碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂及其应用
阅读说明：本技术 碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂及其应用 (Alkaline metalloprotease, preparation containing the same and application thereof ) 是由 王杰 王凤龙 江连强 秦元霞 刘东阳 杨金广 凌爱芬 申莉莉 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂在防治烟草花叶病毒中的应用,调节所述碱性金属蛋白酶的pH至8.0-9.0,所述碱性金属蛋白酶取自黏质沙雷氏菌。该制剂性质稳定,通过对寄主植物和对病毒两个方面起作用,具有良好抗病毒效果,并且对环境友好。(The invention discloses an alkaline metalloprotease and an application of a preparation containing the alkaline metalloprotease in preventing and treating tobacco mosaic virus, wherein the pH of the alkaline metalloprotease is adjusted to 8.0-9.0, and the alkaline metalloprotease is taken from serratia marcescens. The preparation has stable property, has good antiviral effect by acting on host plants and viruses, and is environment-friendly.)
技术领域
本发明涉及农药技术领域，尤其涉及碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂在防治烟草花叶病毒中的应用。
背景技术
烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病等的病原体，具有广泛的寄主范围，可侵染十字花科、茄科和葫芦科等至少9个科125种植物，其发生频率高、流行快、为害重、难治理，一旦植物染病，无法得到有效的控制，极易引发病毒病的流行，造成严重的经济损失。每年因TMV造成的经济损失高达数十亿美元。目前在病毒病害治理中主要采用抗病毒品种的选育、传毒媒介防控及交叉保护等方式，而针对植物病毒病的有效化学农药种类少，亟待农业科研人员去解决。
黏质沙雷氏菌是一种在自然生境中广泛存在的革兰氏阴性细菌，在土壤、水等环境中都可以生存。在土壤中，有些菌株是植物根际促生菌，例如，自土壤中分离得到的Serratia marcescens-90-166可以通过群体感应机制诱导植物产生系统抗性，并能提高植物对包括黄瓜花叶病毒在内的几种植物病原体的侵染。此外，黏质沙雷氏菌还能产生多种胞外酶，包括丝胶酶、几丁质酶、金属蛋白酶、脂肪酶、硫醇蛋白酶和核酸酶等。黏质沙雷氏菌属胞外蛋白在医药、工业等领域都有研究应用，但在农业方面研究极少，而且市场上也没有相关产品的应用。
因此，针对上述问题，有必要提出进一步地解决方案。
发明内容
本发明旨在提供碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂在防治烟草花叶病毒中的应用，以克服现有技术中存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
碱性金属蛋白酶在防治烟草花叶病毒中的应用。
优选地，所述碱性金属蛋白酶取自黏质沙雷氏菌。
优选地，所述碱性金属蛋白酶的质量为45-55kDa。
优选地，所述碱性金属蛋白酶的质量为50kDa。
优选地，调节所述碱性金属蛋白酶的pH至8.0-9.0。
本发明还公布了一种含碱性金属蛋白酶的制剂，所述制剂的有效成分为碱性金属蛋白酶，以及植物生长调节剂和/或稳定剂。
优选地，调节所述碱性金属蛋白酶的pH至8.0-9.0。
优选地，所述制剂中碱性金属蛋白酶的浓度为80-120μg/mL。
优选地，所述植物生长调节剂为氨基寡糖素，
优选地，所述稳定剂为海藻糖。
本发明还公布了一种含碱性金属蛋白酶的制剂在防治烟草花叶病毒中的应用。
优选地，将所述含碱性金属蛋白酶的制剂加热至40-50℃后喷洒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂在防治烟草花叶病毒中的应用，其性质稳定，通过对寄主植物和对病毒两个方面起作用，具有良好抗病毒效果，并且对环境友好。
附图说明
图1为抗TMV菌株的16SrRNA片段琼脂糖凝胶电泳图；
图2为黏质沙雷氏菌菌株形态特征、抗TMV效果及系统进化树，其中，a:半叶法显示S3对TMV的抑制效果；b:菌落形态；c:S3电镜图片；d:利用Clustal W方法分析得到的S3的16S序列的系统进化树，标尺：5％；
图3为S3菌株发酵上清的催芽效果；
图4为S3菌株发酵上清的促生效果；
图5为S3菌株在叶片和土壤中的存活情况；
图6为络氨酸标准曲线图；
图7为酸碱度对SAMP酶活力和酶稳定性的影响；
图8为温度对SAMP酶活力和酶稳定性的影响；
图9为不同浓度SAMP对TMV的抑制效果；
图10为在本氏烟叶片内SAMP对TMV的抑制效果。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本实施例中所用植物材料为TMV的枯斑寄主三生烟(Nicotiana.tabacumcv.SunsamNN)，由本申请人留种繁殖，培养于温室中。植物培养条件：光照16h，温度25±1℃，光照强度2000lux，相对湿度60％；黑暗时长8h，温度25±1℃，相对湿度60％。所用营养基质由山东省寿光市沃德营养土加工厂生产，植物生长期间无需额外施肥。
TMV毒源采集于山东省青岛市，并于温室中栽培的普通烟草NC89上繁殖保存。
将黏质沙雷氏菌接种到含有利福平的培养基平板上培养，利福平的浓度从低至高(50-250μmol/mL)慢慢增加，最终通过梯度筛选得到对250μmol/mL利福平具有抗性的黏质沙雷氏菌。
将带有利福平抗性的黏质沙雷氏菌过夜振荡培养(28℃，120rpm)平均分为3份，其中两份分别与自然土样和灭菌的土样混匀，另一份喷洒到K326烟草的叶片上。
处理后当天开始取样，每个样品各取1g，用灭菌的生理盐水浸泡混匀，取上清，梯度稀释，然后涂布在含有250μmol/mL利福平的平板上统计菌落数。
取3mL黏质沙雷氏菌的发酵上清，离心(6000g,10min)，弃沉淀，上清用0.22μm的过滤器除菌，与去离子水按1:10的比例混合液，然后加入到向直径9cm的平皿中，不加发酵上清的去离子水作为对照。在平皿内铺一层滤纸，然后点种。每皿点播约100粒本氏烟种子，每处理设置4个重复。播种完成后用封口膜密封平皿，将平皿小心转移至光照培养箱内，25℃培养6-9d，统计发芽率并称重，计算百芽鲜重。
向培养盒中加入500mL霍格兰氏营养液及20mL发酵上清(离心并过滤除菌)，混匀。取长势一致的四叶期K326幼苗，用清水清洗根部，洗去根土然后***培养孔中进行培养；分别以不加上清的霍格兰培养液、加入LB培养基的霍格兰培养液为对照。每组处理8株幼苗，3次重复。放入光照培养箱培养，培养14d(25℃，光照时长16h)，取出称量植株鲜重。培养期间每日向培养盒中添加10mL去离子水。
黏质沙雷氏菌对TMV的抑制率达到100％。
黏质沙雷氏菌，记为S3，分离自烟草根际土壤，(1)：低浓度的S3发酵液可以促进萌芽。实验使用的烟草种子为K326品种，实验结果表明当S3发酵液与水按1：10的比例混匀后，有利于烟草种子的萌发，与对照相比，用S3发酵液处理后种子萌发更快，而且萌发后，芽长势更好。(2)：当S3发酵液与霍格兰水培液以1：25的比例混合时，可以明显促进烟苗的生长。与对照相比，培养液中加入S3发酵液后，烟苗的叶片长势好。
S3菌株作为根际促生微生物，良好的定殖能力是应用开发中的重要指标。试验结果表明施用S3后，其活菌株种群数量在叶片和土壤中随着时间推移呈下降趋势，随着时间推移，S3总体在叶片、土壤中的存活率都有所下降，但在土壤中的定殖能力显著高于叶片。处理3天后，在叶片和自然土壤中S3的菌落数都明显减少，叶片上的减少幅度显著大于其它两个处理，而在无菌土中S.marcescens-S3的菌落数反而有小幅的上升；处理后第8天在叶片、自然土和灭菌土三个处理的样品中S3的菌落数都减少至3×106CFU/g左右；处理后第30天，叶片中S3仅为40CFU/g，自然土中约为4000CFU/g，而无菌土中还保持在9×105CFU/g左右。通过室内定殖实验我们发现，S3在土壤和叶片上均具有一定的植能力。
采用硫酸铵沉淀的方法制备黏质沙雷氏菌液总蛋白的粗提液，用Q SephacrylFast Flow分离其总蛋白，洗脱条件如下：
每个浓度的洗脱液洗脱1个柱体积，收集各洗脱产物并用截留分子量为3000的Millipore超滤管脱盐、浓缩然后用“半叶法”检测洗脱蛋白对TMV的活性。
用Sephacryl S100 HR分离具有抗TMV活性的蛋白组分，将洗脱得到的具有抗TMV活性的蛋白全部集中到一起，浓缩后上样至Sephacryl S100 HR柱上。然后用洗脱液(PBS,10mmol/L,pH为7.2)清洗。
色谱条件如下：
收集各洗脱峰，用Millipore截留分子量为3000的超滤管浓缩，用“半叶法”测定每个收集部分对TMV的抑制效果。
通过阴离子交色谱(Q Sephacryl Fast Flow)和排阻色谱(Sephacryl S100 HR)分离结合生物活性(“半叶法”)实验，从黏质沙雷氏菌S3菌株(S.marcescens-S3)的分泌蛋白中分离得到了一种对TMV病毒具有显著钝化活性的蛋白，分子量大小约为50kDa。经串联质谱分析，鉴定该蛋白为碱性金属蛋白酶(Secreted Alkaline Metalloprotease,SAMP)，具有很高的酶活力。
沙雷氏菌分泌的碱性金属蛋白酶是多种革兰氏阴性菌分泌的serralysin蛋白的典型代表：它具有一个锌离子催化结构域，属于锌指蛋白；锌离子结合部位氨基酸序列“HEXXHXXGXXH”，其中三个组氨酸(H)为锌离子结合部位，中间的谷氨酸(G)为催化部位，“X”可以是任意的氨基酸；在第333-374个氨基酸残基之间存在多个“GGXGXD”序列，为钙离子结合部位。
用福林法测定碱性金属蛋白酶的酶活性质。
1标准曲线
取8支试管，按照下表配置标准络氨酸溶液
将稀释后的络氨酸溶液混匀后各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液、1mL福林-酚试剂，置于40℃水浴锅中反应20min，取出后用酶标仪检测OD680 nm值，绘制标准曲线(图6)。
2酶活性测定
取一个5mL离心管，加入100μL酶液，置于40℃水浴锅中预热2-3min，然后加入100μL 40℃预热的酪蛋白(2％)，40℃水浴锅中反应10min(准确计时)。取出，立即加入200μL0.4mol/L三氯乙酸溶液，终止酶反应。10min后离心(8000×g，10min)，取200μL上清液加入1mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，然后加入200μL福林-酚试剂，混匀后置于40℃水浴锅中反应20min。
空白对照：取一个5mL离心管，加入100μL酶液，加入200μL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加入100μL 40℃预热的酪蛋白(2％)。10min后离心(8000×g，10min)，取200μL上清液加入1mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，然后加入200μL福林-酚试剂，混匀后置于40℃水浴锅中反应20min。
3)计算：每1min水解酪蛋白产生1μg络氨酸计为1个酶活力单位。
3pH及温度对重组SAMP酶活的影响
1)pH对酶活力及酶稳定性的影响
用不同酸碱度的缓冲液调整SAMP溶液的pH值，然后按照上述方法测定酶活力。
将SAMP分别加入到不同pH值(3.0-11.0)的缓冲液中，保持10min。反应结束后，取出将pH调至最佳反应pH，然后测定SAMP的残余酶活力。
2)温度对pH对酶活力及酶稳定性的影响
采用福林-酚方法，以酪蛋白为底物测定SAMP酶活力的方法，在pH为8.0的条件下设置不同的反应温度(30、40、50、60、70、80和90℃)，分别测定温度对SAMP的酶活力的影响。
在将pH为8.0时，将SAMP分别置于不同温度的条件下(30、40、50、60、70、80和90℃)分别保持10min，反应结束后用福林-酚方法，以酪蛋白为底物测定剩余的酶活力。
SAMP对TMV的防治效果
1病毒接种液的制备
病毒粒体的提取及病毒接种液的制备：采用Gooding&Helbert(1967)方法并稍作改进制备TMV溶液。取系统侵染烟草花叶病毒的NC89上部新叶，用10mmol/L的PBS缓冲液(pH7.4)研磨、匀浆；然后用双层纱布过滤，并离心(1000×g，20min)；取上清，用聚乙二醇的处理两次。再次离心(10000×g，30min)后；沉淀用10mmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)重悬，即得到TMV接种液。整个操作需要在4℃条件下进行，然后用分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。
病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％ 1cm260 nm
注：E为消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液在光程为1crn时的光吸收(光密度)值。TMV的E0.1％ 1cm260nm为3.1，病毒母液浓度为10μg/mL。
2叶盘法检测SAMP对TMV的抑制效果
用TMV 30B(带有GFP标签的TMV株系)检测SAMP对TMV的抑制效果。
1)将TMV 30B侵染性克隆通过农杆菌浸润的方法接种于4周龄的本氏烟(N.Benthamiana)植株上，叶片切成直径0.5cm的圆盘状。
2)将切好的叶盘放入24孔板中，每孔加入不容浓度的SAMP溶液(用MS培养基稀释为6.5、12.5、50和100μg/mL浓度梯度)，每个浓度重复3次，每个处理加入3个叶盘。
3)将24孔板密封后置于25℃，黑暗培养5d。
4)用多光谱荧光成像系统(FluorCam 7.0)检测绿色荧光的强度，从荧光强度可以指示TMV 30B的发生程度。
6.1.3.2 SAMP干扰TMV在植物体内增殖、扩散
取100μL TMV 30侵染性克隆农杆菌悬浮液，浸润到4周的本氏烟(N.benthamiana)植株的叶片上形成叶形成一个直径1厘米的圆形浸润区。
48h后在TMV 30B区周围浸润一圈SAMP。每隔24h可以用紫外探照灯观察叶片上的荧光情况，绿色荧光的强度和和扩散可以指示TMV病毒的发生和扩散情况。对照组采用PBS缓冲液(10mmol/L,pH＝7.0)处理。
3碱性金属蛋白酶对TMV的保护和治疗效果
用“半叶法”测定纯化后的SAMP对TMV的预防和治疗效果试验。分别以宁南霉素(NNM)和BSA为阳性对照和阴性对照。
1)首先，将TMV接种液稀释到1μg/mL，SAMP稀释为不同浓度(6.5、12.5、50和100μg/mL)。
2)预防效果实验：取50μL SAMP稀释液，涂抹在实验烟草叶片的右半叶，左半片叶片涂抹PBS缓冲液(10mmol/L,pH＝7.0)；1h后在实验烟草叶片上接种20μL烟草花叶病毒接种液(TMV浓度为1μg/mL)。
3)SAMP对TMV的治疗作用实验：用石英砂在实验叶片上摩擦接种20μL(1μg/mL)的烟草花叶病毒接种液，然后用水清洗、自然晾干。6小时后接种50μL在接种TMV的叶片的有半片叶上接种50μL不同浓度的SAMP稀释液，左半边叶片上用同样体积的和PBS缓冲液(10mmol/L,pH＝7.0)进行处理。
酶活试验表明，色谱分离得到的单一蛋白组分具有很强的金属蛋白酶活性；当反应缓冲液pH值为8.0-9.0时，酶活值最高；当反应温度达到40-50℃时酶活力最高。酶对酸碱度的稳定性实验证明，当反应溶液的酸碱度低于5.0时，碱性金属蛋白酶(SAMP)的酶活性能降低到原来的40％左右；而在碱性条件下(pH＞7.0)，SAMP的酶活性能比较稳定，保持在70％以上。热稳定性实验表明：当实验温度为30-50℃时，SAMP活性相对稳定，保持在80％以上；当温度高于50℃时(60-70℃)，SAMP的酶活性迅速下降至20％左右，当温度继续上升至80℃及以上时，酶活力又恢复到40％左右，说明SAMP具有一定的热稳定性。
通过“半叶法”检测SAMP对TMV的抑制效果，结果表明，SAMP对TMV具有良好的抑制效果，当SAMP浓度为50μg/mL时，对TMV的抑制效果可达到100％，当SAMP浓度降低至6.5μg/mL时，对TMV的抑制效果依然保持在75％以上。
本实验通过阴离子交换色谱(Q Sephacryl FF)和排阻色谱(Sephacryl S100 HR)等色谱分析方法，结合生物活性(“半叶法”)实验，从S.marcescensstrain-S3的胞外蛋白中分离得到对TMV病毒具有良好抑制效果的活性蛋白，SDS-PAGE检测，呈现明显且单一的蛋白条带，大小约为50kDa左右。通过串联质谱(MS/MS)方法进行分析鉴定(Katayama et al.,2010；Su et al.,2015)，结果表明，S.marcescens-S3的抗TMV蛋白与分泌性金属蛋白酶(Protein View No.wP_015377659.1)有7条肽段相匹配，其中肽段“DTFVYFAAEESTAAAPDWIR”是金属蛋白酶特有序列，两者相似度达到84％。由串联质谱分析结果，初步判定S.marcescens-S3中分离的抗TMV活性蛋白为碱性金属蛋白酶(SAMP)，并通过生物信息学分析了其结构，证明SAMP具有水解结构域。
酶活性实验表明SAMP具有很高的金属蛋白酶的活性，在pH值为8.0-9.0、温度为40-50℃时酶活力最高，并具有一定的热稳定性。通过半叶法验证了SAMP的抗TMV活性，结果表明通过Q Sephacryl FF、Sephacryl S100 HR色谱分离获得的SAMP具有良好的抗TMV活性。叶盘法证实了SAMP可以被叶片吸收，在细胞内抑制TMV的增殖；通过浸润SAMP的方法，证明了SAMP在植物叶片内可以有效的抑制TMV病毒从侵染部位向其它健康部位的扩散和远距离转运；以三生烟为材料通过计数枯斑，验证了SAMP蛋白对TMV病毒病既具有良好的预防效果，也具有一定的治疗作用。综上所述，SAMP具备农业生产中抗TMV药剂开发应用的潜力。
申请人进一步研制了一种含碱性金属蛋白酶的制剂，制剂的有效成分采用该碱性金属蛋白酶，并且还包括植物生长调节剂和/或稳定剂，植物生长调节剂为氨基寡糖素，植物生长调节剂为氨基寡糖素。将该制剂加热至40-50℃后喷洒于侵染了烟草花叶病毒的叶片。
综上所述，本发明公开了一种碱性金属蛋白酶以及含碱性金属蛋白酶的制剂在防治烟草花叶病毒中的应用，其性质稳定，通过对寄主植物和对病毒两个方面起作用，具有良好抗病毒效果，并且对环境友好。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。