阅读说明：本技术 一种溶菌酶复合物 (Lysozyme complex ) 是由 李秋雁 徐志良 张咪 仲倩蕊 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明公布了一种溶菌酶复合物,由溶菌酶和羧化壳聚糖进行复配,其特征在于：各组分的质量体积浓度(g/L)：溶菌酶1-5,羧化壳聚糖0.1-5；其中溶菌酶和羧化壳聚糖的质量比为10：1-10：20。本发明将溶菌酶和壳聚糖衍生物按照一个优选的比例进行复配,制备所得溶菌酶/羧化壳聚糖复合物,较溶菌酶或羧化壳聚糖单独作为抑菌剂使用时抑菌率有所提高；优选配比的复合物溶解性、稳定性好,解决了溶菌酶稳定性差、对革兰氏阴性菌抑制效果差的问题。(The invention discloses a lysozyme compound, which is compounded by lysozyme and carboxylated chitosan, and is characterized in that: mass volume concentration (g/L) of each component: 1-5 parts of lysozyme and 0.1-5 parts of carboxylated chitosan; wherein the mass ratio of the lysozyme to the carboxylated chitosan is 10: 1-10: 20. according to the invention, lysozyme and chitosan derivatives are compounded according to a preferable proportion, and the prepared lysozyme/carboxylated chitosan compound has higher bacteriostatic rate than that of lysozyme or carboxylated chitosan which is used as a bacteriostatic agent alone; the compound with the optimal proportion has good solubility and stability, and solves the problems of poor lysozyme stability and poor inhibition effect on gram-negative bacteria.)

一种溶菌酶复合物

技术领域

本发明属于生物制剂技术领域，特别是涉及一种溶菌酶复合物。

背景技术

溶菌酶是一种天然抗菌蛋白，又称为胞壁质酶或乙酰胞壁质肽聚糖水解酶，溶菌酶广泛分布于自然界，在蛋清、泪液、唾液、血浆、乳汁和组织细胞中及细菌和植物的胶乳中都存在溶菌酶。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，由N-乙酰葡萄糖胺(NAG)、N- 乙酰胞壁酸(NAM)和一种四肽构成，两种糖分子通过β-1,4糖苷键交替连接。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，由于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较高，而革兰氏阴性菌的肽聚糖含量较低且埋藏在外膜脂多糖层之内，阻碍了溶菌酶作用于肽聚糖，因此，溶菌酶对革兰氏阳性菌具有很强的杀菌作用，但对革兰氏阴性菌几乎无作用。同时，溶菌酶是一种碱性蛋白酶，在酸性条件下热稳定性强，但在碱性条件下其活性易被破坏；在干燥、低温条件下，溶菌酶活性不受影响，可长期储存，但其水溶液长期存放或反复冻融都会降低其活性。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，是天然多糖中唯一的碱性多糖，无毒、无抗原性、可生物降解，具有抑菌、抗癌、增强免疫等功效，是近年来新兴的止血材料，广泛应用于医药、化工、食品、生物技术等领域。壳聚糖只能溶于酸性环境、抑菌谱较窄，抑菌效果还与其脱乙酰化程度、分子量以及环境的pH等因素有关，所以对壳聚糖进行修饰改善壳聚糖的溶解性、提高其抑菌活性和止血愈创功效已成为开发壳聚糖类衍生物的重要方向。

目前已有很多研究将溶菌酶、壳聚糖作为抑菌成分加入产品中，通过与不同组分复配来提高它们的抑菌活性和稳定性，如专利号为CN102138570A的中国专利公开了溶菌酶组合抑菌剂，由溶菌酶、甘氨酸、乙二胺四乙酸进行复配组合解决溶菌酶对革兰氏阴性菌抑制效果差的问题；专利号为CN107737024A的中国专利公开了一种含有生物溶菌酶的添加剂组合物，将生物溶菌酶与改性植物胶、EDTA二钠、去离子水按特定含量组合，保护生物溶菌酶的活性免受产品中其他成分影响；专利号为CN107997984A的中国专利公开了一种抗菌肽—壳聚糖复合物、其制备方法及其应用，用抗菌肽修饰壳聚糖，提高了其抗菌活性。由于壳聚糖本身含有β-1,4糖苷键，溶菌酶能够降解壳聚糖，简单将溶菌酶和壳聚糖复配不能达到理想效果，甚至会破坏体系的稳定性，所以需要寻找合适的配比，改善溶菌酶和壳聚糖复配后的抑菌性、稳定性等，目前相关方面的研究还比较少。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种一方面可以提高溶菌酶/ 羧化壳聚糖复合物的稳定性，另一方面提高溶菌酶/羧化壳聚糖复合物的抑菌活性，解决其对革兰氏阴性菌抑制效果差的问题的溶菌酶复合物。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种溶菌酶复合物，由溶菌酶和羧化壳聚糖进行复配，其特征在于：各组分的质量体积浓度(g/L)：溶菌酶1-5，羧化壳聚糖0.1-5；其中溶菌酶和羧化壳聚糖的质量比为 10：1-10：20。该比例的溶菌酶和羧化壳聚糖复配溶液对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到60.4％以上；对于白色念珠菌的抑菌效果达到95.4％以上。该配比还可以有效减缓酶活性的降低。

优选的：所述溶菌酶和羧化壳聚糖的质量比为10：1-10：1.5。该比例的溶菌酶和羧化壳聚糖复配溶液对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到98.7％左右；对于白色念珠菌的抑菌效果达到100％；对于大肠杆菌的抑菌效果达到50％以上。该配比的复合物溶液37℃放置1个月后，溶菌酶酶活性下降了14.3％，有效减缓酶活性的降低。

进一步的：所述羧化壳聚糖为羧甲基壳聚糖或羧乙基壳聚糖。

本发明将溶菌酶和壳聚糖衍生物按照一个优选的比例进行复配，制备所得溶菌酶/羧化壳聚糖复合物，较溶菌酶或羧化壳聚糖单独作为抑菌剂使用时抑菌率有所提高；优选配比的复合物溶解性、稳定性好，解决了溶菌酶稳定性差、对革兰氏阴性菌抑制效果差的问题。

附图说明

图1为本发明对金黄色葡萄球菌的抑菌效果对比图。

图2为本发明对白色念珠菌的抑菌效果对比图。

图3为本发明对大肠杆菌的抑菌效果对比图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、溶菌酶/羧化壳聚糖复合物的配制

在高速磁力搅拌条件下，将溶菌酶溶液逐滴加入羧化壳聚糖溶液中，搅拌10min，配比见表1。

表1不同配比的溶菌酶：羧化壳聚糖

2、溶菌酶/羧化壳聚糖复合物抑菌性能测定：

取新鲜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、变异链球菌斜面培养物，用pH7.2的PBS洗下菌苔，调节使其OD₆₀₀＝0.5，稀释1000倍，取0.1mL菌悬液分别加入不同配比的溶菌酶/羧化壳聚糖复合物溶液中，放入摇床37℃震荡20h，取0.1mL处理后的不同配比溶液涂布平板，37℃培养18～24h，观察溶菌酶/羧化壳聚糖复合物的抑菌效果。

通过稀释涂布平板法对3种细菌进行菌落计数发现，2mg/mL溶菌酶和2mg/mL壳聚糖对3种细菌有不同程度的抑制作用，两者复配后，溶菌酶/羧化壳聚糖复合物溶液的抑菌效果不是单纯溶菌酶、壳聚糖两者抑菌效果的叠加，当溶菌酶与羧化壳聚糖质量比为 10：1.25时，溶菌酶/羧化壳聚糖复合物具有最佳抑菌效果，见图1～3。

金黄色葡萄球菌的抑菌效果：

图1中，(a)所示为对照组金黄色葡萄球菌菌落数303，(b)所示为2mg/mL羧化壳聚糖溶液处理的金黄色葡萄球菌菌落数120，抑菌率为60.4％；(c)所示为2mg/mL溶菌酶溶液处理的金黄色葡萄球菌菌落数25，抑菌率为91.7％；(d)所示为质量比为10：1.25 的羧化壳聚糖溶液处理的金黄色葡萄球菌菌落数4，抑菌率为98.7％。

白色念珠菌的抑菌效果：

图2中，(a)所示为对照组白色念珠菌菌落数1120，(b)所示为2mg/mL羧化壳聚糖溶液处理的白色念珠菌菌落数51，抑菌率为95.4％；(c)所示为2mg/mL溶菌酶溶液处理的白色念珠菌菌落数3，抑菌率为99.7％；(d)所示为质量比为10:1.125的羧化壳聚糖溶液处理的白色念珠菌菌落数0，抑菌率为100％。

大肠杆菌的抑菌效果：

图3中，(a)所示为对照组大肠杆菌菌落数303，(b)所示2mg/mL羧化壳聚糖溶液和(c)所示为2mg/mL溶菌酶溶液对大肠杆菌没有抑制作用；(d)所示为质量比为10:1.125 的羧化壳聚糖溶液，对大肠杆菌抑菌率＞50％。

3、溶菌酶/羧化壳聚糖复合物稳定性测定

以溶壁微球菌CGMCC1.0634为底物，用分光光度法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度测定溶菌酶酶活性。在室温25℃、pH为6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为1个溶菌酶酶活性单位，结果见表2。

表2溶菌酶酶活性测定

表2中，溶菌酶溶液37℃放置1个月后酶活性下降了28.6％，溶菌酶/羧化壳聚糖复合物溶液中溶菌酶酶活性下降了14.3％，有效减缓酶活性的降低。

根据图1～3和表2中结果可以看出，质量比为10:1.125的溶菌酶/羧化壳聚糖复合物可以提高对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性，减缓溶菌酶酶活性的降低，改善其稳定性。