阅读说明：本技术 纯化索玛鲁肽的方法 (Method for purifying somaglutide ) 是由 何平 潘俊锋 于铁妹 刘建 于 2020-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多肽药物的纯化领域,具体涉及一种固相片段法合成索玛鲁肽的纯化制备方法,采用柱层析和膜分离技术相结合,获得了较高产品纯度及收率,解决了目前规模化制备技术难题。其步骤如下：将固相片段法合成的索玛鲁肽粗肽溶解于醋酸水溶液,用陶瓷膜过滤,然后用反相C8填料进行分离纯化,收集索玛鲁肽馏分,低温减压回收有机溶剂,得到索玛鲁肽的纯化溶液,经过膜系统脱除盐分及多余的酸根离子,进一步浓缩到适合冻干的浓度,冷冻干燥、包装得到高质量的索玛鲁肽原料。(The invention relates to the field of purification of polypeptide drugs, in particular to a purification preparation method for synthesizing somaltulin by a solid phase fragment method. The method comprises the following steps: dissolving the crude soxhalutatide synthesized by a solid phase fragment method in an acetic acid aqueous solution, filtering by using a ceramic membrane, then separating and purifying by using a reversed phase C8 filler, collecting soxhalutatide fraction, recovering an organic solvent at low temperature under reduced pressure to obtain a purified solution of the soxhalutatide, removing salt and redundant acid radical ions by using a membrane system, further concentrating to a concentration suitable for freeze drying, and carrying out freeze drying and packaging to obtain the high-quality raw soxhalutatide.)

纯化索玛鲁肽的方法

技术领域

本发明涉及多肽药物的纯化领域，特别涉及纯化索玛鲁肽的方法。

背景技术

糖尿病是一种全球性高发代谢疾病，全球超过4亿2型糖尿病患者，我国2型糖尿病患者超过1亿，在慢性病中占比非常高。糖尿病会诱发很多并发症，严重影响人类的劳动能力，并极大的危害人体健康。

索玛鲁肽，英文名称:Semaglutide，分子式:C₁₈₇H₂₉₁N₄₅O₅₉分子量:4113.64。肽序列结构如下：

H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

索玛鲁肽是丹麦诺和诺德公司开发的新一代长效GLP-1类似物，在结构上，第7位改为非天然氨基酸氨基异丁酸，第26位的Lys侧链氨基接上AEEA、谷氨酸和十八烷酸脂肪链，AEEA修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾***，可延长生物半衰期，达到长效降糖效果。临床实验结果显示，索玛鲁肽注射剂为每周给药一次，口服剂型为每天给药一次，比其它的降糖药效果更平稳持久，在降低血糖的同时，还有减肥功效，索玛鲁肽的应用前景非常乐观。

目前，有一些针对索玛鲁肽纯化的方法及专利，但是多有步骤繁琐，收率低，纯化涉及多种色谱填料，使用寿命短，成本高，工艺难以实现商业化大生产。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了纯化索玛鲁肽的方法。该方法改善了色谱使用条件，提升了分离效果，提高了产品收率，延长了色谱填料使用寿命，降低了生产成本。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了纯化索玛鲁肽的方法，包括如下步骤：

步骤1：将索玛鲁肽粗品溶解于醋酸水溶液中，得到粗品溶液；

步骤2：将粗品溶液经陶瓷膜过滤，收集滤液；

步骤3：取所述滤液，以反相C8填料为固定相，磷酸三乙胺溶液为A流动相，乙腈为B流动相，梯度为40～60％，监测波长为230nm，线性梯度洗脱，收集馏分溶液；

步骤4：将所述馏分溶液用醋酸调节至pH为6～7，低温减压回收乙腈，获得纯化样品溶液；

步骤5：取所述纯化样品溶液，以反相C8为固定相，醋酸溶液为A流动相，乙腈为B流动相，梯度为43-50％，监测波长为230nm，线性梯度洗脱，收集馏分溶液；

步骤6：低温减压回收乙腈，得到纯化样品溶液，脱盐，浓缩，冷冻干燥。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述醋酸水溶液的质量浓度为10％。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述磷酸三乙胺的摩尔浓度为80mMol/L，pH为7.2。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述线性梯度洗脱的时间为40min。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤4或步骤6中所述低温减压的温度为30～45℃，真空度10～100mbar。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述线性梯度洗脱的时间为30min。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述醋酸溶液的摩尔浓度为50mMol/L。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤6中所述脱盐、浓缩采用错流膜过滤系统，所述浓缩后的浓度为100～150g/L。

本发明提供一种规模化纯化索玛鲁肽的新方法，减少了色谱填料的种类，改善了色谱使用条件，提升了分离效果，提高了产品收率，延长了色谱填料使用寿命，降低了生产成本。本方法采用的纯化分离条件比较温和，最大程度的保持了索玛鲁肽的生物活性，防止了变性发生。结合膜分离技术，降低了对色谱系统的依赖，提升了纯化工序前处理、后处理工作效率，实现了商业化大生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1制得的索马鲁肽的HPLC色谱图；

图2示实施例2制得的索马鲁肽的HPLC色谱图；

图3示实施例3制得的索马鲁肽的HPLC色谱图；

图4示对比例制得的索马鲁肽的HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明公开了纯化索玛鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明技术方案如下：一种规模化纯化索玛鲁肽的方法，包括如下步骤：

1)、将固相片段合成的索玛鲁肽粗品溶解于10％醋酸水溶液中，得到粗品溶液；

2)、粗品溶液经过陶瓷膜系统精密澄清过滤；

3)、取滤液，以反相C8为固定相，磷酸三乙胺为A流动相，乙腈为B流动相，梯度为40-60％，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第一步纯化馏分溶液；

4)、将第一步纯化馏分溶液用醋酸调节至pH为弱酸性，低温减压回收乙腈，得到第一步纯化样品溶液；

5)、取第一步纯化样品溶液，以反相C8为固定相，醋酸为A流动相，乙腈为B流动相，梯度为43-50％，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第二步纯化馏分溶液；

6)、低温减压回收乙腈，得到第二步纯化馏分溶液，经膜浓缩系统脱盐，浓缩至冷冻干燥的浓度，经冷冻干燥、分装包装后得到高质量的索玛鲁肽原料。

与现有技术相比，本发明方法具有一下有点：

选用错流陶瓷膜过滤技术处理粗肽样品，能很好的去除杂质，最大限度的保护色谱分离填料，选反相C8填料，分离效能高、机械强度和化学稳定性好，可持续使用时间长，在纯化效率和收率上获益良多。固相合成多肽，有大量的消旋、缺失，氧化等杂质，要达到高纯度药用级别，主要依赖反相C8色谱分离，本方法采用两次不同流动相体系C8色谱分离，获得了高纯度产品，纯化收率也得到极大的提升。色谱柱层析结合膜分离技术，减少了传统方法的转盐、脱盐工艺步骤，降低了对色谱系统的依赖，降低了生产成本，提高了生产效率，更易实现规模化生产。

本发明提供的纯化索玛鲁肽的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、样品处理：取500克固相合成的索玛鲁肽粗品溶解于5L醋酸水溶液(质量百分浓度10％)中，得到粗品溶液；

2、将粗品溶液用陶瓷膜错流过滤系统精密过滤，收集滤液待用；

3、第一步反相纯化

色谱条件：色谱柱450X250mm,反相C8填料，流动相A：80mMol磷酸溶液，用三乙胺调节pH至7.2，流动相B：乙腈，梯度为40-60％，上样量150克，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第一步索玛鲁肽纯化馏分溶液。用醋酸调节pH为6.0，在30-32℃减压回收乙腈，得到第一步纯化溶液，待用；

4、第二步反相纯化

色谱条件：色谱柱450X250mm,反相C8填料，流动相A：50mMol醋酸溶液，流动相B：乙腈，梯度为40-60％，上样量100克，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第二步索玛鲁肽纯化馏分溶液。在30-32℃减压回收乙腈，得到第二步纯化溶液，待用；

5、脱盐、浓缩、冻干

将第二步纯化溶液用截留分子量2000D的超滤膜，错流过滤出5倍体积，在浓缩至原体积的30％，冷冻干燥后得到纯度大于99％的索玛鲁肽，纯化收率64％。见图1。

实施例2

1、样品处理：取800克固相合成的索玛鲁肽粗品溶解于8L醋酸水溶液(质量百分浓度10％)中，得到粗品溶液；

2、将粗品溶液用陶瓷膜错流过滤系统精密过滤，收集滤液待用；

3、第一步反相纯化

色谱条件：色谱柱450X250mm,反相C8填料，流动相A：80mMol磷酸溶液，用三乙胺调节pH至7.2，流动相B：乙腈，梯度为40-60％，上样量200克，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第一步索玛鲁肽纯化馏分溶液。用醋酸调节pH为5.0，在30-32℃减压回收乙腈，得到第一步纯化溶液，待用；

4、第二步反相纯化

色谱条件：色谱柱450X250mm,反相C8填料，流动相A：50mMol醋酸溶液，流动相B：乙腈，梯度为40-60％，上样量150克，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第二步索玛鲁肽纯化馏分溶液。在30-32℃减压回收乙腈，得到第二步纯化溶液，待用；

5、脱盐、浓缩、冻干

将第二步纯化溶液用截留分子量2000D的超滤膜，错流过滤出5倍体积，在浓缩至原体积的30％，冷冻干燥后得到纯度大于99％的索玛鲁肽，纯化收率67％。见图2。

实施例3

1、样品处理：取1000克固相合成的索玛鲁肽粗品溶解于10L醋酸水溶液(质量百分浓度10％)中，得到粗品溶液；

2、将粗品溶液用陶瓷膜错流过滤系统精密过滤，收集滤液待用；

3、第一步反相纯化

色谱条件：色谱柱450X250mm,反相C8填料，流动相A：80mMol磷酸溶液，用三乙胺调节pH至7.2，流动相B：乙腈，梯度为40-60％，上样量250克，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第一步索玛鲁肽纯化馏分溶液。用醋酸调节pH为5.5，在30-32℃减压回收乙腈，得到第一步纯化溶液，待用；

4、第二步反相纯化

色谱条件：色谱柱450X250mm,反相C8填料，流动相A：50mMol醋酸溶液，流动相B：乙腈，梯度为40-60％，上样量150克，监测波长为230nm,进行线性梯度洗脱，收集第二步索玛鲁肽纯化馏分溶液。在30-32℃减压回收乙腈，得到第二步纯化溶液，待用；

5、脱盐、浓缩、冻干

将第二步纯化溶液用截留分子量1500D的超滤膜，错流过滤出5倍体积，在浓缩至原体积的30％，冷冻干燥后得到纯度大于99％，纯化收率70％。见图3。

对比例

(1)将60g索玛鲁肽粗品溶于8％的稀氨水溶液，完全溶解后用0.45um滤膜过滤。收集过A:0.5％乙酸，氨水调pH＝7.6的水溶液。流动相B:乙腈。流速:600mL/min检测波长为:230nm。上样量:37g。洗脱梯度初始梯度B相5％保持5min，然后60min至45％。收取含有索玛鲁肽的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁一次纯化溶液。

(2)0.2％三氟醋酸，三乙胺调pH＝2.5的水溶液。流动相B:含有0.1％三氟醋酸的乙腈溶液。流速:600mL/min检测波长为:230nm。上样量:20g。洗脱梯度初始梯度B相5％保持5min，然后60min至55％。收取含有索玛鲁肽的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽纯化溶液。图2索玛鲁肽二次纯化后的产品色谱图。

(3)第二步HPLC纯化色谱条件:色谱柱:八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱的直径和长度为:30*250mm。流动相A:0.2％三氟醋酸，三乙胺调pH＝2.5的水溶液。流动相B:含有0.1％三氟醋酸的乙腈溶液。流速:600mL/min检测波长为:230nm。上样量:20g。洗脱梯度初始梯度B相5％保持5min，然后60min至55％。收取含有索玛鲁肽的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽纯化溶液。

图4为索玛鲁肽二次纯化后的产品色谱图。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。