴突进行分化、增殖和功能成熟26。在这里，我们第一次能够通过创建由hN和hSC组成的这种迷你神经节，观测到人类起源的组织在体外的这种迁移。轴突与迁移的hSC一起向外延伸，在此过程中它们自身与生长中的轴突对准。有趣的是观测到与约5mm的总轴突生长相比，hSC仅迁移至该球状体外部约～1mm处。这可能是由于与典型2D共培养实验相比，在这些实验期间添加的hSC数目相对于神经元较低，在典型2D共培养实验中，常规惯例是在较小的2D区域中加入>100,000个施万细胞17,27。与轴突长出相比，hSC的这种适度延伸也可能是只有一周的预髓鞘形成期以及在第一周的生长后向培养基中添加NGF的结果。NGF已被证明可增强神经元-施万细胞相互作用，也可增强髓鞘形成28，因此可能是减少SC迁移的因素。基于人SC在该球状体外的迁移，这种HNoaC模型还可以用于研究在存在治疗性分子的情况下SC的迁移潜力，从而为外周神经损伤的患者提供可能的疗法。
已知hSC与大鼠施万细胞相比在体外具有不同的表现，这是就它们对促***原和生长因子的反应性以及它们不能再现髓鞘形成而言的29。我们的人神经3D球状体模型展示了在尸体解剖或活检程序中获得的神经中观测到的神经干的典型特征。轴突具有包括细胞骨架细丝和线粒体在内的细胞器的完整补体，并且经常但不总是与以紧密邻近的髓磷脂薄片为特征的髓鞘有关。髓磷脂层在神经纤维间的分布(apposition)是不同的，并且在一些情况下，在不存在轴突的情况下形成薄片状髓磷脂；在体内收获的分化神经中很少遇到这些结果，表明在培养中确实发生了一些分化状态的差异(正如预期的那样)。就是说，在共培养系统的迷你神经部分中观测到足够数目的有髓鞘的轴突，从而使它成为混合体细胞神经(即含有有密集髓鞘的、有稀疏髓鞘的和无髓鞘的轴突的那些)的合适替代物。神经传导速度(NCV)评价
已知不同的神经病会表现出不同类型的神经生理学特征30。因此，体外微工程化神经应当能够将电生理变化确定为进行研究性和机械性毒理学研究的方式。在这项首次使用人iPSC衍生的神经元研究神经传导的研究中，我们能够观察到有髓鞘的和无髓鞘的人轴突之间神经传导速度(NCV)的差异，这表明该系统具有足以评价神经功能的敏感性。令我们惊讶的是，与无髓鞘的仅hN的单培养样品相比，有髓鞘的hN/hSC共培养样品显示出较慢的NCV。培养物的定性检查显示，球状体中的hSC数目可能减少了HNoaC通道中的长出和轴突密度，这很容易导致NCV降低。此外，由于许多轴突在高SC(50K和75K)密度共培养中似乎往回长，因此我们无法确定刺激点和记录点之间的最佳长度，这可能影响NCV计算。此外，共培养球状体中非神经元细胞体的存在降低了从适当刺激的细胞体记录的可能性。重要的是，发现来自hN的NCV与在人类患者中获得的NCV值相比要低得多31-33。考虑到体外系统在室温下由iPSC衍生的神经元组成，该神经元与体内评估的神经的成熟有髓鞘的轴突相比不太成熟，因此这并不特别令人惊讶。
这种全人NoaC系统的简单设计为翻译研究开辟了新途径。该平台不仅可以用于根据临床相关的电生理学和组织病理学指标筛查候选药物，还可以用于研究驱动神经疾病(包括但不限于毒性、髓鞘脱失和其他神经退行性病状)的基本机制。对于给定的操作或治疗，比较从我们的概念上相同的大鼠NoaC6和人NoaC获得的数据将有助于弥合非临床测试与我们预测人类的响应和潜在安全风险的能力之间的差距。
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实施例6：感觉突触模型
大鼠背根神经节(DRG)神经元与大鼠脊髓的背角(DH)细胞的共培养先前已被证明(Ohshiro等，2007；Vikman等，2001)。当一起培养时，该DRG神经元突触到背角细胞上。这一3D模式的大鼠DRG至DH突触模型的开发将是开发人脊髓DH传入感觉突触模型的第一步。
这个实验的关键是DRG神经元通过GelMA延伸轴突并在DH神经元上突触。实验室中先前的实验表明，脊髓球状体生长可以由凝胶的刚度进行控制，并且在GelMa中不能很好地生长。利用此特性，我们旨在创建单向神经元回路，其中DH轴突不能生长到GelMA中，但生长在整个基质胶中，在这里中复合动作电位(CAP)可被记录。
从胚胎第15天大鼠脊髓分离背角和DRG并解离。然后，将细胞在96孔U形底板中的球状体培养物中单独地培养。铺板后两天，球状体形成，然后将其置于双重水凝胶构建体中，以使神经元以3D形式生长(图48A)。将DRG置于GelMA中构建体的底部钥匙洞中，同时将DH球状体置于进入基质胶的中间钥匙洞中。用β3-微管蛋白对该培养物染色证实了在28DIV时轴突从培养物中这两种球状体生长(图48B)。在DH球状体处获取CAP记录，而将刺激电极放置在DRG轴突上。对于这种培养物，测得该电极之间的距离为3.1mm(图48C)。CAP的跟踪记录实例显示，当刺激DRG轴突时，DH球状体产生响应(图48D)。这表明DRG正在DH神经元上突触化并激活CAP响应从其记录的DH神经元。未来的实验将集中于确认这些突触的形成并将该模型转换为人的格式。
Ohshiro H，Ogawa S，and Shinjo K.Visualizing sensory transmissionbetween dorsal root ganglion and dorsal horn neurons in co-culture withcalcium imaging.J Neurosci Methods，2007，165：49-54.
Vikman K，Backstrom E，Kristensson K，and Hill R.A two-compartment invitro model for studies of modulation of nociceptive transmission.J NeurosciMethods 2001；105：175-184.
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