阅读说明：本技术 特立帕肽类似物 (Teriparatide analogues ) 是由 冯军 张喜全 阮思达 陆伟根 东圆珍 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,具体涉及特立帕肽类似物。本发明通过在特立帕肽N端的13位,26位和/或27位发生修饰和/或氨基酸替换,得到一类新的特立帕肽类似物,具有增强的细胞透膜能力,能够用于口服给药。(The invention belongs to the field of medicines, and particularly relates to a teriparatide analogue. The invention obtains a new teriparatide analogue by modifying and/or substituting amino acid at 13, 26 and/or 27 positions of the N end of teriparatide, has enhanced cell membrane penetrating capacity, and can be used for oral administration.)

特立帕肽类似物

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及特立帕肽类似物。

背景技术

目前，骨质疏松在老年人群中的发病率仅次于糖尿病和老年痴呆，跃居老年性疾病的第三位，因此，治疗骨质疏松药物的开发也成为研究的热点。治疗骨质疏松的药物主要可以分为以下三类：1.促进骨矿化药物，例如维生素D与钙制剂等；2.抑制骨吸收的药物，如双膦酸盐、迪诺单抗、***类、降钙素等；3.促进骨形成的药物，主要为甲状旁腺激素(parathyroidhormone，PTH)及其类似物，钙离子受体拮抗剂、抗硬骨素单克隆抗体等。其中甲状旁腺素已经成为治疗绝经后妇女骨质疏松疾病的首选药。

甲状旁腺素是一种由甲状旁腺上皮细胞合成、储存和分泌的由84个氨基酸组成的多肽，其主要的生理功能为促进骨形成，动员血钙入骨以及促进肾小管和胃肠道对钙的重吸收，从而起到治疗骨质疏松的目的。当甲状旁腺素PTH(1-84)进入到人体内将会被很快代谢成N端PTH(1-34)片段，该片段具有完整的生理学活性，能够与组织相应特异性受体结合从而发挥生物学作用。由于PTH(1-34)具有与甲状旁腺素相同的生理活性，因此也被开发成药用于骨质疏松的治疗。

特立帕肽(Teriparatide，商品名Forteo)是由美国Eli Lilly公司研发的重组PTH(1-34)，2002年FDA批准其上市，2013年在中国上市(复泰奥)，其氨基酸序列为H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH，该产品被批准用于绝经后妇女骨质疏松症，初期或性腺机能减退的男性骨质疏松症患者以及持久性、全身性糖皮质激素有关的骨质疏松患者的治疗。

目前特立帕肽上市剂型为注射剂，采用低剂量间歇性的给药方式，需要每天进行一次皮下注射，这给患者带来了较大的痛苦。如果能够实现特立帕肽的口服化给药则能够大大提高患者的临床顺应性。

然而，对于口服多肽类药物，其在体内的生物利用度较低，主要原因在于：(1)胃肠道复杂的酶环境使多肽易在胃肠道内发生降解；(2)分子量大且不易通过粘膜层；(3)缺乏脂溶性，渗透性差难以透过小肠上皮细胞进入体循环。通过脂酰化对多肽进行修饰，能够增加多肽亲脂性，从而有利于多肽透过胃肠道细胞进入体循环。与此同时，胃肠道细胞表面存在一些受体，利用配体对多肽进行化学修饰，配体与受体实现特异性结合从而有助于多肽穿透细胞，例如胆酸(钠离子依赖型胆酸转运体ASBT)与生物素(钠离子依赖型生物素受体)。US9993430B2专利中通过对GLP-1进行脂酰化的修饰，增加多肽的亲脂性，并与渗透促进剂SNAC共同作用提高了了GLP-1多肽的口服生物利用度；Y.W.Cho et.al/Lancet 2(2012)报道了一款口服胰岛素IN-105，通过在β链上Lys29上修饰了一段PEG-脂肪酸两亲性侧链从而增加了胰岛素的亲脂性，实现了胰岛素的口服给药方式；US20110014247中通过加入5-CNAC作为渗透促进剂能够与多肽以非共价键形成一种复合物，增加多肽的亲脂性使其胃肠道渗透作用提高；US8962015中通过生物素作为靶头协助将载药脂质体穿透单细胞层，提高了口服多肽的生物利用度。通过增加脂溶性以提高多肽的细胞渗透作用目前已经在口服多肽领域得到了广泛应用，然而化学修饰的方式有可能会造成多肽构象上的改变，从而导致多肽活性的丧失。因此在对多肽进行修饰时，保持多肽的活性也就成为了关键。

发明内容

本发明专利申请涉及特立帕肽类似物，所述类似物是在特立帕肽N端的13位，26位和/或27位发生修饰和/或氨基酸替换。

在一个方面，本申请提供特立帕肽类似物，所述类似物是在特立帕肽N端的13位、26位和/或27位的一个、两个或三个赖氨酸上发生修饰。

在一些方案中，所述修饰是酰化修饰。

在一些方案中，所述修饰位点位于特立帕肽N端的13位、26位以及27位的三个赖氨酸中的一个、两个或三个。

在一些方案中，所述修饰位点位于特立帕肽N端的13位、26位以及27位的三个赖氨酸上分布的三个游离ε-氨基中的一个、两个或三个。

在一些方案中，用于酰化修饰特立帕肽的脂肪链结构通式为：HOOC-(AEEA)_m-(Xaa)_n-R₁，其中，Xaa为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)中的一种或几种或缺省。m为0,1,2,3,4,5中的一个数字。n为0,1,2,3中的一个数字。R₁为脂肪族直链，支链C₆-C₂₀的酰基基团，去氧胆酸，生物素或缺失。

在一些方案中，m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，优选为0-3，更优选的为2；n为数字0,1,2,3，优选为0或1，更优选为1。当n为1时，(Xaa)_n为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met)中的一种；优选为4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，天冬氨酸(Asp)，半胱氨酸(Cys)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，甘氨酸(Gly)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)；更优选为γ-谷氨酸(γ-Glu)，脯氨酸(Pro)。R₁选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、15-羧基十五酰基、13-羧基十三酰基、11-羧基十一酰基、去氧胆酸以及生物素；优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、去氧胆酸、生物素；更优选为十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基。

本发明申请提供一类特立帕肽脂酰化衍生物，具有如下所述的结构(多肽序列按照从N端-C端的顺序)：

在13位、26位或27位存在两个或三个赖氨酸修饰时，所述修饰基团中的T是相同的结构，其中，化学结构通式T可表示为：

其中，m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，n为0,1,2,3中的一个数字，p为6-20中的一个整数，R₂为-H或-COOH；Xaa为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)中的一种或几种或缺省。

更具体的，侧链结构可表示为以下结构式：

其中，m选自0-5的整数，优选为0-2的整数，更优选为2；Xaa₁选自D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met)；优选为4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，天冬氨酸(Asp)，半胱氨酸(Cys)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，甘氨酸(Gly)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)；更优选为γ-谷氨酸(γ-Glu)，脯氨酸(Pro)。

另一方面，本申请提供一类特立帕肽类似物，所述类似物是在特立帕肽N端的13位、26位或27位的赖氨酸发生替换，所述类似物具有如下通式：

H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-X₁-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-X₂-X₃-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH

其中，X₁，X₂，X₃不同时为Lys，且X₁，X₂，X₃中至少有一个为Lys；在一些方案中，X₁，X₂，X₃中任一个或任两个为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met)中的一种或两种，优选为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，2-氨基异丁酸(Aib)，精氨酸(Arg)，半胱氨酸(Cys)，甘氨酸(Gly)，更优选为精氨酸(Arg)。

另一方面，本申请提供一类特立帕肽类似物的酰化修饰物，所述类似物是在特立帕肽N端的第13位、26位和/或27位的赖氨酸发生替换，所述类似物具有如下通式：

H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-X₁-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-X₂-X₃-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH

其中，X₁，X₂，X₃不同时为Lys，且X₁，X₂，X₃中至少有一个为Lys；在一些方案中，X₁，X₂，X₃中任一个或任两个为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met)中的一种或两种；优选为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，2-氨基异丁酸(Aib)，精氨酸(Arg)，半胱氨酸(Cys)，甘氨酸(Gly)，更优选为精氨酸(Arg)；

其中，所述酰化修饰位点是位于X₁，X₂或X₃上的Lys，进一步的，所述酰化位点位于X₁，X₂或X₃上的Lys游离ε-氨基。

在一些方案中，用于酰化修饰的脂肪链结构通式为：HOOC-(AEEA)_m-(Xaa)_n-R₁，其中，Xaa为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)中的一种或几种或缺省。m为0,1,2,3,4,5中的一个数字。n为0,1,2,3中的一个数字。R₁为脂肪族直链，支链C₆-C₂₀的酰基基团，去氧胆酸，生物素或缺失。

在一些方案中，m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，优选为0-3，更优选的为2；n为数字0,1,2,3，优选为0或1，更优选为1。当n为1时，(Xaa)_n为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met)中的一种；优选为4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，天冬氨酸(Asp)，半胱氨酸(Cys)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，甘氨酸(Gly)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)；更优选为γ-谷氨酸(γ-Glu)，脯氨酸(Pro)。R₁选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、15-羧基十五酰基、13-羧基十三酰基、11-羧基十一酰基、去氧胆酸以及生物素。优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、去氧胆酸、生物素。更优选为十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基。

另一方面，本申请提供一种特立帕肽类似物的酰化修饰物，所述修饰物通式可表示为(多肽序列按照从N端-C端的顺序)：

X₂ ²⁶,X₃ ²⁷,Lys¹³-PTH(1-34)

或

X₁ ¹³,X₃ ²⁷,Lys²⁶-PTH(1-34)

或

X₁ ¹³,X₂ ²⁶,Lys²⁷-PTH(1-34)

其中，X₁选自D-Ala，β-Ala，GABA，Aib，Abu，Arg，Asp，Asn，Cys，D-Glu，γ-Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Pro，Phe，Ser，Tyr，Thr，Trp，Val，Met，优选β-Ala，GABA，Aib，Abu，Arg，Cys，更优选为Arg；X₂选自D-Ala，β-Ala，GABA，Aib，Abu，Arg，Asp，Asn，Cys，D-Glu，γ-Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Pro，Phe，Ser，Tyr，Thr，Trp，Val，Met，优选β-Ala，GABA，Aib，Abu，Arg，Cys，更优选为Arg；X₃选自D-Ala，β-Ala，GABA，Aib，Abu，Arg，Asp，Asn，Cys，D-Glu，γ-Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Pro，Phe，Ser，Tyr，Thr，Trp，Val，Met，优选β-Ala，GABA，Aib，Abu，Arg，Cys，更优选为Arg；

其中，化学结构通式T可表示为：

其中，m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，n为0,1,2,3中的一个数字，p为6-20中的一个整数，R₂为-H或-COOH；Xaa为D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)中的一种或几种或缺省。

更具体的，侧链结构T可表示为以下结构式：

其中，m选自0-5，优选为0-2，更优选为2；Xaa₁选自D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)，2-氨基丁酸(Abu)，精氨酸(Arg)，天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn)，半胱氨酸(Cys)，D-谷氨酸(D-Glu)，γ-谷氨酸(γ-Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丝氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met)；优选为4-氨基丁酸(GABA)，2-氨基异丁酸(Aib)D-丙氨酸(D-Ala)，β-丙氨酸(β-Ala)，天冬氨酸(Asp)，半胱氨酸(Cys)γ-谷氨酸(γ-Glu)，甘氨酸(Gly)，脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)；更优选为γ-谷氨酸(γ-Glu)，脯氨酸(Pro)。

在一些方案中，本申请提供一类特立帕肽类似物的酰化修饰物，选自具有以下结构的化合物(多肽序列按照从N端-C端的顺序)：

1.N-ε²⁷-PTH(1-34)-AEEA-AEEA-Pro-C₁₇-COOH：

2.N-ε¹³-PTH(1-34)-AEEA-AEEA-α-Glu-C₁₆：

3.N-ε²⁶-PTH-γ-Glu-C₁₂：

4.N-ε²⁷-PTH(1-34)-AEEA-AEEA-去氧胆酸：

5.N-ε¹³-(Arg²⁶，Gly²⁷)PTH(1-34)-γ-Glu-C₁₆：

6.N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-Gly-AEEA-Gly-γ-Glu-C₁₇-COOH：

7.N-ε²⁶-(Cys¹³，Ala²⁷)PTH(1-34)-Phe-AEEA-AEEA-AEEA-C₁₂：

8.N-ε²⁶-(Arg¹³，Arg²⁷)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-C₁₁-生物素：

9.N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-C₁₇-COOH：

10.N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-Glu-C₁₇-COOH：

11.N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-Ala-C₁₇-COOH：

12.N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-C₁₆：

本申请中的特立帕肽类似物体外生物活性与特立帕肽相比变化不大，侧链的修饰不会影响多肽生物活性，且极性有了明显的下降，在反向色谱中，类似物乙腈相的洗脱比例从PTH的40％增加到55％-60％，说明在脂酰化后极性有所降低，从而有利于实现多肽的跨膜运输。

本申请中的特立帕肽类似物的细胞渗透性有了显著的提升，在体外Caco-2细胞跨膜转运实验中，PTH衍生物穿透单层细胞层的能力强于PTH对照品，PTH衍生物的表观渗透系数P_app值是PTH标准品的1.89-4.03倍，说明脂酰化的修饰能够有效增强细胞透膜能力。

本申请中通过对特立帕肽进行氨基酸的替换，使特立帕肽的序列中仅剩余一个赖氨酸，从而只保留一个脂酰化的修饰位点，这样既简便了纯化过程，同时也提高产物纯度。

本发明申请提供了前述的特立帕肽类似物的药用盐或其用途。

本发明申请所涉及的多肽可以用于治疗骨质疏松。

本申请的特立帕肽类似物可以作为口服制剂的有效药物成分；也可以充当注射用药的有效药物成分，如静脉注射，皮下注射，肌肉注射等；也可以作为局部用药的有效药物成分

本申请的特立帕肽类似物可以通过现有的医药学技术制成药物有效剂量单位，该有效剂量单位的形式可以为口服，药片，胶囊或液体等剂型。

本申请的特立帕肽类似物成分可制成含水的制剂，其中水分不低于50％。

在一些方案中，口服制剂可以为片剂、含片、丸剂、胶囊剂(例如硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂)、酏剂、颗粒剂、糖浆剂、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液、分散剂和用于口服或非口服给药的缓释制剂的剂型，其中包含各种不同赋形剂(比如：碳酸钙，磷酸钙等)的药片也可以做成崩解制剂。

在一些方案中，药物成分可以通过可控的方式进行释放，包括缓释或快速释放，相关药物成分的可控释放剂量可以通过已知的医药学技术进行实现。

本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的多肽或其药学上可接受的盐。本申请的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一些方案中，本申请所述的药物组合物中包含本申请的特立帕肽类似物的量至少约0.1mg，或至少约0.2mg，或至少约0.3mg，或至少约0.4mg，或至少约0.6mg，或至少约0.8mg，或至少约1mg，或至少约1.5mg，或至少约2mg，或至少约2.5mg，或至少约3mg，或至少约5mg，或至少约7mg，或至少约10mg，或至少约12mg，或至少约15mg，或至少约20mg，或至少约30mg，或至少约50mg，或至少约70mg，或至少约100mg。

在一些方案中，本申请所述的药物组合物中本申请特立帕肽类似物的含量在2.5至99.4重量％的范围内。在一些方案中，本申请所述的药物组合物中本申请特立帕肽类似物的含量在2.5至10重量％的范围内，或在8至15重量％的范围内，或在10至20重量％的范围内，或在15至30重量％的范围内，或在20至40重量％的范围内，或在30至50重量％的范围内，或在40至60重量％的范围内，或在50至70重量％的范围内。

本申请的特立帕肽类似物在用于治疗骨质疏松症的治疗时，在一些方案中，口服施用至少100μg；在一些方案中，口服施用至少200μg；在一些方案中，口服施用至少500μg；在一些方案中，口服施用至少100μg；在一些方案中，口服施用至少100μg。本申请的特立帕肽类似物在用于治疗骨质疏松症的治疗时，在一些方案中，口服施用20mg或更低用量；在一些方案中，口服施用10mg或更低用量；在一些方案中，口服施用5mg或更低用量；在一些方案中，口服施用3mg或更低用量；在一些方案中，口服施用2000μg或更低用量；在一些方案中，口服施用1000μg或更低用量。本申请的特立帕肽类似物在用于治疗骨质疏松症的治疗时，在一些方案中，口服施用200μg至20mg；在一些方案中，口服施用200μg至10mg；在一些方案中，口服施用200μg至5mg；在一些方案中，口服施用200μg至3000μg；在一些方案中，口服施用200μg至2000μg；在一些方案中，口服施用500μg至1000μg；在一些方案中，口服施用750μg。

本申请的特立帕肽类似物或其药用组合物在用于治疗骨质疏松症的治疗时，每天实施1-3次根据本文所述的各个实施方式中任一个的口服施用；在一些实施方式中，每天实施1次或2次根据本文所述的各个实施方式中任一个的口服施用；在一些实施方式中，每天实施1次根据本文所述的各个实施方式中任一个的口服施用。

本申请的方案，还包括：

1.一种特立帕肽类似物，其特征在于所述类似物是在特立帕肽N端的13位，26位和/或27位发生修饰和/或氨基酸替换。

2.根据1所述的特立帕肽类似物，其在特立帕肽N端的13位，26位和/或27位发生酰化修饰。

3.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述酰化修饰位点位于特立帕肽N端的13位、26位或27位的赖氨酸中的一个、两个或三个。

4.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于用于酰化修饰的脂肪链构通式为：HOOC-(AEEA)_m-(Xaa)_n-R₁，其中，Xaa为D-丙氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、2-氨基丁酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、D-谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、蛋氨酸中的一种或几种或缺省；m为0,1,2,3,4,5中的一个数字；n为0,1,2,3中的一个数字；R₁选自脂肪族直链、支链C₆-C₂₀的酰基基团、去氧胆酸、生物素或缺失。

5.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，优选为0-3，更优选的为2。

6.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于n为数字0,1,2,3，优选为0或1，更优选为1。

7.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述n为1，所述(Xaa)_n选自4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，优选为γ-谷氨酸或脯氨酸。

8.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于R₁选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、15-羧基十五酰基、13-羧基十三酰基、11-羧基十一酰基、去氧胆酸以及生物素，优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、去氧胆酸、生物素，更优选为十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基。

9.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述类似物具有如下之一所述的结构：

其中，化学结构通式T可表示为：

在13位、26位或27位存在两个或三个赖氨酸修饰时，所述修饰基团中的T是相同的结构，其中，m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，n为0,1,2,3中的一个数字，p为6-20中的一个整数，R₂为-H或-COOH。

10.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述T可以表示为以下结构：

其中，m选自0-5的整数，优选为0-2的整数，更优选的为2；Xaa₁选自D-丙氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、2-氨基丁酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、D-谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、蛋氨酸；优选为4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸；更优选为γ-谷氨酸或脯氨酸。

11.前述任一项所述的特立帕肽类似物，所述类似物在特立帕肽N端的13位、26位或27位的赖氨酸发生替换，所述类似物具有如下通式：

H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-X₁-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-X₂-X₃-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH，其中，X₁，X₂，X₃不同时为Lys，且X₁，X₂，X₃中至少有一个为Lys。

12.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述X₁，X₂，X₃中任一个或任两个为D-丙氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、2-氨基丁酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、D-谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、蛋氨酸中的一种或两种；优选为D-丙氨酸、β-丙氨酸、2-氨基异丁酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸；更优选为精氨酸。

13.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述特立帕肽类似物存在酰化修饰，所述酰化修饰位点是位于X₁，X₂或X₃上的Lys。

14.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述酰化修饰为连接脂肪链结构，所述脂肪链结构通式为：HOOC-(AEEA)_m-(Xaa)_n-R₁，其中，Xaa为D-丙氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、2-氨基丁酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、D-谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、蛋氨酸中的一种或几种或缺省；m为0,1,2,3,4,5中的一个数字；n为0,1,2,3中的一个数字；R₁选自脂肪族直链、支链C₆-C₂₀的酰基基团、去氧胆酸、生物素或缺失。

15.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，优选为0-3，更优选的为2。

16.前述任一项任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于n为数字0,1,2,3，优选为0或1，更优选为1。

17.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述n为1，Xaa_n选自4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，优选为γ-谷氨酸或脯氨酸。

18.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于R₁选自庚酰基、甲基庚酰基、辛酰基、甲基辛酰基、壬酰基、甲基壬酰基、癸酰基、甲基癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、15-羧基十五酰基、13-羧基十三酰基、11-羧基十一酰基、去氧胆酸以及生物素，优选为月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基、去氧胆酸、生物素，更优选为十八烷酸酰基、17-羧基十七酰基。

19.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述类似物具有如下所述的结构：

其中，X₁选自D-Ala、β-Ala、GABA、Aib、Abu、Arg、Asp、Asn、Cys、D-Glu、γ-Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Pro、Phe、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val、Met，优选β-Ala、GABA、Aib、Abu、Arg、Cys，更优选为Arg；X₂选自D-Ala、β-Ala、GABA、Aib、Abu、Arg、Asp、Asn、Cys、D-Glu、γ-Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Pro、Phe、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val、Met，优选β-Ala、GABA、Aib、Abu、Arg、Cys，更优选为Arg；X₃选自D-Ala、β-Ala、GABA、Aib、Abu、Arg、Asp、Asn、Cys、D-Glu、γ-Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Pro、Phe、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val、Met，优选β-Ala、GABA、Aib、Abu、Arg、Cys，更优选为Arg；

其中，化学结构通式T可表示为：

其中，m为0,1,2,3,4,5中的一个数字，n为0,1,2,3中的一个数字，p为6-20中的一个整数，R₂为-H或-COOH。

20.前述任一项所述的特立帕肽类似物，所述T可以为以下结构：

其中，m选自0-5的整数，优选为0-2的整数，更优选为2；Xaa₁选自D-丙氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、2-氨基丁酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、D-谷氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、蛋氨酸，优选为4-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，更优选为γ-谷氨酸或脯氨酸。

21.前述任一项所述的特立帕肽类似物，其特征在于所述类似物选自具有以下结构之一的化合物：

1).

22.药物组合物，其包含任一项所述特立帕肽类似物或其可药用盐。

23.前述任一项所述的药物组合物，其还包含可药用载体和/或赋形剂。

24.前述任一项所述的药物组合物，其特征在于其为注射制剂或口服制剂。

25.前述任一项所述的药物组合物，其特征在于所述口服制剂可以为片剂、含片、丸剂、胶囊剂、酏剂、颗粒剂、糖浆剂、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液、分散剂和用于口服或非口服给药的缓释制剂的剂型。

26.前述任一项所述的药物组合物，在用于制备治疗骨质疏松症药物中的用途。

定义

除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH₂CH₃)、单取代的(如CH₂CH₂F)、多取代的(如CHFCH₂F、CH₂CHF₂等)或完全被取代的(CF₂CF₃)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

本文所用的C_m-n指该部分中具有m-n个碳原子。例如，“碳_3-10环烷基”指该环烷基具有3-10个碳原子。“碳_0-6亚烷基”指该亚烷基具有0-6个碳原子，当亚烷基具有0个碳原子时，该基团为键。

本文所用的(AEEA)_m或(Xaa)_n是指该部分中具有m或n个连接的AEEA或Xaa基团。

本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如“C_1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。

当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个R所取代，则每个R都有独立的选项。

术语“被取代”是指特定原子上的任意一个后多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧代(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，氧代不会发生在芳香基上。

PTH，如无特别说明，本发明方案中的PTH均是指PTH(1-34)或以PTH(1-34)为母核的类似物。

本发明方案中的AEEA指8-氨基-3,6二氧辛酸。

术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

作为药学上可接受的盐，例如，可以提及金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。金属盐的非限制性实例包括但不限于碱金属的盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属的盐，例如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。与有机碱形成的盐的非限制性实例包括但不限于与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺等形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。与碱性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。

术语“药物成分”是指一种或多种本申请的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的赋形剂、稀释剂、或载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。

术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些赋形剂、稀释剂、或载体。合适的载体、稀释剂及赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等原料。

本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

某些同位素标记的本申请化合物(例如用³H及¹⁴C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。

本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的

具体实施方式

、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。

本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。

附图说明：

图1：示出了对PTH(1-34)进行13,26,27位氨基酸替换，未进行酰化修饰前的特立帕肽类似物：(Arg²⁶，Gly²⁷)Lys¹³-PTH，(Cys¹³，Ala²⁷)Lys²⁶-PTH以及(Arg¹³，Arg²⁶)Lys²⁷-PTH体外活性EC50值

具体实施方案：

实施例1:N-ε²⁷-PTH(1-34)-AEEA-AEEA-Pro-C₁₇-COOH

(1)材料及试剂

2-CTC树脂，取代值1.15mmol/g。

氨基酸为：Fmoc-Pro-OH，Fmoc-AEEA-OH，十八烷二酸单叔丁酯

合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，哌啶，DIEA。

(2)仪器

CS-BIO型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、Beckman离心机、BUCHI旋蒸仪。

(3)操作步骤

a.固相化学合成多肽

称取2-CTC树脂1.00g，置于多肽合成仪反应器中，加入10mLDCM，浸泡1h，称取2-3倍量的Fmoc-AEEAc-OH及吸取4-6倍量的DIEA，加入10mLDCM溶解后，投入反应器中，进行反应，反应温度为室温，反应二小时，即第一个氨基酸偶联到了树脂上，然后DCM洗涤树脂6次，测定此时树脂的取代值(SD)；随后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DCM洗涤树脂6次，偶联第二个氨基酸，称取三倍量的Fmoc-AEEAc-OH，HOBt及DIC，加入10mlDMF/DCM(1:1)混合溶剂溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DCM洗涤树脂6次。而后，即可按照上述偶联的方法继续进行脯氨酸和十八烷二酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。

b.裂解及沉淀

按照5mL裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFE:DCM＝1:4(V:V)，室温搅拌反应1小时，过滤，滤液40℃旋蒸至干，向旋蒸瓶中加入10mLDCM，再次旋蒸至干，反复进行2-3次，最后加入3mLDCM溶解多肽，加入40mL冰***，放置-20℃冰箱中20min，离心，真空干燥，称重粗肽。

c.液相反应制备特立帕肽衍生物

称取干燥后的粗肽约0.1mmol，HOSU约0.095mmol，及吸取DIC15μL，加入约5mL四氢呋喃，室温下反应1-2小时，旋蒸，除去THF，得到黄色油状物。，加入TFA:H₂O＝90:10的混合溶剂中进行脱叔丁酯保护，室温反应1小时后，倒入冰***进行沉淀，离心得固体，用***洗三次，减压干燥得到固体粉末，称重，用DMF进行溶解，得到侧链活化酯溶液。

将0.5mmol特立帕肽溶于0.1mol/L三乙胺溶液中，向溶液中缓慢滴加侧链活化酯溶液，投料比为1：1.2,室温搅拌10分钟，用0.1mol/L盐酸调节pH至8.0终止反应。

用半制备型RP-HPLC，对粗产物进行纯化。

1纯化

色谱柱：Nano Micro C18制备柱(10mm×250mm,10μm)

流速：5ml/min

检测波长：215nm

流动相：A相：1％HAC/水溶液

B相：1％HAC/乙腈

梯度洗脱程序如表3:

表3梯度洗脱表

用安捷伦1260HPLC，对收集产物进行分析

色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)

流速：1ml/min

检测波长：215nm

流动相：A相：0.1％TFA/水

B相：0.1％TFA/乙腈

梯度洗脱程序如表4:

表4梯度洗脱表

收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1201.62【M+4H】⁺与理论分子量相符。

实施例2:N-ε¹³-PTH(1-34)-AEEA-AEEA-α-Glu-C₁₆

制备过程如实施例1中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1194.6【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例3：N-ε²⁶-PTH(1-34)-γ-Glu-C₁₂

制备过程如实施例1中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1108.2【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例4：N-ε²⁷-PTH(1-34)-AEEA-AEEA-去氧胆酸

制备过程如实施例1中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1196.5【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例5：N-ε¹³-(Arg²⁶，Gly²⁷)PTH-γ-Glu-C₁₆

(1)材料及试剂

2-CTC树脂，取代值1.15mmol/g。

特立帕肽类似物(Arg²⁶，Gly²⁷)PTH由工程菌表达或化学合成方法获得，M/Z＝1019.2(M+4H)⁺

氨基酸为：Fmoc-γ-Glu-Otbu，棕榈酸

合成试剂：HOBt，DIC，DMF，DCM，哌啶，DIEA。

(2)仪器

CS-BIO型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、Beckman离心机、bushi旋蒸仪。

(3)操作步骤

a.固相化学合成多肽

称取2-CTC树脂1.00g，置于多肽合成仪反应器中，加入10mLDCM，浸泡1h，称取2-3倍量的Fmoc-γ-Glu-OH及吸取4-6倍量的DIEA加入10mLDCM溶解后，投入反应器中，进行反应，反应温度为室温(最好为25℃及其以上，否则延长反应时间)，反应二小时，即第一个氨基酸偶联到了树脂上，然后DCM洗涤树脂6次，测定此时树脂的取代值(SD)；随后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DCM洗涤树脂6次，偶联第二个氨基酸，称取三倍量的棕榈酸，HoBT及DIC，一起加入10mlDMF/DCM(1:1)混合溶剂溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DCM洗涤树脂6次。

b.裂解及沉淀

多肽合成结束后，称湿重。按照5mL裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFE:DCM＝1:4(V:V)，室温搅拌反应1小时，过滤至25mL的旋蒸瓶中，40℃旋蒸至无液体存在，然后向旋蒸瓶中加入10mLDCM，再次旋蒸至无液体存在，反复进行2-3次，最后加入3mLDCM，溶解切割的多肽，并将溶液转移至50mL离心管中，加入40mL***，放置-20℃冰箱中20min，离心，真空干燥，称重粗肽。

c.液相反应制备特立帕肽衍生物

称取干燥后的粗肽约0.1mmol，HOSU约0.095mmol，及吸取DIC15μL,加入约5mL四氢呋喃溶解于5mLEP管中，室温下反应1-2小时，然后将反应液体转移至10mL旋蒸瓶中，通过旋蒸，除去THF，其次加入约5mLDMF于该旋蒸瓶中，溶解旋蒸瓶中反应产物，即可得到侧链的活化酯。

之后将0.5mmol特立帕肽类似物溶于0.1mol/L三乙胺溶液中，向溶液中缓慢滴加侧链活化酯溶液，投料比为1：1.2,室温搅拌10分钟，之后用0.1N盐酸调节pH至8.0终止反应。

用半制备型RP-HPLC，对粗产物进行纯化。

1纯化

色谱柱：Nano Micro C18制备柱(10mm×250mm,10μm)

流速：5ml/min

检测波长：215nm

流动相：A相：1％HAC/水溶液

B相：1％HAC/乙腈

梯度洗脱程序如表3:

表3梯度洗脱表

用安捷伦1260HPLC，对收集产物进行分析

色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)

流速：1ml/min

检测波长：215nm

流动相：A相：0.1％TFA/水

B相：0.1％TFA/乙腈

梯度洗脱程序如表4:

表4梯度洗脱表

收集纯度大于90％的目标组分，低压旋蒸，冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1111.1【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例6：N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-Gly-AEEA-Gly-Glu-C₁₇-COOH

(Arg¹³，Arg²⁶)Lys²⁷-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得，M/Z＝1044.3【M+4H】⁺

类似物衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1251.8【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例7：N-ε²⁶-(Cys¹³，Ala²⁷)PTH(1-34)-Phe-AEEA-AEEA-AEEA-C12

(Cys¹³，Ala²⁷)Lys²⁶-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得，M/Z＝1009.7【M+4H】⁺

衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1200.7【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例8：N-ε²⁶-(Arg¹³，Arg²⁷)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-C₁₁-生物素

(Arg¹³，Arg²⁷)Lys²⁶-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得，M/Z＝1044.5【M+4H】⁺

衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1218.2【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例9：N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-C₁₇-COOH

(Arg¹³，Arg²⁶)Lys²⁷-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得M/Z＝1044.5【M+4H】⁺

衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1189.8【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例10：N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-Glu-C₁₇-COOH

(Arg¹³，Arg²⁶)Lys²⁷-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得M/Z＝1044.5【M+4H】衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1186.7【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例11：N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-Ala-C₁₇-COOH

(Arg¹³，Arg²⁶)Lys²⁷-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得M/Z＝1044.5【M+4H】⁺衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1208.5【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例12：N-ε²⁷-(Arg¹³，Arg²⁶)PTH(1-34)-AEEA-AEEA-C₁₆

(Arg¹³，Arg²⁶)Lys²⁷-PTH(1-34)类似物采用工程菌表达或化学合成方法获得M/Z＝1044.5【M+4H】⁺衍生物制备过程如实施例4中所述的方法，经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1175.3【M+4H】⁺与理论分子量为相符。

实施例13：体外活性EC50的检测

采用CHO-K1细胞，以醋酸特立帕肽作为对照品，照美国药典生物活性检测方法。对PTH(1-34)以及PTH(1-34)的衍生物进行体外细胞活性的测定。特立帕肽能够与细胞表面PTH受体(PTH1R)进行特异性结合，导致腺苷酸环化酶活化并因此产生环腺苷一磷酸(cAMP)，后者刺激细胞代谢途径。使用时间分辨荧光技术(TR-FRET)对这些细胞中的PTH1-34浓度依赖性形成的cAMP进行定量分析(检测试剂盒为Perkinelmer公司的LANCEUltracAMP Kit)。利用Prism5软件分析实验数据，以样品浓度为X轴，对应的荧光比值为Y轴，选用四参数方程进行拟合，绘制活性对照品和供试品的剂量反应曲线，得到EC50值。

实施例14：衍生物跨膜转运研究

将Caco-2细胞以5x10⁵个/cm²密度接种于Millicell-CM***式细胞培养皿(Corning公司Transwell板货号3401)的Apical侧，每天进行换液，在第三周后测定跨膜电阻，当电阻大于500Ω·cm²时可用于转运实验。在Caco-2单层细胞上的转运实验，以醋酸特立帕肽(实验室自制)作为对照品。将0.3ml PTH(1-34)或PTH(1-34)衍生物溶液(浓度为100μg/ml)加入到供体池(AP端)，在受体池(BP端)加入0.7mg Hank’s缓冲液，在不同时间点(0,20,45,60和90分钟)在受体池中取出0.1ml溶液，并补充等量的空白Hank’s溶液，利用ELISA试剂盒对浓度进行测定，并绘制浓度与时间的变化曲线利用表观上皮细胞渗透系数P_app公式进行计算

A是渗透膜面积，这里为供体池膜面积(cm²)，C₀是供体池最初样品浓度(ng/ml),dQ/dt为扩散通量(ng/s)。

特立帕肽具有较大的极性，细胞渗透能力较差，无法实现跨细胞的转运。而令人惊奇地，修饰后的特立帕肽衍生物(实施例1与实施例3)以及特立帕肽类似物衍生物(实施例5与实施例7)的P_app值有了1.8-4倍的提高，根据实施例4与实施例8的结果，经去氧胆酸与生物素修饰后显著改善了上皮细胞膜的渗透性，从而增强多肽跨膜转运能力，有效地为多肽分子跨越胃肠道上皮细胞层提供了化合物基础。

根据本发明所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。

本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。