具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

在本实施例中，我们基于治疗用量需求及制备便捷性，选择腹腔巨噬细胞来源的胞外囊泡(M2-EVs)作为研究对象，探讨其在急性炎症模型中的作用。

1.材料和仪器

1.1实验动物

SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠，体重20-25g，购自成都达硕实验动物有限公司，于室温20-25℃，70％湿度条件下分笼饲养，给予自由饮食喂养，12h明暗交替，该饲养条件符合“四川省医学类实验动物饲养和管理条例”(国标GBI4925-2001)。

1.2主要实验试剂和材料

1)胎牛血清(FBS)，Gibco，美国

2)胰蛋白酶，Gibco，美国

3)DMEM培养基，Gibco，美国

4)RRMI 1640培养基，Gibco，美国

5)青霉素/链霉素，碧云天，中国

6)M-CSF、IL-4、IL-13，近岸生物，中国

7)LPS，Sigma，美国

8)γ-IFN，Sigma，美国

9)Anti-HSP70 antibody，Abcam，英国

10)Anti-TSG101 antibody，Proteintech，美国

11)Anti-ALIX antibody，Proteintech，美国

12)Anti-GM130 antibody，Cell Signaling Technology，美国

13)BD PharmingenTMAPC-CyTM7 Anti-mouse CD45，BD，美国

14)BD PharmingenTM PE RatAnti-Mouse F4/80，BD，美国

15)APC anti-mouse CD11cAntibody，Biolegend，美国

16)BD HorizonTM Fixable Viability Stain 700，BD，美国

17)IL-6ELISA检测试剂盒，达科为，中国

18)TNF-αELISA检测试剂盒，达科为，中国

19)HRP标记的小鼠抗兔二抗，Abbkine，中国

20)DAPI，Thermo Fisher Scientific，美国

21)RIPA裂解液，碧云天，中国

22)蛋白酶抑制剂，Calbiochem，美国

23)磷酸蛋白酶抑制剂，Calbiochem，美国

24)4×Loading buffer，Bio-Rad，美国

25)BCA蛋白检测试剂盒，康为世纪，中国

26)Prestainedprotein ladder，Thermo，美国

27)ECL超灵敏发光底物，Millipore，美国

28)细胞培养瓶、孔板、培养皿，BD，美国

29)CD11b+MicroBeads，Miltenyi Biotec,德国

30)10μl、200μl、1ml移液枪枪头，Eppendorf，美国

31)1.5ml、4ml、15ml、50ml离心管，BD，美国

32)多聚甲醛、KH2PO4、Tween-20、NaCl、KCl、Na2HPO4·7H2O、Triton X-100，科伦，中国

33)PCR引物合成，生工，中国

34)氯仿、异丙醇、无水乙醇、甲醇、生理盐水、二甲苯、盐酸，科龙化工试剂厂，中国

35)TRIzol Reagent，Thermo Fisher，美国

36)RNase free:10μl、200μl、1ml移液枪枪头；0.2ml、1.5ml、2ml离心管，GCStechnologies，美国

37)Q RT SuperMix for qPCR kit，Vazyme，中国

38)AceQTM qPCR SYBR GreenMasterMix，Vazyme，中国

39)戊巴比妥钠，Mecrk，德国

40)荧光定量PCR八联管，Thermo Fisher，美国

41)SW32Ti转子，Beckman，美国

42)超高速离心管，Beckman，美国

1.3主要实验仪器

1)CO2细胞培养箱Sanvall Legand RT，美国

2)超净工作台Nuaire NU-425-400E，美国

3)-150℃超低温冰箱SANYO，日本

4)离心机Sorvall,Legend RT，美国

5)倒置相差显微镜Olympus IX 50，日本

6)荧光倒置相差显微镜Olympus IX 71，日本

7)全自动正置荧光显微镜Zeiss ImagerZ2，德国

8)电子恒温水浴锅Thermo Fisher Scientific，美国

9)2.5μl、10μl、100μl、200μl、1ml加样枪Eppendorf，美国

10)全自动多功能酶标仪BioTek，美国

11)垂直电泳仪Bio-Rad，美国

12)旋转仪海门其林贝尔，中国

13)涡旋仪海门其林贝尔，中国

14)磁力搅拌器海门其林贝尔，中国

15)电子天平上海，中国

16)超纯水系统Millipore，美国

17)高压灭菌锅SANYO，日本

18)流式细胞分析仪Backman coulter，美国

19)荧光分光光度计Moleculardevices，美国

20)通风厨Thermo Fisher，美国

21)PCR扩增仪Bio-Rad，美国

22)CFX96 qRT-PCR仪Bio-Rad，美国

23)小动物活体成像仪PerkinElmer，美国

24)超高速离心机Beckman，美国

1.4实验试剂的配制

1.4.1培养基配制

培养基配制：取血清4℃解冻后于56℃恒温水浴30min，得到灭活血清。RAW264.7细胞系使用含有10％灭活FBS的RPMI1640培养；使用含有20ng/ml MCS-F、10％灭活FBS的RPMI1640培养。

1.4.2巨噬细胞诱导因子配制

1)LPS配制：称取1mg LPS粉末溶于1ml无菌PBS中，涡旋混匀，得到1mg/ml LPS储液。取100μl储液溶于2.4ml无菌PBS中，得到1000×的40μg/ml LPS储液，分装后冻存于-80℃。

2)γ-IFN配制：称取1mgγ-IFN粉末溶于1ml无菌PBS中，涡旋混匀，得到1mg/mlγ-IFN储液。取100μl储液溶于4.9ml无菌PBS中，得到1000×的20μg/mlγ-IFN储液，分装后冻存于-80℃。

3)M-CSF、IL-4、IL-13配制：取50μg干粉，干粉瞬离至管底后加入250μl无菌PBS中，得到200μg/ml的M-CSF溶液，取10μl溶于90μl无菌PBS得到1000×储液，分装后冻存于-80℃。

1.4.3戊巴比妥钠配制

称取0.5g戊巴比妥钠粉末，生理盐水定容至50ml，0.22μm滤膜过滤除菌，暂存于4℃。现配现用。

1.4.4 Western blot相关试剂配制

1)PMSF储存液：

称取PMSF粉末0.174g，异丙醇定容至，10ml充分溶解，终浓度为100mM；待溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

2)蛋白裂解液配置：

取RIPA裂解液，按1％加入PMSF，充分混匀，4℃暂存，现配现用。

3)分离胶和浓缩胶的制备：

以下为一块胶配制方法。取等体积(各2.7ml)分离胶溶液和缓冲液混匀，加入60μl改良型促凝剂，混匀后注入制胶玻璃板中，加入适量无水乙醇覆盖于下层胶之上，待胶和醇之间有一条折线时，胶已凝固，倒去上层醇；取等体积(各0.75ml)浓缩胶和彩色浓缩胶缓冲液(使用前摇匀)混匀，加入15μl改良型促凝剂混匀，注入制胶玻璃板中，插入梳齿，待上层胶凝固后拔去梳齿即可用于电泳。

4)10×电泳缓冲液：

甘氨酸：188g；Tris base：30.2g；SDS：10g，加三蒸水溶解并定容至1L，室温保存。使用时取10×电泳缓冲液100mL，定容至1L稀释成1×电泳缓冲液。

5)10×转膜缓冲液：

甘氨酸：29g；Tris：58g；SDS：3.7g；加三蒸水溶解并定容至1L，室温保存。使用时取10×转膜缓冲液80mL，甲醇:200mL，定容至1L稀释成1×转膜缓冲液。

6)5％脱脂牛奶(100mL)

称取脱脂奶粉5g，加入PBS溶解并定容至100mL，4℃暂存，现配现用。

7)0.02mol/LPBS缓冲液：

Na2HPO4·12H2O：7g；NaH2PO4·2H2O：0.7g，用900mL双蒸水搅拌溶解后，调至pH为7.4，定容至1L，室温保存。

8)0.5‰PBST缓冲液：

取0.5mLTween-20，加入1LPBS搅拌混匀后室温暂存，现配现用。0.02mol/L PBS：1L；搅拌混匀，室温保存。

1.4.5 ELISA相关试剂配制

1)标品：按说明书使用Dilutionbuffer配制，并依次稀释至可检测浓度。

2)样本稀释：使用Dilutionbuffer将样本稀释至合适比例。

3)抗体工作液：按照1:100使用Dilutionbuffer配制，现配现用。

4)Washingbuffer工作液：使用去离子水稀释50倍，现配现用。

5)Streptavidin-HRP工作液：用Dilutionbuffer按1:100稀释。

1.4.6 FCM相关试剂配制

1)1％BSA的PBS配制：称取1g BSA粉末，用PBS缓冲液定容至100ml。

2)抗体配制：根据每个抗体使用说明书，将抗体稀释为合适比例。

2.实验方法

2.1细胞培养与诱导鉴定

2.1.1小鼠腹腔巨噬细胞分离鉴定

1)腹腔巨噬细胞分离

8周龄C57BL/6雄性小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(10mg/kg)，麻醉后固定为仰卧位，下腹部碘伏消毒，75％酒精脱碘处理后，使用22G的静脉留置针经皮肤穿刺进入腹腔左下象限，注射～7ml预热(37℃)的透析液(生理盐水)，轻轻按摩腹部，数分钟后抽取腹膜透析液。

获得的透析液经1250rpm离心3min后无菌PBS清洗一次，分离得到的细胞用CD11b+MicroBeads进行纯化，筛选出纯度较高的腹腔单核细胞，随后用含有M-CSF(20ng/ml)、10％灭活血清和1％P/S的RPMI 1640诱导其分化为巨噬细胞，孵育过夜后弃掉培养基用PBS清洗，除去悬浮细胞，贴壁细胞为。随后，在其基础培养基中添加IL-4/IL-13(20ng/ml)继续培养48h后将其诱导为。

2)腹腔巨噬细胞鉴定

细胞贴壁后于倒置显微镜下观察细胞形态。

通过FCM检测贴壁细胞纯度，0.25％胰酶消化贴壁细胞，悬液1250rpm离心3min后收集细胞，PBS清洗一次后重悬细胞沉淀，分组如下：Blank；F4/80。加入抗体工作液后于冰上避光孵育30min左右，孵育结束后用含有1％BSA的PBS缓冲液清洗2次，得到细胞沉淀后用300μl PBS缓冲液重悬，混匀后上机检测。

通过qRT-PCR检测M2型巨噬细胞因子Arg1、CCL17、Mrc1、Retnla、Chil3及TGF-β的表达情况。

2.2培养基收集、浓缩及抗炎作用评价

上清收集：诱导分化后的和M2-RAW264.7细胞上清，并对细胞使用细胞计数板进行计数。

上清浓缩：无菌超滤管中加入无菌PBS润洗超滤膜，PBS量完全过膜，4℃预冷3min后经2500g离心5min，弃去PBS；1250rpm离心3min去除上清中漂浮的细胞，超滤管中加入离心后的培养基上清(～15ml/管)，2500g离心45min，使用枪头小心吸取滤膜中的浓缩液。BCA试剂盒测量蛋白浓度，用总蛋白/细胞数进行定量。

作用评价：取适量生长状态良好接种于六孔板，过夜后，更换新鲜培养基，使用LPS(40ng/ml)联合γ-IFN(20ng/ml)处理，立即取等量细胞产生的浓缩培养基。实验分组如下：对照组(CON)，细胞因子风暴模型组(LPS/γ-IFN)，模型组+M2-，模型组+M2-RAW264.7。继续培养4h后，收集处理后的细胞，通过qRT-PCR检测炎症因子TNF-α及IL-6的表达水平。

2.3 EVs分离及鉴定

2.3.1 EVs分离纯化

1)Exo-free FBS制备

配制含20％FBS的RPMI 1640培养基，4℃120,000g离心16h后收集上清，弃去管底沉淀，即得到Exos-free FBS。随后经由0.22μm滤器过滤除菌后，-80℃暂存备用。

2)收集细胞培养基上清

诱导获得后，去除原来培养基，PBS清洗一次，更换为去除Exos的血清培养基继续培养48h后收集上清。

3)超高速超速离心提取EVs

收集得到的上清经4℃，300g离心15min后经2,000g离心15min去除死细胞及细胞碎片后取上清，4℃110,000g离心90min，所得沉淀用无菌PBS洗涤后重悬。

4)EVs定量

BCA试剂盒测量蛋白浓度，NTA测量粒子浓度，分装后-80℃冻存备用。

2.3.2 EVs鉴定

1)TEM检测EVs形态结构

取10μl分离纯化后的EV，加入等体积的PBS缓冲液稀释，缓慢滴加于载样铜网，室温静置数分钟后，用镊子夹取滤纸吸除多余液体，随后滴加2％(w/v)乙酸双氧铀溶液，室温负染5min，干燥后于透射电镜下观察EVs的形态结构。

2)NTA检测EVs粒径大小

取10μl分离纯化后的EVs，根据EVs浓度使用纯水稀释2000-4000倍，使用无菌1ml注射器慢慢吸取(避免气泡)1ml左右稀释后的样本，缓慢注入加样孔，使用ZETAVIEW分析粒径大小。

3)Westernblot检测EVs标记物

取适量EVs样品，按3:1(v/v)比例加入4×Loading buffer，震荡混匀，沸水浴15min，通过Westernblot检测EV阳性标记物ALIX、HSP70、TSG101及GM130的表达。

2.4 M2-EVs对炎症模型的干预实验

2.4.1 EVs细胞摄取实验

根据说明书使用膜染料PKH26标记EVs，使用Exosome Spin Column按照说明书去除游离染料。取适量生长状态良好的接种于六孔板，过夜后，更换新鲜培养基，加入PKH26标记的EVs，实验分组如下：正常对照组(PBS)；染料对照组(PKH26)；PKH26-M2-EVs。培养4h后，PBS清洗细胞三遍后使用4％多聚甲醛室温固定10min，随后PBS洗涤细胞后倒置荧光显微镜下观察摄取EVs情况。

2.4.2 M2-EVs抗炎效果体外评估实验

取适量生长状态良好接种于六孔板，过夜后，更换新鲜培养基，使用LPS(40ng/ml)联合γ-IFN(20ng/ml)处理，立即按等蛋白量加入EV干预。实验分组如下：对照组(CON)，急性炎症模型组(LPS/γ-IFN)，模型组+M2-EVs(10；20μg/ml)。继续培养4h后，收集处理后的细胞，通过qRT-PCR检测炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平；收集处理后的细胞培养基上清，ELISA检测培养基上清中炎症因子TNF-α、IL-6的浓度。

2.5动物实验

2.5.1 LPS诱导小鼠急性炎症模型建立

C57BL/6小鼠腹腔注射不同浓度LPS(10mg/kg),腹腔注射注射1％戊巴比妥钠(10mg/kg)，小鼠麻醉后心脏取血，血样室温静置15-20min，于4℃3000rpm离心15min取上层透明液体于另一离心管，ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6的浓度。

2.5.2 M2-EVs对LPS诱导小鼠急性炎症模型的干预及评价

EVs在小鼠体内分布实验：根据说明书使用荧光染料Cy7标记EVs，使用ExosomeSpin Column去除游离染料，方法同2.5.5.1。C57BL/6小鼠经由尾静脉注射Cy7标记的EVs(60μg/100μl/只)，实验分为以下六组：正常对照组(PBS)；染料对照组(Cy7)；Cy7-M2-EVs(2，6h)；。处理后注射过量麻醉药物安乐死小鼠，取其心、肺、肝、脾、肾组织在小动物活体成像系统成像检测荧光信号。

M2-EVs抗炎效果体内评估实验：腹腔注射LPS(10mg/kg)后尾静脉给予EVs(80μg/100μl/只)处理，实验分组如下：对照组(CON)，急性全身性炎症模型组(LPS)，模型组+M2-EVs(80μg/100μl/只)。4h后，注射1％戊巴比妥钠(10mg/kg)，小鼠麻醉后心脏取血，随后脱颈处死取肺、肝、肾组织冻存于-80℃，取新鲜脾组织用于FCM检测。血样室温静置15-20min，于4℃3000rpm离心15min取上层透明液体于另一离心管，-80℃冻存待用。

2.6效果评价

2.6.1 ELISA检测

1)实验准备：Dilutionbuffer(1×)、预包被抗体板、Washing buffer(50×)、TMB、Stop solution使用前均需室温平衡20min；

2)标品孔加入标品100μl/孔，样品孔加入样品100μl/孔，每孔加入50μl抗体工作液，盖上封板膜，37℃孵育90min；

3)每孔加入200μl Washing buffer工作液，1min后倒扣去除液体，重复洗涤3次；

4)每孔加入100μl Streptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，37℃孵育30min；

5)重复步骤4)3次；

6)每孔加入100μl TMB，37℃避光孵育数分钟，加入终止液100μl/孔，使用酶标仪检测OD450读数。

2.6.2 qRT-PCR检测

细胞总RNA提取

1)实验准备：RNA提取过程中涉及耗材(RNase-free枪头及EP管)；

2)处理后的细胞，吸除培养基，用4℃预冷的PBS清洗两次，吸净残余PBS；

3)每孔加入1ml Trizol分离试剂至RNase-free离心管中；

4)按200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿抽提蛋白，颠倒混匀2min后，室温静置10min；

5)4℃，12,000rmp离心15min，样品分为三层(上层：RNA，中间层：DNA，下层：蛋白质)；

6)取上层水相(～600μl)至新的RNase-free 1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀2min，室温静置10min沉淀RNA；

7)4℃，12000g，离心10min，弃上清；

8)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入预冷的75％乙醇，颠倒离心管2min，悬浮沉淀；

9)4℃，7500g，离心5min，尽量弃上清；

10)重复8)、9)一次以提高RNA质量

11)将RNA沉淀室温晾干，加入适量RNase-free水融解RNA样品

12)应用微量分光光度计测定OD260/280比值以及OD260值，以OD260/280比值在1.8-2.0之间为RNA质量佳。根据OD260计算RNA浓度。

组织总RNA提取

1)实验准备：RNA提取过程中涉及耗材(Rnase-free枪头及EP管)；

2)称取约50mg组织样本，加入研磨珠，加入200μl Trizol分离试剂，震荡匀浆后补加800μl Trizol分离试剂，室温静置10min；

3)混匀后4℃，12,000rpm离心5min，弃去沉淀，取上清至新的RNase-free 1.5ml离心管中；

其余同细胞总RNA提取步骤4)-12)。

2.7统计分析

所有数据采用GraphPad 7.0软件统计分析，数据表示为Mean±SEM，组间均数比较采用单因素方差分析(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01)。

3.结果

3.1 M2-EVs分离及诱导鉴定

3.1.1分离及诱导鉴定

从小鼠腹腔分离获得的单核细胞接种于T25细胞培养瓶，在M-CSF(20ng/ml)的条件下诱导其分化为巨噬细胞，孵育过夜后弃掉培养基，PBS洗去悬浮细胞，剩余贴壁细胞即为。流式结果表明，我们分离的细胞巨噬细胞阳性标记物F4/80的阳性率为95.70％，提示成功分离获得，且具有较高纯度(图1)。

倒置显微镜下可见其细胞较大，形状不规则，呈三角形或长条形(图2)。随后，在IL-4/IL-13条件下诱导48h为，倒置显微镜下可见大部分细胞呈椭圆形、梭形等(图2)。

qRT-PCR结果提示，经IL-4/IL-13联合诱导48h后的细胞表面高表达Arg1、CCL17、Mrc1、Retnla、CCL17和TGF-β(图3)，以上结果表明，我们成功分离并诱导。

3.1.2 M2-EVs的分离鉴定

收集细胞培养基上清，通过超高速离心法获得EVs，使用TEM、NTA、WB分别从其形态、大小及表面分子标记物对分离得到的产物进行鉴定。TEM结果提示，所分离得到的产物呈圆形或椭圆形，具有脂质双分子层结构(图4A)。NTA结果显示，M2-EVs符合EVs粒径分布。M2-EVs的平均粒径约为150nm(图4B)。Western blot结果表明分离的产物和细胞都表达EVs的阳性标志物HSP70、TSG101和ALIX，不表达阴性标记物GM130(图4C)。以上结果表明，我们从细胞上清中成功分离获得EVs。

3.2 M2-EVs的体外抗炎功能研究

3.2.1能够摄取M2-EVs

为了验证能摄取EVs，用膜荧光染料PKH26标记的M2-EVs处理，4h后在倒置荧光显微镜下观察，结果如图5所示，PKH26标记的EVs能够进入且主要集中在胞浆。以上结果提示，能够摄取M2-EVs。

3.2.2 M2-EVs抑制LPS诱导的炎症因子释放

为了评价M2-EVs的抗炎功能，使用不同浓度的EVs处理LPS和γ-IFN诱导的炎症模型。qRT-PCR检测结果表明(图6)，M2-EVs能抑制LPS/γ-IFN诱导的TNF-α和IL-6mRNA表达水平的增加，且呈浓度依赖模式，结果具有统计学意义，提示M2-EVs能够有效抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的表达。

此外，ELISA结果显示(图7)，TNF-α和IL-6在蛋白水平的表达也被抑制。以上结果共同表明，M2-EVs能够在体外降低炎症因子的表达水平。

3.3 M2-EVs的体内抗炎功能研究

3.2.1 EVs的体内分布

为了了解M2-EVs进入小鼠体内后的分布特点，我们将荧光染料Cy7标记的M2-EVs通过尾静脉注射入小鼠体内，分别在2h和6h时间点处死小鼠并取其主要器官观察其分布情况。结果如图，心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中均检测到了红色荧光信号，其中肝脏中荧光信号最强(图8)，提示M2-EVs进入体内后可经血液循环到达主要脏器。

3.2.2 M2-EVs的体内抗炎功能评价

基于前期研究结果，我们使用LPS诱导的C57BL/6小鼠急性炎症模型评价M2-EVs的抗炎功能。如图所示为静脉给EVs 4h后对机体炎症水平的影响。ELISA结果提示，M2-EVs处理组相较于模型组血清TNF-α和IL-6水平均显著降低(图9)。

此外，如图10所示，qRT-PCR结果提示，小鼠肝、肺、肾组织炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平在M2-EVs处理组也显著降低。以上结果共同表明，M2-EVs可以降低机体炎症水平。

脾脏组织流式结果如图11所示，模型组LPS处理显著增加了促炎型标记物F4/80+CD11c+的比例，M2-EVs干预组降低了F4/80+CD11c+的表达，结果具有统计学差异(图11)。提示M2-EVs可能通过降低促炎型比例发挥抗炎作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。