阅读说明：本技术 抗sars-cov-2病毒s蛋白的单链抗体及其用途 (Single chain antibody for resisting SARS-COV-2 virus S protein and its use ) 是由 罗绍祥 易汪雪 张芳 王静 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体,所述单链抗体包括单链抗体1和单链抗体2中的至少一种：单链抗体1：具有如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的三个互补决定区的重链和具有如SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的三个互补决定区的轻链；单链抗体2：具有如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的三个互补决定区的重链和具有如SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的三个互补决定区的轻链。本发明还提供所述单链抗体在制备SARS-COV-2病毒检测试试剂盒中的用途。(The invention provides a single-chain antibody for resisting SARS-COV-2 virus S protein, the single-chain antibody comprises at least one of single-chain antibody 1 and single-chain antibody 2: single-chain antibody 1: has the sequence shown in SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 3 and a light chain having three complementarity determining regions of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 6, and a light chain of three complementarity determining regions of the amino acid sequence set forth in seq id no; single-chain antibody 2: has the sequence shown in SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 9 and a light chain having three complementarity determining regions of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO: 12, or a light chain of three complementarity determining regions of the amino acid sequence set forth in seq id no. The invention also provides the use of the single-chain antibody in the preparation of a SARS-COV-2 virus detection reagent kit.)

抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体及其用途。

背景技术

冠状病毒是一种以哺乳动物和鸟类为宿主的单链RNA病毒。可以感染人的冠状病毒包括229E、NL63、OC43、HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。这些病毒可以引起一系列轻微的季节性疾病，或者导致严重疾病爆发，以SARS-CoV和MERS-CoV导致的严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸系统综合征(MERS)最为典型。SARS-CoV-2是第七种可以感染人类的冠状病毒，该病毒的传染性比SARS-CoV和MERS-CoV更强，导致COVID-19的大范围爆发。

冠状病毒由双层脂质的囊膜组成，包含刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白以及核衣壳蛋白。其中，膜蛋白介导病毒与宿主ACE2蛋白的相互作用，SARS-CoV-2与SARS-CoV使用相同的入侵受体。序列比对发现，SARS-CoV-2与SARS-CoV的氨基酸序列同源性为80％。S蛋白分为S1和S2两个亚基，其中S1的功能是与宿主受体结合，S2的主要功能是促进病毒和细胞膜融合。S1的RBD结构域与ACE2蛋白结合的高亲和力导致病毒能在人群中快速传播。S蛋白暴露于病毒表面，含有大量的抗原决定簇，可以产生针对病毒的保护性抗体。因此，S蛋白是疾病诊断和治疗最重要的靶点。

单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv单链抗体的优点：可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性；免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

因此，亟需开发新的用于针对SARS-COV-2的单链抗体。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体及其用途，可以特异性识别RBD蛋白，所述单链抗体与RBD结合的EC50为0.4212ng/ml～325.24ng/ml。

第一方面，本发明提供了抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体，所述单链抗体能识别SARS-COV-2病毒S蛋白的RBD结构域，所述单链抗体包括单链抗体1和单链抗体2中的至少一种：

单链抗体1：包括具有如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的三个互补决定区的重链和具有如SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的三个互补决定区的轻链；

单链抗体2：包括具有如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的三个互补决定区的重链和具有如SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的三个互补决定区的轻链。

进一步地，所述单链抗体包括如下的一种或多种单链抗体：

H6单链抗体：包括具有如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO：14所示氨基酸序列的轻链；

D2单链抗体：包括具有如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO：16所示氨基酸序列的轻链。

进一步地，所述抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体还包括：所述H6单链抗体和D2单链抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。

进一步地，所述抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体还包括：所述H6单链抗体和D2单链抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。

第二方面，本发明提供了一种编码所述单链抗体的核酸分子。

进一步地，所述核酸分子包括编码所述单链抗体1的核苷酸分子和/或编码所述单链抗体2的核苷酸分子。

更进一步地，编码所述单链抗体1重链的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，编码所述单链抗体1轻链的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；编码所述单链抗体2重链的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，编码所述单链抗体2轻链的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

第三方面，本发明提供了一种含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供了一种重组抗体，所述重组抗体由抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体和人源Fc片段组成，所述人源Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。

第五方面，本发明提供了所述的SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的单链抗体以及所述的重组抗体在制备抑制SARS-COV-2病毒感染的药物、制备SARS-COV-2病毒试剂或试剂盒中的用途。

第六方面，本发明提供了一种SARS-COV-2病毒检测试剂或试剂盒，包括所述的SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的单链抗体或者所述的重组抗体。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体，所述单链抗体与S1蛋白结合的EC50分别为42.83ng/ml和245.13ng/ml；所述单链抗体与RBD蛋白结合的EC50分别为29.51ng/ml和152.45ng/ml；所述单链抗体与病毒受体ACE2蛋白竞争，IC50分别为23.32ng/ml和125.45ng/ml，具有抑制病毒感染的能力。本发明提供的一种SARS-COV-2病毒的检测试剂盒，包括所述单链抗体或者包括由所述单链抗体和人源Fc片段组成的重组抗体，特异性强，灵敏度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是实施例3中H6重组抗体与S1蛋白结合曲线图；

图2是实施例4中H6重组抗体与RBD蛋白结合曲线图；

图3是实施例5中H6重组抗体与ACE2蛋白的竞争情况；

图4是单链抗体应用于胶体金检测试剂盒时的灵敏度结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

S蛋白暴露于病毒表面，含有大量的抗原决定簇，可以产生针对病毒的保护性抗体，是疫苗研发和中和性抗体开发的主要抗原。同时，由于其免疫原性较强，可以在病毒体内产生大量抗体，也是开发诊断试剂盒的重要原料。

天然抗体库适合筛选各种抗原，不需要单独免疫小鼠，结合噬菌体展示技术的高通量筛选方案，可以在一周时间内筛选到识别目标蛋白的抗体。本研究用重组表达的S蛋白筛选鼠天然抗体库，获得了2株可以特异性识别S蛋白的单链抗体：

H6单链抗体：包括具有如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO：14所示氨基酸序列的轻链；所述重链具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的三个互补决定区，所述轻链具有SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的三个互补决定区。

D2单链抗体：包括具有如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO：16所示氨基酸序列的轻链。所述重链具有SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的三个互补决定区，所述轻链具有SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的三个互补决定区。

所述单链抗体的CDR区的氨基酸序列如下表1所示：

表1

因此，具有H6单链抗体的重链互补决定区CDR1-CDR3、轻链互补决定区CDR1-CDR3的单链抗体，具有D2单链抗体的重链互补决定区CDR1-CDR3、轻链互补决定CDR1-CDR3的单链抗体，也在本发明的保护范围之内，即本发明的单链抗体1-单链抗体2。

这些单链抗体，经实验验证，能够与新型冠状病毒SARS-COV-2的S蛋白RBD区特异性结合，H6重组抗体和D2重组抗体与S1蛋白结合的EC50分别为42.83ng/ml和245.13ng/ml；H6重组抗体和D2重组抗体与RBD蛋白结合的EC50分别为29.51ng/ml和152.45ng/ml。H6重组抗体和D2重组抗体与病毒受体ACE2蛋白竞争，IC50分别为23.32ng/ml和125.45ng/ml，该抗体具有抑制病毒感染的能力。

此外，本发明还将所述单链抗体重组后获得的重组抗体；

所述单链抗体或者重组抗体用于SARS-COV-2病毒的胶体金检测试剂盒，特异性强、准确度高，灵敏度高。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。

实施例1获得单链抗体

1、构建噬菌体展示抗体库

(1)取一支15ml离心管，先加入与血液样本等量的分离液，小心吸取血液样本加于分离液之液面上，450-650g，离心20-30min；离心后，此时离心管中由上至下分为四层，依次为血浆层，环状乳白色淋巴细胞层，透明分离液层和红细胞层；用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中；向所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞，250xg，离心10min；离完心看上清液是否澄清，不够澄清加长离心时间；用1xPBS清洗细胞2次，加trizol裂解细胞-80℃保存。

(2)取-80℃保存的外周淋巴细胞裂解液在室温中融化；加入0.2ml氯仿，盖上盖子，剧烈振荡15s，室温放置2min后，于12000g、4℃离心15min；将上清小心转至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min；于12000g，4℃离心15min；离心后弃上清，沉淀用75％的酒精漂洗，再次于12000g，4℃离心5min；离心后弃上清，将离心管置于室温，待其干燥用无RNase的水溶解RNA；取少许溶解的RNA跑琼脂糖胶，并测定浓度，判断RNA是否降解。

(3)从-80℃取出总RNA于冰上融化；PCR仪上65℃5min打开RNA的二级结构；放置冰上2min；依次加入buffer和逆转录酶及引物37℃15min，98℃5min；用内参引物验证得到的cDNA；-20℃保存(-80℃长期保存)。配制PCR反应体系，用小鼠抗体库引物(引物序列如表2所示)，从cDNA中扩增出抗体重链和轻链可变区；

PCR反应条件94℃4min，(94℃30s，54℃30s，72℃1min)25个循环，72℃4min；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下约350bp左右的目的条带，用胶回收柱回收目的片段扩增产物。

将重链和轻链回收的抗体基因，分别用PCR方法添加linker(GGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCT)，跑胶回收后按照等物质量混合，加入酶切位点引物(酶切位点选用SfiⅠ、NotⅠ)，通过PCR扩增反应(反应条件同从cDNA中扩增出抗体重链和轻链可变区的PCR反应条件)，实现重链和轻链通过linker连接。

按如下体系将各试剂加入到PCR管中：

在PCR仪上50℃过夜进行SfiⅠ酶切；取出后冷却至室温，继续向体系中加入以下成分：

10xBuffer 5uL

NotⅠ 1ul

加水至 50ul

在PCR仪上37℃保温过夜进行NotⅠ酶切；跑1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用；配制反应体系，将抗体基因连入酶切后的pCANTAB5E载体。

按下列体系配制连接体系

在PCR仪上16℃连接过夜。

划线Minimal培养板37℃培养过夜；接种TG1单菌落至5mL2YT培养液中于37℃振荡培养过夜；次日将接种过夜培养的菌液5mL加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600达到0.4-0.5；将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；用300mL预冷的灭菌去离子水于冰水中轻柔重悬沉淀，至沉淀细胞完全均匀地分散于水中；在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；再依次用150mL预冷的灭菌去离子水和30mL预冷的10％的甘油(用灭菌去离子水配制)如上所述重悬细胞两次；最后将细胞重悬于1mL预冷的10％的甘油中，置于冰上立即使用或分装；冻存于-80℃中待用；向100uL感受态中加入5uL连接产物，放于冰上预冷，转入预冷后的电转杯中；调节电转仪电压2.5KV电击时间5ms，电击后，迅速加入0.9ml 2YT培养基，37℃振荡培养1.5小时；取10uL梯度稀释，涂布于SOBAG平板上，计算库容，剩余菌液涂布于10个SOBAG平板上，37℃培养过夜。

对梯度稀释的菌落计数，计算出本次建成的抗体库的库容；从SOBAG平板上随机挑取20个克隆，用菌落PCR检测抗体基因***载体的效率；将随机挑选的20个克隆送测序分析，检测抗体库容，抗体基因的完整性及多样性。

2、拯救噬菌体表面展示抗体库

将构建好的小鼠天然抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，应当先拯救文库，使其成为噬菌体展示的抗体库。具体方法如下：

将1.5mL带E-tag标签的抗体库接种到300mL 2YT-AG培养基中，至OD_600nm约0.3-0.4；37℃振荡培养约1.5h至OD_600nm＝0.5-0.6；按细菌：phage＝1:5加入helper phage辅助噬菌体(M13K07)，37℃振荡培养约1h；4000rpm 15℃离心15min，去除培养基；加入200mL 2YT-AK(100μg/mL Amp，50μg/mL Kan)培养基重悬细菌，37℃培养2h；10000rpm离心20min去除沉淀；上清加入40mL PEG/NaCl沉淀phage，冰浴过夜；10000rpm离心20min，去掉上清；用0.6mL2YT培养基重悬phage，4℃备用。若需要大量制备phage，更换kan抗性的培养基以后，培养时间从两小时延长至过夜培养。获得的噬菌体经过梯度稀释，感染TG1菌，涂布SOBAG平板，通过菌落计数计算噬菌体库滴度。

3、淘选单链抗体

本实验利用His Bind Resin结合抗原蛋白，从噬菌体展示的抗体库中淘选抗体，具体过程如下：活化His Bind Resin：取200μL His Bind Resin于1.5mL离心管中，1000g离心1min，去掉保存溶液；加入200μL的ddH₂O清洗树脂一次，1000g离心1min，去掉上清，重复此步骤一次；加入200μL离子化缓冲液，重悬树脂，静置10min，离心去掉上清；加入200μL结合缓冲液，重悬树脂，静置10min；取40μL树脂加入1.5mL离心管中，离心去掉上清。

4、淘选识别目的蛋白的单链抗体

取纯化后的S1蛋白35μL(约10μg)，加入165μL PBS中，混匀后加入装有活化后的树脂的EP管中，旋转混匀1h，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL漂洗缓冲液，重悬树脂，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复一次。取拯救后的噬菌体展示抗体库溶液300μL，加入0.3μL Triton X-100，用微量移液器轻轻混匀；加入40μL未活化的树脂，轻微旋转反应1h；1000g离心1min，取上清加入40μL已包被抗原蛋白的树脂，轻微旋转反应2h；1000g离心1min，去掉上清；加入500μL漂洗缓冲液(含0.1％Triton X-100)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；

加入500μL漂洗缓冲液含(0.1％Tween-20)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；最后一次漂洗后，将树脂转移到新的EP管中，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL洗脱缓冲液，轻微旋转洗脱20min；1000g离心1min，取上清，加入5mL TG1菌液中，37℃感染1h；将感染的菌液涂布SOBAG平板，30℃倒置培养过夜；次日，用2YT-AG培养基刮下平板上的菌落，并拯救成噬菌体进行下一轮淘选。

5、挑选识S1蛋白的阳性克隆

从SOBAG平板上随机挑取单菌落接种到96孔细菌培养板中，每孔加入200μL2YT-AG，37℃培养过夜；吸取25μL菌液到新的细菌培养板中，加入175μL 2YT-AG培养基，37℃培养3h；3500rpm离心10min，去上清，菌沉淀重悬于200μL 2YT-AI(100μg/mL Amp，1mM IPTG)培养基中，30℃诱导过夜；3500rpm离心10min，上清4℃保存备用；将纯化的的目的蛋白加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL以上制备好的单链抗体上清和50μL 4％PBSM，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL anti-E/HRP conjugation(以4％PBSM按1：5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL 2mol/L H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定OD_450nm值判定目的蛋白的浓度。

6、阳性克隆测序和序列分析

将上述淘选得到的OD450nm值较大的目的蛋白经ELISA鉴定，将鉴定为阳性的单克隆送金开瑞测序，测序的通用引物为S1：5’-GACCATGATTACGCCAAGC-3’，用DNAstar和Clustalw1.8分析抗体的重链与轻链可变区序列，最终获得了2株不同的抗体：

H6单链抗体：包括具有如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO：14所示氨基酸序列的轻链；所述重链具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的三个互补决定区，所述轻链具有SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的三个互补决定区。

D2单链抗体：包括具有如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的重链和具有如SEQ IDNO：16所示氨基酸序列的轻链。所述重链具有SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的三个互补决定区，所述轻链具有SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的三个互补决定区。

表2

表2中，H表示重链，K表示轻链，M代表小鼠，V代表可变区，所述MHV是扩增重链的，MKV是扩增轻链的，back和for分别代表上下游，MHV.BACK1-MHV.BACK10中的任意一条与MHV.FOR1-MHV.FOR4中的任意一条组成一对用于扩增重链的引物对；MKV.BACK1-MKV.BACK10中的任意一条与MKV.FOR1-MKV.FOR4中的任意一条组成一对用于扩增氢链的引物对。

实施例2抗体表达

1、重组表达载体的构建

根据测序结果，用引物扩增抗体基因；所述上游因为:5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3’，下游引物为：5’-ACCGGCGCACCTGCGGCCGC-3’；抗体基因经sfiI和NotI双酶切，***抗体表达载体pSecTag2A-fc，用质粒抽提试剂盒提取质粒。所述pSecTag2A-fc用pSecTag2A(Thermo Fisher，V90020)改造，在载体的hind III和BamH I酶切位点中***了人源IgG1 Fc基因，所述人源Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)。

2、融合蛋白的表达

转染前将所有试剂置于室温10分钟，以下操作使用6孔培养皿；将3μg质粒DNA稀释到250μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次；将5μLPEI试剂稀释到250μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次；注意：无血清的DMEM培养基是稀释液，不能使用含血清的培养基进行DNA和将稀释好的PEI转染试剂一次性全部加入到已稀释好的质粒DNA中，立即用移液枪吹吸3-4次；室温放置10-15分钟，以形成PEI-DNA复合物；转染前18-24小时进行细胞的计数并铺板，以便在转染时，使贴壁细胞的汇合度大约80％左右；弃去孔中原培养基，加入1ml新鲜的DMEM完全培养基；制备PEI-DNA复合物；将PEI-DNA混合液均匀滴入细胞培养基中，轻轻做十字运动，让PEI-DNA复合物分散均匀；培养皿放于5％CO₂，37℃恒温培养箱中，72h后收集细胞，检测蛋白表达量。按照相同的比例转化100ml细胞，纯化重组表达的抗体。取上清进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析，纯化的重组抗体用间接竞争ELISA初步测定其活性。通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及IPTG浓度等)，可以进一步提高目的蛋白表达量，为大量制备重组提供了途径。

实施例3重组抗体与S1蛋白结合情况

将实施例1筛选获得的2株单链抗体：H6单链抗体和D2单链抗体，经过实施例2表达后，获得的H6重组抗体和D2重组抗体分别与S1结合，检测抗体与S1结合的EC50值，S1蛋白按照2μg/ml包被微孔板；检测结果如表3所示。

表3

组别	EC50
		H6重组抗体	42.83ng/ml
D2重组抗体	245.13ng/ml

由表2可知，H6重组抗体和D2重组抗体的EC50分别为42.83ng/ml和245.13ng/ml。

实施例4重组抗体与RBD蛋白结合情况

将实施例1筛选获得的2株单链抗体：H6单链抗体和D2单链抗体，经过实施例2表达后，获得的H6重组抗体和D2重组抗体分别与RBD结合，检测抗体与RBD结合的EC50值，RBD蛋白按照2μg/ml包被微孔板；检测结果如表4所示。

表4

组别	EC50
		H6重组抗体	29.51ng/ml
D2重组抗体	152.45ng/ml

由表3可知，H6重组抗体和D2重组抗体的EC50分别为29.51ng/ml和152.45ng/ml。

实施例5重组抗体与ACE2蛋白的竞争情况

将实施例1筛选获得的2株单链抗体：H6单链抗体和D2单链抗体，经过实施例2表达后，获得的H6重组抗体和D2重组抗体分别与ACE2结合，H6重组抗体和D2重组抗体检测与ACE2结合的EC50值，ACE2蛋白按照2μg/ml包被微孔板。测定OD450nm数值，H6重组抗体和D2重组抗体采用的抗IC50值如表5所示。

表5

组别	IC50
		H6重组抗体	23.32ng/ml
D2重组抗体	125.45ng/ml

由表3可知，H6重组抗体和D2重组抗体的IC50分别为23.32ng/ml和125.45ng/ml。

实施例6重组抗体应用于胶体金检测

纯化后的H6重组抗体按照28571ng/ml、7142ng/ml、1875ng/ml、446.4ng/ml、223.2ng/ml稀释，上样70μL到胶体金检测卡。图4是H6重组抗体用作质控抗体应用于胶体金检测试剂盒时的灵敏度结果，由图4可知，所有检测卡C线正常，T线随抗体梯度稀释信号减弱，表明H6重组抗体可以识别S1蛋白，检测信号随着稀释比例增加而降低，灵敏度高。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> 抗SARS-COV-2病毒S蛋白的单链抗体及其用途

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Asp Pro Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Asn Val Gly Thr Asn

1 5

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Trp Ala Ser

1

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Met Tyr Thr

1 5 10

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Phe Thr Ala Thr Phe Ala Met Asp Tyr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Asp Val Gly Thr Ala

1 5

<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Trp Ala Ser

1

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Gln Tyr Ser Ile Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Asp Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Thr

115

<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Thr Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu

65 70 75 80

Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Met

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Leu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Phe Thr Ala Thr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Thr

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaggtgaagc tgctggagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtaa tactatatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccagtata acagcagaca catcctccaa cacagcctat 240

atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagaggaggg 300

gggtatgatc cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt gtcgaca 357

<210> 18

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acggtgatga cccagtctca aaaattcatg tccacatcag taggagacag ggtcagcgtc 60

acctgcaagg ccagtcagaa tgtgggtact aatgtagcct ggtatcaaca gaaaccaggg 120

caatctccta aactactgat ttactgggca tccacccggc acactggagt ccctgatcgc 180

ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca ttagcaatgt gcagtctgaa 240

gacttggcag agtatttctg tcagcaatat aacagctatc cgtacatgta cacgttcgga 300

ggggggacca agctggaaat caag 324

<210> 19

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaggtgaagc tgcagcagtc tgggggaggc ttactgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60

tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggaaagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aacggaaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgttt tacggctacg 300

tttgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tgtcgaca 348

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacgtcgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcatct atccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatcaa g 321

<210> 21

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc gatgtgaagc ttcaggagtc 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc caggtgcagc tgaaggagtc 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc caggtgcagc tgaagcagtc 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc caggttactc tgaaagagtc 50

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<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc gaggtccagc tgcaacaatc t 51

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc gaggtccagc tgcagcagtc 50

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<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc caggtccaac tgcagcagcc t 51

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc gaggtgaagc tggtggagtc 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc gaggtgaagc tggtggaatc 50

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc gatgtgaact tggaagtgtc 50

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<212> DNA

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tgaaccgcct ccacctgcag agacagtgac cagagt 36

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgaaccgcct ccacctgagg agactgtgag agtggt 36

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgaaccgcct ccacctgagg agacggtgac tgaggt 36

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<211> 36

<212> DNA

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tgaaccgcct ccacctgagg agacggtgac cgtggt 36

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tctggcggtg gcggatcgga tgttttgatg acccaaact 39

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tctggcggtg gcggatcgga tattgtgata acccag 36

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgagttttt gttctgcggc cgcccgtttc agctccagct tg 42

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgagttttt gttctgcggc cgcccgtttt atttccagct tggt 44

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<212> DNA

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atgagttttt gttctgcggc cgcccgtttt atttccaact ttg 43

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<211> 44

<212> DNA

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atgagttttt gttctgcggc cgcggataca gttggtgcag catc 44