阅读说明：本技术 猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子 () 是由 曲雪婷 尹燕博 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于病毒抗体技术领域,公开了一种猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用,序列为：重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。病毒抗体序列的筛选方法包括：噬菌体抗体的制备；噬菌体抗体文库的淘筛；Phage ELISA方法鉴定抗猫杯状病毒猫源噬菌体单链抗体；将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序,得到重链、轻链可变区序列。本发明为构建高亲和力、低免疫原性的猫源化抗猫杯状病毒的基因工程抗体提供支持,对推动猫源化抗体药物的发展具有重要意义。()

猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子

技术领域

本发明属于病毒抗体技术领域，尤其涉及一种猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。

背景技术

目前，猫杯状病毒(Felinecalicivirus，FCV)是一种于杯状病毒，能对人等多种动物进行感染。临床表现是溃疡的有鼻孔、口腔，皮肤水肿、重症的肺炎等；慢性病例的临床表现为鼻孔、上颚呈现出损伤，低热，口腔、眼角的分泌物明显增加，该病毒当前的分布呈世界性。

目前对于猫杯状病毒病临床治疗主要依赖于单克隆抗体，市售抗体多为异种动物免疫血清，虽然能保护幼龄动物和成年动物免受感染，但无法连续注射，否则将造成剧烈的过敏反应，严重时可导致动物死亡。另外，传统鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果。目前，噬菌体展示技术有着越来越广泛的应用，更多的本动物源化的噬菌体展示抗体库成功构建，尤其是一些单抗药物的研发，使噬菌体展示技术得到了更好地发展。目前，大多构建的为免疫噬菌体库，因为通过免疫后动物体内的抗体水平提高，更有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果会更有优势。目前，大多数均为单克隆抗体，而针对猫源的噬菌体抗体库避免了抗体使用过程中的干扰因素，为猫杯状病毒的诊断和治疗单抗的制备提供了理论依据。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前，并未有人构建过针对猫源的噬菌体抗体库，大多数均为单克隆抗体。

解决以上问题及缺陷的难度为：要想得到一定规模的抗体库，首先要做的是借助RT-PCR技术，获取机体本源的全套抗体基因，目前关于猫源基因序列报道较少，需要我们对抗体轻、重链可变区序列进行多对引物验证。

解决以上问题及缺陷的意义为：有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果会更有优势。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。

本发明是这样实现的，一种病毒抗体序列，所述病毒抗体序列为：重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。

本发明的另一目的在于提供一种由所述病毒抗体序列的重链和轻链通过二硫键连接形成一个四肽链分子。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述四肽链分子的免疫球蛋白分子。

本发明的另一目的在于提供一种猫杯状病毒的检测方法，所述猫杯状病毒的检测方法使用所述的病毒抗体序列。

本发明的另一目的在于提供一种治疗猫杯状病毒单抗的制备方法，所述治疗猫杯状病毒单抗的制备方法使用所述的病毒抗体序列。

本发明的另一目的在于提供一种＝所述病毒抗体序列对的筛选方法，所述病毒抗体序列对的筛选方法包括以下步骤：

第一步，噬菌体抗体的制备；

第二步，噬菌体抗体文库的淘筛；

第三步，Phage ELISA方法鉴定抗猫杯状病毒猫源噬菌体单链抗体；

第四步，将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫杯状病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

进一步，所述第一步包括：将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mL OD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖1mol/L继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。

进一步，所述第二步包括：

(1)包被：用0.1M NaHCO₃将纯化后的猫杯状病毒稀释成2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜。包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；

(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；

(3)洗涤：每孔加入100μL PBST，共洗涤3次。每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；

(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；

(5)洗涤：重复步骤(3)；

(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min。每400μL洗脱液加入75μL Tris-HCL进行中和；将20μL此液体加入到180μL OD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量。并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；

(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mL OD₆₀₀＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mL LB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖；待菌液OD₆₀₀＝0.5时加入4×1010辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库；

(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量；并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。

进一步，所述第三步包括：

(1)包被：将纯化后猫杯状病毒用0.1M NaHCO₃稀释成8μg/mL包被96孔酶标板，将BSA设为空白对照，M13K07为阴性对照；

(2)封闭：弃去96孔酶标板中的包被液，每孔200μL封闭液，37℃孵育2h；

(3)洗涤：每孔加入200μL PBST，洗3次，拍干；

(4)加入噬菌体单链抗体：将噬菌体单链抗体与PBST进行1:1混合，每孔200μL加入到96孔酶标板中，室温孵育2h；

(5)洗涤：同步骤(3)；

(6)敷二抗：按1:5000稀释HRP标记抗M13抗体，37℃孵育1h；

(7)洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：每孔加入50μL TMB显色液，用锡箔纸覆盖，37℃反应10min；

(9)终止：每孔加入50μL 2mol/L的H₂SO₄终止反应，酶标仪检测OD₄₅₀数值。

进一步，所述猫源抗猫杯状病毒单链抗体文库的构建包括：

(1)猫外周血淋巴细胞的分离，对5只实验猫进行疫苗免疫。每次免疫间隔2周，共免疫3次，3次免疫后2周，采集新鲜血液5-10mL与全血及组织稀释液混合均匀，比例为1:1-1:2，在15mL的离心管中加入细胞分离液，并轻轻地沿管壁加入等体积的稀释后的抗凝血；水平离心机以转速400g-800g，时间15min-25min进行离心，离心后，离心管内液体应分为四层，由上至下分别为：第一层：血浆层；第二层：淋巴细胞层；第三层：分离液和第四层：红细胞层。用吸管小心吸取第二层乳白色的淋巴细胞至另一15mL离心管中，加入10mL的清洗液进行混匀，以250g，10min离心；重复2-3次，弃上清。将管底的淋巴细胞用含有90％胎牛血清、10％DMSO和1％双抗的冻存液进行重悬，分装到2mL的冻存管中，4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱过夜，第二天移至液氮的顺序冻存淋巴细胞；

(2)猫外周血淋巴细胞总RNA的提取，将冻存管中的PBMC移至1.5mL离心管中以1800rpm，离心5min，弃掉上清；留有50μL-100μL的上清在离心管底部，重悬管底细胞；加入1mL Trizol，用移液枪反复吹打均匀，至室温孵育5min；加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，至室温孵育2-3min，冷冻离心机以12000rpm，4℃离心15min，此时液体可分为下层含有DNA和蛋白质的有机相，和上层含有RNA的透明层；离心管倾斜45度，将透明层移至另一1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇混匀，室温孵育10min后12000rpm离心10min，弃去上清；加入1mL75％乙醇用漩涡振荡器洗涤，7500rpm，4℃，离心5min，弃上清；将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min，用至少30μL DEPC水重悬溶解，超微量分光光度计测定浓度及A₂₆₀与A₂₈₀比值，-80℃保存；

(3)猫重链可变区V_H和轻链可变区V_L的扩增，以提取的总RNA为模板，采用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使总RNA反转录成cDNA，以其为模板，PCR扩增V_H基因和V_L基因；配制1.5％的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测鉴定，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化V_H和V_L片段；用Linker接头的引物通过SOE-PCR基因工程方法将重链可变区基因V_H分别与轻链可变区基因V_L、轻链可变区基因V_L组装成scFv基因，形成V_L-linker-V_H的形式，配制1.0％琼脂糖凝胶，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化scFv基因片段，将纯化后的scFv基因产物与噬菌体载体pComb3XSS进行酶切与连接；

(4)单链抗体文库的构建，将20μL的的连接产物与80μL电转感受态XLI-Blue在2.5KV，800Ω的条件下进行电击转化，电转杯用1mLSOC培养基进行冲洗，将液体吸至50mL离心管中，220rpm/min，37℃，摇菌45min；分别将10μL、50μL和100μL的菌液涂在含有Amp+(100μg/mL)的平板，鉴定电转效果。在离心管中加入9mL含有Amp+(100μg/mL)LB液体培养基，以1：1000加入葡萄糖，220rpm/min，37℃，摇菌至OD₆₀₀＝0.5。加入20μL辅助噬菌体M13K07进行拯救，感染30min后摇菌1h；将菌液3000rpm，离心6min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm/min，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜，12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm,离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS重悬沉淀，加入50％甘油混匀，放置-20℃保存，按此方法多次建库，建立scFv噬菌体抗体原始文库。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的猫源化抗猫杯状病毒抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列，为构建高亲和力、低免疫原性的犬源化抗猫杯状病毒的基因工程抗体提供支持。对推动猫源化抗体药物的发展具有重要意义。本发明选取免疫猫为研究对象，先采集样本的外周血，紧接着再借助离心机对PBMC进行分离，最后基于噬菌体展示法，于噬菌体载体表面来进行猫源抗体基因的表达，得到了针对猫杯状病毒噬菌体单链抗体库，实现了抗体的同动物源化。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的病毒抗体序列的筛选方法流程图。

图2 V_H基因PCR扩增产物

图3 Kappa基因PCR扩增产物

图4 Lamda基因PCR扩增产物

图5 scFv基因PCR扩增产物

图6单链抗体基因文库构建库量

图7抗猫杯状病毒噬菌体抗体结合活性

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供的病毒抗体序列为：重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。

如图1所示，本发明提供的病毒抗体序列对的筛选方法包括以下步骤：

S101：噬菌体抗体的制备；

S102：噬菌体抗体文库的淘筛；

S103：Phage ELISA方法鉴定抗猫杯状病毒猫源噬菌体单链抗体；

S104：将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫杯状病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1猫源抗猫杯状病毒单链抗体文库的构建

1.猫外周血淋巴细胞的分离

根据国际动物免疫手册，对5只实验猫进行疫苗免疫。每次免疫间隔2周，共免疫3次。3次免疫后2周，采集猫外周血。取新鲜血液5-10mL与全血及组织稀释液混合均匀，比例为1:1-1:2。在15mL的离心管中加入细胞分离液，并轻轻地沿管壁加入等体积的稀释后的抗凝血。水平离心机以转速400g-800g，时间15min-25min进行离心，离心后，离心管内液体应分为四层，由上至下分别为：第一层：血浆层；第二层：淋巴细胞层；第三层：分离液和第四层：红细胞层。用吸管小心吸取第二层乳白色的淋巴细胞至另一15mL离心管中，加入10mL的清洗液进行混匀，以250g，10min离心。重复2-3次，弃上清。将管底的淋巴细胞用含有90％胎牛血清、10％DMSO和1％双抗的冻存液进行重悬，分装到2mL的冻存管中，4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱过夜，第二天移至液氮的顺序冻存淋巴细胞。

2.猫外周血淋巴细胞总RNA的提取

将冻存管中的PBMC移至1.5mL离心管中以1800rpm，离心5min，弃掉上清。留有50μL-100μL的上清在离心管底部，重悬管底细胞。加入1mL Trizol，用移液枪反复吹打均匀，至室温孵育5min。加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，至室温孵育2-3min，冷冻离心机以12000rpm，4℃离心15min，此时液体可分为下层含有DNA和蛋白质的有机相，和上层含有RNA的透明层。离心管倾斜45度，将透明层移至另一1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇混匀，室温孵育10min后12000rpm离心10min，弃去上清。加入1mL75％乙醇用漩涡振荡器洗涤，7500rpm，4℃，离心5min，弃上清。将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min，注意不要让RNA太干，用至少30μL DEPC水重悬溶解，超微量分光光度计测定浓度及A₂₆₀与A₂₈₀比值，-80℃保存。

3.猫重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的扩增

以提取的总RNA为模板，采用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使总RNA反转录成cDNA。以其为模板，引物序列SEQ ID NO：5所示，PCR扩增V_H基因和V_L基因。配制1.5％的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳检测鉴定，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化V_H和V_L片段。用Linker接头的引物通过SOE-PCR基因工程方法将重链可变区基因V_H分别与轻链可变区基因V_L(Lamda)、轻链可变区基因V_L(Kappa)组装成scFv基因，形成V_L-linker-V_H的形式。配制1.0％琼脂糖凝胶，在凝胶成像仪观察结果，进行胶回收，纯化scFv基因片段。将纯化后的scFv基因产物与噬菌体载体pComb3XSS进行酶切与连接。

4.单链抗体文库的构建

将20μL的的连接产物与80μL电转感受态XLI-Blue在2.5KV，800Ω的条件下进行电击转化，电转杯用1mLSOC培养基进行冲洗，将液体吸至50mL离心管中，220rpm/min，37℃，摇菌45min。分别将10μL、50μL和100μL的菌液涂在含有Amp+(100μg/mL)的平板，鉴定电转效果。在离心管中加入9mL含有Amp+(100μg/mL)LB液体培养基，以1：1000加入葡萄糖(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌至OD₆₀₀＝0.5。加入20μL辅助噬菌体M13K07进行拯救，感染30min后摇菌1h。将菌液3000rpm，离心6min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌6h。将培养基12000rpm/min，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS(pH7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm,离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS(pH7.4)重悬沉淀，加入50％甘油混匀，放置-20℃保存。按此方法多次建库，建立scFv噬菌体抗体原始文库。

实施例2猫源抗猫杯状病毒单链抗体文库的筛选

1.噬菌体抗体的制备

将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mL OD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖(1mol/L)继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌6h。将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL 1×PBS(PH7.4)重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。

2.噬菌体抗体文库的淘筛

(1)包被：用0.1M NaHCO3将纯化后的猫杯状病毒稀释成2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜。包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；

(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；

(3)洗涤：每孔加入100μL PBST，共洗涤3次。每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；

(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；

(5)洗涤：重复步骤(3)；

(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min。每400μL洗脱液加入75μL Tris-HCL进行中和。将20μL此液体加入到180μL OD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量。并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；

(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mL OD₆₀₀＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mL LB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖(1M/L)。待菌液OD₆₀₀＝0.5时加入4×1010辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清。以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL 1×PBS(pH7.4)重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS(pH7.4)重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库。

(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量。并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。

3.Phage ELISA方法鉴定抗猫杯状病毒猫源噬菌体单链抗体

(1)包被：将纯化后猫杯状病毒用0.1M NaHCO₃稀释成8μg/mL包被96孔酶标板，将BSA设为空白对照，M13K07为阴性对照；

(2)封闭：弃去96孔酶标板中的包被液，每孔200μL封闭液，37℃孵育2h；

(3)洗涤：每孔加入200μL PBST，洗3次，拍干；

(4)加入噬菌体单链抗体：将噬菌体单链抗体与PBST进行1:1混合，每孔200μL加入到96孔酶标板中，室温孵育2h；

(5)洗涤：同步骤(3)；

(6)敷二抗：按1:5000稀释HRP标记抗M13抗体，37℃孵育1h；

(7)洗涤：同步骤(3)；

(8)显色：每孔加入50μL TMB显色液，用锡箔纸覆盖，37℃反应10min；

(9)终止：每孔加入50μL 2mol/L的H₂SO₄终止反应，酶标仪检测OD₄₅₀数值

将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫杯状病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

SEQ ID NO：1：重链可变区氨基酸序列

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu

Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

Arg Gly Glu Asn Asn Asp Pro Tyr Asn Ile Asp Leu Trp Gly His Gly

Thr Ile Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO：2：轻链可变区氨基酸序列

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

Pro Arg Leu Leu Ile Phe Arg Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

Thr His Ala Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr His Leu Glu Ile Lys

SEQ ID NO：3：重链可变区核苷酸序列

gacgtgcagctggtggagtctgggggagacctggtgcagcctggggggtccctgagactcacctgtgtggcctccggatt

caccttcagtagctatgaaatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctgcagtgggtcgcatatattagtagtg

gaggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgcccagaacacattgtatctg

cagatgaacagcctcaagaccgaggacacggccacatattactgtgcgaggggggagaataacgacccctataatatcga

tctctggggccatggaaccatagtcacagtgtcctcag

SEQ ID NO：4：轻链可变区核苷酸序列

gatgtcgtgatgacgcagacccctctgtccctgcccgtcacccctggagagccggcctcaatctcctgcagggccagtca

gagcctcctgcacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccacggctcctgatct

ttagggtttccaaccgggcctctggggtcccagacaggttcagtggcagcgggtcggggacagatttcaccctgagaatc

agcagggtggaggctgacgacgtcggagtttattactgccagcaaggtacacatgctccgaccacctttggccaagggac

acatctggagattaaac

SEQ ID NO：5：扩增猫重链可变区上游引物

ggtggttcctctagatcttcc ctgcacgtcgaccac

ggtggttcctctagatcttcc gttgaatgtgaagcc

ggtggttcctctagatcttcc gtccaaaacgaccac

ggtggttcctctagatcttcccaatggactggagctggagaatcc

ggtggttcctctagatcttccatggagtttgtgctgggctgggttttcct

ggtggttcctctagatcttccatcacygkavaacgccatcctcttccaga

扩增猫重链可变区下游引物

acctggccggcctggcctggttgttgaccacactgttgttctt

acctggccggcctggcctggttgttgaccacactgttgttctt

acctggccggcctggcccgtggtggaggctgaggacaccgtca

acctggccggcctggcc ggctccttggcccca

SEQ ID NO：6：

扩增猫轻链(Kappa)上游引物

atagggcccaggcggcc ctacagcactactgc

atagggcccaggcggcc tcacaccacgactgc

atagggcccaggcggcc cgctagtgctactgc

atagggcccaggcggccgttcagcttctcaaaatgaggttccctgct

扩增猫轻链(Kappa)下游引物

ggaagatctagaggaaccaccatatgcacacgatagaggcacttcctgtat

ggaagatctagaggaaccacc cgtccccaggccgaa

SEQ ID NO：7：

扩增猫轻链(lamda)上游引物

atagggcccaggcggcc gtcagatccgactga

atagggcccaggcggcc gtcagacacgactga

atagggcccaggcggcc gtcagacgggactta

atagggcccaggcggcc gtcagccccgactga

atagggcccaggcggcc ccagtcagccccggc

atagggcccaggcggcc aggatacacgactga

atagggcccaggcggcc cggatacacaactga

atagggcccaggcggcc aggtcactccactga

atagggcccaggcggcc gtcggacacgactgg

扩增猫轻链(lamda)下游引物

ggaagatctagaggaaccaccggtccctccgccgaa

证明部分(/实验/仿真//能够证明本发明创造性的正面实验数据等)

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛博隆基因生物工程有限公司

<120> 一种病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用）

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Glu Asn Asn Asp Pro Tyr Asn Ile Asp Leu Trp Gly His Gly

100 105 110

Thr Ile Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Phe Arg Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

85 90 95

Thr His Ala Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr His Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 358

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgtgcagc tggtggagtc tgggggagac ctggtgcagc ctggggggtc cctgagactc 60

acctgtgtgg cctccggatt caccttcagt agctatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctgcagtg ggtcgcatat attagtagtg gaggtagcac atactacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg cccagaacac attgtatctg 240

cagatgaaca gcctcaagac cgaggacacg gccacatatt actgtgcgag gggggagaat 300

aacgacccct ataatatcga tctctggggc catggaacca tagtcacagt gtcctcag 358

<210> 4

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgtcgtga tgacgcagac ccctctgtcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctca 60

atctcctgca gggccagtca gagcctcctg cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacgg ctcctgatct ttagggtttc caaccgggcc 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagc gggtcgggga cagatttcac cctgagaatc 240

agcagggtgg aggctgacga cgtcggagtt tattactgcc agcaaggtac acatgctccg 300

accacctttg gccaagggac acatctggag attaaac 337

<210> 5

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggttcct ctagatcttc cctgcacgtc gaccacggtg gttcctctag atcttccgtt 60

gaatgtgaag ccggtggttc ctctagatct tccgtccaaa acgaccacgg tggttcctct 120

agatcttccc aatggactgg agctggagaa tccggtggtt cctctagatc ttccatggag 180

tttgtgctgg gctgggtttt cctggtggtt cctctagatc ttccatcacy gkavaacgcc 240

atcctcttcc agaacctggc cggcctggcc tggttgttga ccacactgtt gttcttacct 300

ggccggcctg gcctggttgt tgaccacact gttgttctta cctggccggc ctggcccgtg 360

gtggaggctg aggacaccgt caacctggcc ggcctggccg gctccttggc ccca 414

<210> 6

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atagggccca ggcggcccta cagcactact gcatagggcc caggcggcct cacaccacga 60

ctgcataggg cccaggcggc ccgctagtgc tactgcatag ggcccaggcg gccgttcagc 120

ttctcaaaat gaggttccct gctggaagat ctagaggaac caccatatgc acacgataga 180

ggcacttcct gtatggaaga tctagaggaa ccacccgtcc ccaggccgaa 230

<210> 7

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atagggccca ggcggccgtc agatccgact gaatagggcc caggcggccg tcagacacga 60

ctgaataggg cccaggcggc cgtcagacgg gacttaatag ggcccaggcg gccgtcagcc 120

ccgactgaat agggcccagg cggccccagt cagccccggc atagggccca ggcggccagg 180

atacacgact gaatagggcc caggcggccc ggatacacaa ctgaataggg cccaggcggc 240

caggtcactc cactgaatag ggcccaggcg gccgtcggac acgactgggg aagatctaga 300

ggaaccaccg gtccctccgc cgaa 324