一种基于针状电极的植物水杨酸原位实时检测方法
阅读说明：本技术 一种基于针状电极的植物水杨酸原位实时检测方法 (Needle electrode-based plant salicylic acid in-situ real-time detection method ) 是由 孙利军 姚登兵 张亚莉 霍逗逗 李道东 田一然 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于针状电极的植物水杨酸原位实时检测方法,所述检测方法是由针状电极构成的三电极体系对接种PstDC3000后番茄侧茎中水杨酸进行原位实时检测；所述针状电极直径为0.1 mm,其中针状工作电极经液体碳胶和多壁碳纳米管修饰。本发明构建的检测SA针状电极体系,不仅有效地减小检测过程对植物体的损伤,而且可以实现植物体SA的原位实时检测,为研究SA在植物抗病和抗逆中作用机制深入研究提供新的研究策略,具有重要的理论和实践意义。(The invention discloses a needle electrode-based plant salicylic acid in-situ real-time detection method, which is characterized in that a three-electrode system consisting of needle electrodes is used for inoculation Pst Carrying out in-situ real-time detection on salicylic acid in lateral stems of tomatoes after DC 3000; the diameter of the needle-shaped electrode is 0.1mm, wherein the needle-shaped working electrode is modified by liquid carbon glue and a multi-walled carbon nano tube. The needle electrode system for detecting SA constructed by the invention not only effectively reduces the damage to the plant body in the detection process, but also can realize the in-situ real-time detection of the plant body SA, provides a new research strategy for the deep research of the action mechanism of the SA in the disease resistance and stress resistance of the plant, and has important theoretical and practical significance.)
技术领域
本发明涉及一种生物检测方法，具体涉及一种基于针状电极的植物水杨酸原位实时检测方法。
背景技术
植物水杨酸是植物中重要的内源激素，其在植物中含量极微，但对植物的抗病行为具有极为重要的调节功能。水杨酸（SA）是植物体内普遍存在的具有酚类结构的一种小分子化合物，植物先天免疫和系统获得性免疫的形成都需要 SA 的参与。目前研究表明SA 的功能是由它在植物体内的相对浓度决定，因此确定SA在植物体内的浓度分布及其动态变化，是理解水杨酸调控植物抗病和抗逆的关键问题之一。
水杨酸的检测方法目前较多采用气质联用或液质联用等技术进行，上述方法的主要局限在于检测前需要复杂耗时的样品前处理，其原因是植物组织与细胞需要进行冷冻破碎以及样品抽提和纯化。由于水杨酸为易于发生氧化还原反应的小分子，复杂的样品处理过程会导致水杨酸小分子的损失，使得其浓度降低，检测限难以进一步提高。更为重要的是，复杂的样品处理过程一般需要使用较多量的植物样品，且需要较长的时间，难以真实再现水杨酸原位实时的浓度，研究人员难以获得准确及时的信息，致使 SA 在植物体内的形成及传导过程，以及其在植物抗病机制中的作用研究难以深入进行。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于针状电极的植物SA原位实时检测方法，通过制备针状工作电极并对番茄侧茎中水杨酸进行原位实时检测。
本发明的技术解决方案：一种基于针状电极的植物水杨酸原位实时检测方法，该方法由经液体碳胶和多壁碳纳米管修饰的针状电极构成的三电极体系对接种PstDC3000后番茄侧茎中水杨酸进行原位实时检测，该方法具体包括以下步骤：
S1：通过液体碳胶和多壁碳纳米管对硬质铂丝进行修饰，并优化电极的工作面积，构建出纳米材料修饰的针状工作电极：将直径0.1 mm的硬质铂丝浸入乙醇和蒸馏水中，超声处理10min，晾干；将晾干的铂丝插入直径0.3mm的毛细管中，一端露出2mm，用3M超能胶将电极两端固定；用铜导电胶带包裹铂丝的另一端；将电极露出2mm的一端依次浸入体积分数为50%的液体碳胶和体积分数为0.5%的多壁碳溶液10min，晾干即可使用。
S2：构建经步骤S1纳米材料修饰的针状工作电极为工作电极，铂丝电极为对电极（将直径0.1 mm的硬质铂丝浸入乙醇和蒸馏水中，超声处理10min，晾干；将晾干的铂丝插入直径0.3mm的毛细管中，一端露出2mm，用3M超能胶将电极两端固定；用铜导电胶带包裹铂丝的另一端，即可使用），和Ag/AgCl银丝电极为参比电极（将直径0.1 mm的银丝浸入乙醇和蒸馏水中，超声处理10min，晾干；将晾干的银丝放入84消毒液中直至完全变黑，使其成为Ag/AgCl参比电极；将变黑的Ag/AgCl参比电极插入直径0.3mm的毛细管中，一端露出2mm，用3M超能胶将电极两端固定；用铜导电胶带包裹电极的另一端，即可使用）的三电极集成模式针状电极检测体系。
S3：将步骤S2构建的针状电极检测体系与单通道电化学工作站相连接，检测不同浓度SA标准品溶液，获得检测SA标准曲线：首先配制10mM的SA溶液，再使用缓冲溶液进行稀释，制备SA溶液的浓度依次为0.1、1、3、5、10、30μM；所述缓冲溶液是0.2M，pH 7.5的PBS溶液，其配制方法为：依次配制0.2mol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液，将K2HPO4溶液KH2PO4溶液进行混合，调节pH至7.5；测得其检测关系函数为Y＝0.836X+1.904；Y代表电流，单位为μA；X代表SA的浓度，单位为μmol/L。
S4：将经过步骤S3检测的针状电极检测体系插入番茄侧茎内，并与单通道电化学工作站相连接，对番茄侧茎中SA进行原位实时检测：制备番茄细菌性叶斑病PstDC3000浸染液，将其喷洒在培养好的番茄植株上为实验组，以直接喷洒相同体积的MgCl2缓冲液到番茄植株为对照组，实验组和对照组各为3~4株番茄，分别放入两个不同的透明收纳盒中保湿培养；将培养好的番茄植株用直径为0.4mm的不锈钢针在其侧茎上取3个点，将构建的针状电极检测体系插入番茄侧茎内，并与电化学工作站相连接，采用DPV的方法检测出SA的电流值；根据所述标准曲线的关系函数计算得到植物水杨酸的浓度。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）采用直径0.1mm的针状电极集成在番茄侧茎组织部位，有效地减小检测过程对植物体的损伤；
2）实现植物体内SA的原位实时检测，为研究SA在植物生长发育中作用机制深入研究提供新的研究策略，具有重要的理论和实践意义；
3）针状工作电极的制备工艺简单，耗时少，检测过程操作简单，灵敏度高，检测结果更加准确。
附图说明
图1为本发明实施例1中针状工作电极的流程制备图。
图2A、2B为本发明实施例2中为本发明实施例2中检测SA标准品溶液的DPV曲线图及标准曲线图。
图3为本发明实施例3中针状电极原位检测番茄侧茎内SA的实物检测图。
具体实施方式
下面根据多个实施例进一步说明本发明的技术方案。在本说明书的描述中，各实施例的内容意指结合其描述的具体技术特征包含于本发明的至少一个实施方式中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体技术特征可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
实施例1
针状工作电极的制备方法，其构建流程图如图1所示，具体包括以下步骤：
1. 将硬质铂丝（r=0.1mm）剪取5cm，放入烧杯中，依次往烧杯中倒入乙醇和蒸馏水进行10min超声浸泡处理；将超声处理的铂丝放置于室温下晾干；将晾干的铂丝取出，截取3.5~4cm毛细管（r=0.3mm），将铂丝放入毛细管，一端为2 mm，另一端为8~13 mm，用3M超能胶将电极两端固定，晾干；用铜导电胶带包裹8~13mm的一端。
2. 将20μL 体积分数为50%的液体碳胶放入200μL离心管中，然后取出带有铜导电胶带的针状电极，将其2mm的一端放入该200μL离心管中浸泡10min，晾干；将1mL体积分数为0.5%的多壁碳溶液放入2mL离心管中，然后将经液体碳胶修饰的针状电极放入该2mL离心管中浸泡10min，晾干。
经液体碳胶和多壁碳纳米管浸泡修饰的针状工作电极能吸附待检测液中的SA，导致电极表面的电子传递速率下降，电化学工作站检测到的传感器工作电极表面的电流峰值降低，且在一定SA浓度范围内呈线性关系。
3. 构建经液体碳胶和多壁碳纳米管浸泡修饰的针状工作电极、铂丝电极和Ag/AgCl参比电极的三电极集成模式体系，与单通道电化学工作站相接，其传感头浸入含有水杨酸的溶液体系。
实施例2
SA标准品溶液的检测过程，包括以下步骤：
1. 标准品溶液的配制方法为：首先配制10mM的SA溶液，再使用缓冲溶液进行稀释，制备SA溶液的浓度依次为0.1、1、3、5、10、30μM。其中，缓冲溶液是0.2M，PH 7的PBS溶液，其配制方法为：依次配制0.2mol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液，将K2HPO4溶液KH2PO4溶液进行混合，调节PH至7。
2. 标准曲线的制备：采用DPV的方法得到不同浓度SA的电流峰值，基于电流(μA)与不同浓度SA(μmol/L)的关系，绘制的SA浓度标准曲线(图2B)，电流(Y)与SA浓度(X)在0.1-30μM范围内呈线性关系，回归方程为Y＝0.836X+1.904，R2＝0 .9933；检测限为0.1μM。本发明的检测限低至0.1μM，这说明该检测方法能够定量检测SA的范围较广且检测灵敏度比较高。
实施例3
植物水杨酸的检测，包括以下步骤：
1. 制备番茄细菌性叶斑病（PstDC3000）浸染液，将其喷洒在培养好的番茄植株上为实验组，以直接喷洒相同体积的MgCl2缓冲液到番茄植株为对照组，实验组和对照组各为3~4株番茄，分别放入两个不同的透明收纳盒中保湿培养；将培养好的番茄植株用不锈钢针（r=0.4mm）在其侧茎上取3个点。
2. 将构建的三电极检测体系插入番茄侧茎内，并与电化学工作站相连接，采用DPV的方法检测出SA的电流值；根据所述标准曲线的关系函数计算得到植物水杨酸的浓度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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