阅读说明：本技术 超敏蛋白在提高茶树叶片儿茶素和氨基酸含量上的应用 (Application of hypersensitive protein in improving content of theanine and amino acid in tea leaves ) 是由 李荣林 杨亦扬 万青 *** 李欢 艾则宜 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了超敏蛋白在提高茶树叶片儿茶素和氨基酸含量上的应用,特别地,超敏蛋白可以使酯型儿茶素EGCG比例增加,且同时提高茶树叶片儿茶素总量和氨基酸含量。本发明对于茶树鲜叶品质调控具有重要的意义。(The invention discloses application of a hypersensitivity protein in improving the content of tea leaf catechin and amino acid, in particular, the hypersensitivity protein can increase the proportion of ester catechin EGCG and simultaneously improve the total amount of the tea leaf catechin and the content of the amino acid. The invention has important significance for regulating and controlling the quality of the fresh tea leaves.)

超敏蛋白在提高茶树叶片儿茶素和氨基酸含量上的应用

技术领域

本发明属于茶叶生产领域，具体涉及超敏蛋白在提高茶树叶片儿茶素和氨基酸含量上的应用。

背景技术

儿茶素是茶叶中最重要的物质组分，它是茶叶成为一种美味饮料的主要物质基础，是茶叶呈现微苦涩而又具有爽利感觉的主要物质基础。儿茶素的酶促或非酶促氧化的精细控制是茶叶加工工艺制定的关键性参考条件。儿茶素在茶树抵御病虫危害的过程中也发挥着重要作用。儿茶素是茶叶呈现保健作用的关键物质，大量研究证明茶叶的抗氧化能力、抗癌、抗突变能力，预防心脑血管疾病的能力都与儿茶素有密切关系。

氨基酸是茶叶鲜爽味的主要物质基础，氨基酸与茶叶香气形成有极大的关联性，氨基酸又是茶树生长的必须物质基础。酚氨比值是茶树鲜叶适制性的主要参考条件。氨基酸是人类所需的主要营养素之一，因此与茶叶的饮用价值和保健价值有密切关系。茶氨酸是茶叶中含量最多作用最重要的一种氨基酸，它是茶树氮代谢的基础，它是茶叶鲜爽味的主要贡献者。茶氨酸还具有调节神经功能，促进脂质代谢的重要作用。

基于以上所述，在茶树品种选育过程中，筛选同时具有高含量儿茶素和氨基酸含量具有重要意义。茶树叶片中儿茶素含量一般在6％-8％，氨基酸含量0.5％-0.8％(鲜重)，具体含量水平与品种，季节等有关。在茶树体内儿茶素合成为主的C代谢与蛋白氨基酸合成的N代谢存在竞争作用，常规条件下很难得到兼有较高含量儿茶素和较高含量氨基酸的鲜叶。

利用植物刺激素调控植物生长和次生代谢的方法已得到广泛的关注，例如水杨酸或茉莉酸可以调节萜类物质的合成，增加其含量，油菜素内酯可以提高叶片氨基酸含量，提高作物生长能力。又如苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)和β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid，BABA)可以提高茶树多酚氧化酶和过氧化物酶的活性。

本专利所用超敏蛋白是一种从梨火疫病细菌蛋白中提取的蛋白激发子—HarpinEa，将其喷洒在植物表面以后便与植物表面的信号接受器(受体)接触，给植物一个模拟病原物攻击信号，随即通过信息传递，引起多种基因的表达，几分钟内便可激活植物体内多种防卫系统获得抗性，30分钟后，植株就表现出对病原物的抗性反应，同时，通过茉莉酸、乙烯信号的传递，促进植物的生理生化活动，但目前尚无公开研究报道超敏蛋白对茶树叶中儿茶素和氨基酸含量的影响。

发明内容

发明目的：本发明研究发现，当在茶树上在适当使用超敏蛋白(Harpin)时，促进茶树的生理生化特性产生了明显有利的反应，可以同时提高茶树叶片中儿茶素总量和氨基酸含量，因此提出了超敏蛋白在同时提高提高茶树叶片儿茶素和氨基酸含量上的应用。

本发明发现，将超敏蛋白用于茶树上使酯型儿茶素EGCG比例增加。

优选地，所述超敏蛋白为由梨火疫病细菌(Erwinia amylovora)基因hrp N编码的蛋白。

具体地，通过将超敏蛋白配置成溶液后以灌根、涂抹、喷雾方式作用于茶树。

优选地，所述超敏蛋白溶液浓度为50mg/L-1000mg/L。

超敏蛋白原粉的用量为每亩5-100g。

在一个优选的实施方式中，通过如下方法提高茶树叶片儿茶素和氨基酸的含量：

1)将超敏蛋白用水溶解，配制成1000mg/L的贮备溶液，再用水稀释到所需要的浓度，在茶树生长季节(长江流域为每年的3月至10月)对茶树进行灌根、涂抹、喷雾处理；

2)在第1次使用超敏蛋白(harpin)后，间隔48h，再次使用1000mg/L的超敏蛋白贮备液，以水稀释到所需要的浓度，对茶树进行第2次灌根、涂抹或喷雾处理；

3)第2次使用超敏蛋白(harpin)24h后采样分析。根据采样分析的结果可以决定是否需要继续进行处理。

有益效果：

通过试验研究发现，当在茶树上在适当使用超敏蛋白(Harpin)时，促进茶树的生理生化特性产生了明显有利的反应，经测试50mg/L-1000mg/L的超敏蛋白用于茶树后，不仅可使茶鲜叶组织中PPO、POD活性显著增加，而且发现氨基酸和儿茶素同时出现了显著增加的趋势。

具体实施方式

：

儿茶素、没食子酸测定采用HPLC法。取磨细样品1g,加10mL甲醇溶液(含0.1％甲酸)，浸提2h,4000g离心，上清液备用。取上清液1mL,过微孔滤膜，HPLC定量。色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A：乙腈∶乙酸∶水＝6∶1∶193(体积比)，流动相B:乙腈∶乙酸∶水＝60∶1∶139(体积比)，洗脱梯度：B相初始浓度20％，35min内线性上升至65％后立即降至20％，保持5min，至40min时结束，流速1mL·min^-1，柱温25℃，检测波长280nm，进样量10μL。

游离氨基酸总量测定采用茚三酮比色法。取磨细样品1g,加10mL甲醇溶液(含0.1％甲酸)，浸提2h,4000g离心，上清液备用。取1mL上清液，加0.5mLpH8.0磷酸缓冲液，0.5mL 2％茚三酮溶液，沸水浴加热15min,冷却后加水定容至25mL,静置10min，于570nm处比色。以谷氨酸作为标准品进行定量。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中，超敏蛋白(Harpin)购买自湖南农大哥科技开发有限公司，产品批准号为HNP32153-E0594，产品标准号为Q/3201SKSH007-2007.

下述实施例中，在茶树生长季节3月-10月用超敏蛋白溶液对茶树进行灌根、涂抹、喷雾处理。

(1)4月15日早晨，以75mg/L的超敏蛋白溶液喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。4月16日晨以75mg/L的超敏蛋白溶液再次喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。4月17日取样测试，结果如表1所示，儿茶素总量11.87％(鲜重)，比对照增加了76.41％，氨基酸总量1.09％(鲜重)，比对照增加了29.76％。

表1

(2)6月10日傍晚，以200mg/L的超敏蛋白溶液喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。6月11日傍晚，以200mg/L的超敏蛋白溶液再次喷施茶树，毎亩用液量100升。对照区喷清水。24h后取样测试，结果如表2所示，儿茶素总量12.95％(鲜重)，增加了134.34％，氨基酸总量1.10(鲜重)，增加了65.66％。

表2

(3)6月20日，以50mg/L的超敏蛋白溶液喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。24h后以100mg/L的超敏蛋白溶液再次喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。又过24h取样测试，结果如表3所示，儿茶素总量13.29％(鲜重)，增加了132.54％，氨基酸总量1.18％(鲜重)增加了52.25％。

表3

(4)7月1日，以300mg/L超敏蛋白溶液喷施茶树，毎亩用液量45升，24h后以100mg/L的超敏蛋白溶液再次喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。又过24h取样分析，结果如表4所示，儿茶素总量13.02％(鲜重)较对照增加了139.93％。氨基酸总量1.18％(鲜重)较对照增加了69.59％。

表4

(5)8月5日，以300mg/L超敏蛋白溶液喷施茶树，毎亩用液量45升，24h后以100mg/L的超敏蛋白溶液再次喷施茶树，毎亩用液量45升。对照区喷清水。又过24h取样分析，结果如表5所示，儿茶素总量14.69％增加了96.57％，氨基酸总量0.96％增加了41.18％。

表5

综上所述，当在茶树上在适当使用超敏蛋白(Harpin)时，促进茶树的生理生化特性产生了明显有利的反应，经测试50mg/L-1000mg/L的超敏蛋白用于茶树后，不仅可使茶鲜叶组织中PPO、POD活性显著增加，而且发现氨基酸和儿茶素同时出现了显著增加的趋势。本发明对于茶树鲜叶质量调控具有重要的意义。