对几种病原细菌有抑菌活性的苏云金菌素的前体肽
阅读说明：本技术 对几种病原细菌有抑菌活性的苏云金菌素的前体肽 (Precursor peptide of thuringiensis with bacteriostatic activity on several pathogenic bacteria ) 是由 孙明 信丙越 郑金水 彭东海 阮丽芳 于 2018-03-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业微生物应用技术领域,具体涉及对几种病原细菌有抑菌活性的苏云金菌素的前体肽。分泌该前体肽序列的为一株分离筛选的苏云金芽胞杆菌XY66,其保藏编号为CCTCC NO：M 2018124。本发明的苏云金芽胞杆菌能产生一种新型细菌素,申请人将该细菌素命名为苏云金菌素。所述苏云金菌素的分子量为4,347.93Da,其前体肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1中1-144碱基位的序列所示。本发明分离的苏云金菌素对多种病原细菌如肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌及蜡样芽胞杆菌有高效抑菌活性。(The invention belongs to the technical field of agricultural microorganism application, and particularly relates to a precursor peptide of thuringiensis with bacteriostatic activity on several pathogenic bacteria. The precursor peptide sequence is secreted by a separated and screened bacillus thuringiensis XY66, and the preservation number is CCTCC NO: m2018124. The Bacillus thuringiensis of the present invention produces a novel bacteriocin which the applicants have named Bacillus thuringiensis. The molecular weight of the thuringiensis is 4,347.93Da, and the amino acid sequence of the precursor peptide is shown as SEQ ID NO:1, base positions 1-144. The separated thuringiensis has high-efficiency bacteriostatic activity on various pathogenic bacteria such as streptococcus pneumoniae, listeria monocytogenes and bacillus cereus.)
技术领域
本发明是申请号为2018102793082申请案的分案申请，申请日为2018年03月31日。
本发明属于农业微生物应用领域，具体涉及对几种病原细菌具有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌的前体肽，所述的苏云金芽胞杆菌菌株为XY66，该菌分泌一种抑菌活性物质即苏云金菌素。
背景技术
抗生素的发现和应用为人类的健康做出了巨大贡献，与此同时由抗生素滥用而导致的细菌耐药性问题也日趋严重。目前寻找新型、高效的抑菌物质来应对抗生素耐药性问题迫在眉睫(Czaplewski et al.,2016)。细菌素是细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽类物质，具有高效的抑菌活性，对人体或动物无毒，能被动物消化道中的一些蛋白酶所降解，具有很好的选择性杀菌效果、易于生物改造和强热稳定性以及耐酸碱能力等特点，是一种良好的抗生素替代品(Cotter et al.,2013)。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一类广泛存在于土壤中的、多种农业害虫具有高效特异的杀虫活性的***。目前Bt已开发成为目前世界上产量最大、应用最广泛的最成功的活菌类生物杀虫剂(Bravo et al.,2011)。而随着研究的深入，目前发现Bt除了可以产生杀虫晶体蛋白外还产生丰富多样的次级代谢产物，而细菌素就是其中一种。目前在Bt中已报道了一些细菌素，如在Bt DPC6431中发现的细菌素Thuricin CD对艰难梭菌具有高效、专一的抑菌活性，且在人体结肠模型下不会破坏肠道菌群的结构，在未来可能成为人类对抗艰难梭菌感染的新药物(Rea et al.,2010)。另外专利申请人也在Bt 4BT1中鉴定了1种新型双组份羊毛硫细菌素Thusin，它对多种革兰氏阳性病原细菌具有高效的抑菌活性，具有成为新型抗菌药物剂的应用潜力(Xin et al.,2016)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，具体涉及对几种病原细菌有抑菌活性的苏云金菌素的前体肽，分泌该肽段的细菌为苏云金芽胞杆菌菌株XY66，该菌分泌一种抑菌活性物质-一种新型细菌素，即苏云金菌素。
本发明的技术方案如下：
申请人分离、筛选得到一株对几种病原菌有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株，将所筛选的菌株命名为苏云金芽胞杆菌XY66，Bacillusthuringiensis XY66，于2018年3月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018124。
苏云金芽胞杆菌XY66菌株具有以下特性：
(1)苏云金芽胞杆菌XY66菌株可产生对多种病原细菌(如肺炎链球菌(代表菌株为ATCC49619)，单核细胞增生李斯特菌(代表菌株为LM201，CMCC54002)和蜡样芽胞杆菌(代表菌株为ATCC14579))具有抑菌活性的物质。
(2)苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的抑菌活性物质为一新型的细菌素，该细菌素类物质申请人将其命名为苏云金菌素。该苏云金菌素的分子量是4,347.93Da(在单一同位素模式下测定)。所述的苏云金菌素的前体肽合成的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中在SEQ ID NO:1所示序列的第1-144位的序列是该序列的编码区，其对应氨基酸为该1-144位碱基所示的序列，编码47个氨基酸残基，该苏云金菌素的前体肽的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示。苏云金菌素的合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
(3)苏云金菌素对多种革兰氏阳性病原细菌(如肺炎链球菌ATCC49619，单核细胞增生李斯特菌CMCC54002，单核细胞增生李斯特菌LM201和蜡样芽胞杆菌ATCC14579)具有抑菌活性。
本发明的分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株XY66的微生物菌学特征如下：
菌体大小为1～1.2μm×3～5μm，细胞呈杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应。在LB固体培养基上可形成表面粗糙、质地软且不规则的淡黄色菌落。最适生长温度为28℃，pH 6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。
本发明的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株XY66可以按照常规甘油管保藏方法保藏。
更详细的技术方案参见《
具体实施方式
》的描述。
附图说明
图1：苏云金芽胞杆菌XY66菌株的菌落形态。
图2：苏云金芽胞杆菌XY66菌株生长至稳定期的发酵上清对肺炎链球菌，单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的抑菌活性检测结果。附图标记说明：图2中的A图是肺炎链球菌ATCC49619的抑菌活性检测结果；图2中的B图是单核细胞增生李斯特菌CMCC54002的抑菌活性检测结果；图2中的C图是单核细胞增生李斯特菌LM201的抑菌活性检测结果；图2中的D图是蜡样芽胞杆菌ATCC14579的抑菌活性检测结果。
图3：苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的细菌素，即苏云金菌素的HPLC分析结果。
图4：苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的细菌素，即苏云金菌素的质谱分析结果。
图5：苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的细菌素，即苏云金菌素的N端测序分析结果。
图6：苏云金菌素的前体肽序列、成熟肽序列和合成基因簇的示意图。附图标记说明：图6中的A图是苏云金菌素的前体肽序列；图6中的B图是苏云金菌素的成熟肽序列；图6中的C图是苏云金菌素的合成基因簇。
图7：苏云金菌素对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的抑菌活性的检测结果。附图标记说明：图7中的A图是肺炎链球菌ATCC49619菌株的抑菌活性检测结果；图7中的B图是单核细胞增生李斯特菌CMCC54002的抑菌活性检测结果；图7中的C图是单核细胞增生李斯特菌LM201菌株的抑菌活性检测结果；图7中的D图是蜡样芽胞杆菌ATCC14579菌株的抑菌活性检测结果。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是本发明筛选的苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的细菌素，即苏云金菌素的前体肽的核苷酸序列。序列长度为144bp。其中在SEQ ID NO:1所示序列的第1-144位的序列是苏云金菌素的前体肽的编码区(即CDS，其中该序列的第141-143位的TAA三个碱基不翻译氨基酸)，共编码47个氨基酸残基。
序列表SEQ ID NO:2是苏云金菌素的前体肽的蛋白质序列。
SEQ ID NO:3是苏云金菌素的合成基因簇的核苷酸序列。序列长度为6533bp。
SEQ ID NO:4是苏云金芽胞杆菌XY66菌株的16SrRNA序列。序列长度为1493bp。
实施例1
一、苏云金芽胞杆菌XY66菌株的分离、鉴定及抑菌活性的检测
1、土壤中对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌及蜡样芽胞杆菌具有抑菌活性的芽胞杆菌的筛选
(1)土壤中芽胞杆菌的分离与筛选
称取中国湖北省武汉市华中农业大学试验农场的1g土壤，在超净台中将土壤加入到称有LB-NaAc培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，醋酸钠34.02g，补充蒸馏水至1L，pH为7.0，121℃灭菌30min)的250mL的三角瓶中，30℃，220rpm/min摇床培养4h。培养4h后将三角瓶置于80℃水浴3min。
待三角瓶冷却后，在超净台中用移液枪吸取100μL培养液涂布于Luria-Bertamedium(LB)固体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉4.5-6g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)，将涂布后的平板放置于30℃培养12-16h。在超净台中将平板中菌落生长形态似芽胞杆菌的菌落在T3固体培养基(配方：蛋白胨5g，酵母粉1.5g，氯化猛0.05g，0.05M磷酸钠缓冲液，琼脂粉4.5-6g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)上划线，并置于30℃培养48h。而后挑取上述的挑选出芽胞杆菌的单菌落，用蕃红染色液(配置方法：2.5％蕃红的乙醇溶液10mL，加蒸馏水稀释至100ml，过滤后使用)简单染色后置普通光学显微镜下观察，对于产芽胞的、杆状细菌可初步判断为芽胞杆菌。
(2)对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌及蜡样芽胞杆菌具有抑菌活性的芽胞杆菌的筛选
挑取上述获得的、不同的芽胞杆菌的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中于30℃过夜活化。将1mL的培养物转移至100mL的LB液体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)中，在220rpm/min，30℃下培养30h。从接种起每隔3h在超净台中取2mL培养液，连续取样10次。其中1mL培养液用于测定该时期发酵液的OD600值。另1mL培养液经12000rpm/min，5min离心后将上清液转移至新的离心管，并测定发酵上清对指示菌的抑菌活性。利用常规琼脂扩散法检测发酵上清的抑菌活性(Cintaset al.,1995)。在未凝固的琼脂培养基中加入适量的指示菌(指示菌来源见后，37℃下活化过夜)，混匀，倒平板。选取肺炎链球菌ATCC49619(菌株来自美国菌种保藏中心)、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54002(菌株来自中国医学细菌菌种保藏管理中心)、单核细胞增生李斯特菌LM201(菌株来自华中农业大学动物医学院微生物学与免疫学实验室，为公开交流的菌株)及蜡样芽胞杆菌ATCC14579(菌株来自美国菌种保藏中心)作为指示菌。待上述琼脂培养基凝固后用孔径为6mm的打孔器打孔。每孔中加入约50μL样品(混菌后)后将平板先放置于4℃，2h左右，让待测样品充分扩散，而后放置于28℃下培养12h，观察抑菌效果(即观察有无透明的抑菌圈的出现)。
3、苏云金芽胞杆菌XY66菌株的鉴定
通过上述对多株芽胞杆菌不同生长时期发酵上清抑菌活性的检测，申请人发现其中一株芽胞杆菌菌株在生长至稳定期可产生对肺炎链球菌ATCC49619、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54002、单核细胞增生李斯特菌LM201及蜡样芽胞杆菌ATCC14579具有抑菌活性的物质(结果如图2所示)，申请人将该菌株初步命名为芽胞杆菌XY66。接下来申请人对芽胞杆菌XY66菌株进行了菌种鉴定。鉴定步骤如下：
(1)总DNA的抽提及全基因组测序
挑取芽胞杆菌XY66菌株的单菌落接种于5ml LB液体培养基中30℃过夜活化将0.5mL的培养物转移至50mL的LB液体培养基中，在同样的条件下培养3-4小时，然后在12000rpm，处理5min，离心收集菌体，用5mLSTE[配方：0.1mol/L NaCL，10m mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1m mol/L EDTA(pH 8.0)]洗涤一次，加3mL溶液I[配方：1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L EDTA(pH 8)，50m mol/L葡萄糖]和50μL溶菌酶(浓度：50mg/mL)，在37℃下作用30min以上；加入3mL10％的十二烷基磺酸钠(SDS)于55℃水浴30min：再加入3.6mL 5MNaCl混和，冰上静置10min，在12000rpm/min，处理15min，取上清置另一离心管；再加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比＝25∶24∶1)，并颠倒混匀200次，尔后在12000rpm离心5min，吸取上清液，并重复抽提1-2次；将上层DNA溶液转移至新离心管，加入等体积95％的乙醇，室温下静置30min后，以12000rpm离心5min，沉淀用1mL 70％的乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于100μLTE溶液中。
将上述制备好的总DNA样品进行全基因组测序(通过Illuminate Hiseq2500测序仪完成)。测序使用双端测序，测序读长为125bp，测序数量为1G。最终测序数据经基因组拼接软件Abyss完成XY66的基因组拼接工作。
(2)芽胞杆菌XY66的16S rDNA序列的PCR扩增
根据真细菌1 6S rDNA保守区设计通用引物27F和1492R,进行PCR扩增。
通用引物的DNA序列如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
PCR扩增反应程序：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min；第3步56℃复性1min；
第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸至5min。
(3)PCR产物的序列测定及分析
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下DNA片段所在的琼脂糖块，使用OMEGA公司生产的DNA片段回收试剂盒回收DNA片段(按试剂盒说明书操作)。将所得DNA片段委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。通过两个测序反应，获得PCR扩增产物的全长1493bp，测序结果输入NCBI数据库，用Blastn程序交送GenBank数据库进行比较分析，表明该序列与GenBank数据库中的炭疽芽胞杆菌FDAARGOS_341，蜡样芽胞杆菌JEM-2,苏云金芽胞杆菌MPSGA01株菌等多株蜡样芽胞杆菌群菌株的16S rDNA的序列一致性均为99.9％。利用BtToxin(杀虫晶体蛋白预测软件)对XY66菌株基因组进行杀虫晶体蛋白的预测分析后发现，XY66菌株中含有1个完整的Cry8Ia1类杀虫晶体蛋白合成基因，所以可断定该菌株属于芽胞杆菌科(Bacillaceae)芽胞杆菌属(Bacillus)苏云金芽胞杆菌种(Bacillusthuringiensis)，申请人将其命名苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)XY66菌株。
二.苏云金芽胞杆菌XY66分泌的细菌素(苏云金菌素)的鉴定
(1)苏云金芽胞杆菌XY66菌株的全基因组测序及抑菌活性物质的预测和分析
苏云金芽胞杆菌XY66菌株抑菌活性物质合成基因簇的预测分析由在线分析软件Antismath 3.0及Bagel 3.0完成。结果如图7中的C图所示，苏云金芽胞杆菌XY66菌株基因组中有一完整的Sactipeptide类细菌素合成基因组。该基因簇中细菌素前体肽序列为MEPIQRDDYWGCALKCAGPCLGVCAIDTASPVMDAVGTASGYAGGHG(该序列同SEQ ID NO:1中的1-144位碱基所示的氨基酸序列相同，直观图见图6中的A图)。该前体肽序列通过BlastP分析，其与已报道的细菌素的氨基酸序列均无同源性，说明其为一新型的Sactipeptide类细菌素。申请人将该合成基因簇分泌的产物命名为苏云金菌素。
(2)苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的细菌素，即苏云金菌素粗体品的制备
挑取苏云金芽胞杆菌XY66菌株的单菌落于5mL LB液体培养基过夜活化。按1％(V/V)接种量转接至10瓶200mL LB培养液中，28℃，220r/min培养OD600至3.0；将发酵液离心(12,000r/min,10min)，并将获得的2L上清用200g的大孔吸附树脂安博莱特(Amberlite)XAD-7HP过柱吸附；吸附后的柱料首先用1L ddH2O冲洗，再用0.5L 20％的乙醇溶液冲洗；最后用0.5L，80％的乙醇(pH 2.0)将活性物质洗脱下来；洗脱液于40℃下通过旋转蒸发仪浓缩(注意浓缩过程中调节旋液pH，保持pH 6.0左右)；旋干至5mL左右后收集并做冻干处理；将所得的干粉溶于50％乙腈(pH 5.0)，离心(12,000r/min,，10min)，所获得的上清即为抑菌物质粗提液。
(3)苏云金菌素纯品的制备
将所得的抑菌物质粗体液采用高压液相色谱仪(Water 1525)system分析。主要技术参数如下：色谱柱：Agilent C18反相柱(250mm×4.6mm，5μL)；流动相：ddH2O(0.1％TFA)和乙腈；流动相条件：0-15min，20％-80％乙腈梯度洗脱；检测波长：220nm；流速：1mL/min；将15min内洗脱的流液分段收集(1min一次，共收集15次)，用常规琼脂扩散法检测收集液的抑菌活性，判断出抑菌物质保留时间。当抑菌物质保留时间确定后，反复收集多次，旋干、并作冻干处理，将获得的粉末称重，溶于20％乙腈(pH 5.0)，并在相同流动相条件下检测其纯度。
(4)苏云金菌素的一级质谱分析
将以上制备的抑菌物质纯品于质谱仪Agilent Technologies 6540UDHAccurate-Mass Q-TOF LC/MS测定其分子量。一级质谱分析条件如下：毛细管电压：3,500V；喷雾压力：35lb/in2 gauge；干燥气流速：9liters/min；温度：350℃；Q-TOF扫描范围：100-3,000m/z；数据采集速率：1spectrum/s。结果如图4所示，苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的活性物质在分子量为4347.93Da(单一同位素模式下测定)。而当预测的苏云金菌素前体肽MEPIQRDDYWGCALKCAGPCLGVCAIDTASPVMDAVGTASGYAGGHG在剪切掉前导肽MEP后剩余氨基酸序列：IQRDDYWGCALKCAGPCLGVCAIDTASPVMDAVGTASGYAGGH G(见图6中的B图)，经4个半胱氨酸侧链的-SH与其他四个氨基酸的的α碳原子交联后(该反应发生于Sactipeptide类细菌素合成过程中)生成成熟肽，分子量为4347.95Da(单一同位素峰模式下测定)。而该分子量与苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的活性物质在分子量4347.93Da的数据几乎是吻合的，这证明苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的活性物质即为苏云金菌素。
(5)苏云金菌素的N端测序
将上述制备的活性物质纯品送至北京农业检测中心进行N-端测序分析。最终测得活性物质的N端前五个氨基酸分别为Ile、Glu、Pro、Asp及Asp(见图5)，与苏云金菌素的前五个氨基酸是吻合的，这进一步证实了苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的活性物质即为苏云金菌素。
三、蜡样菌素抑菌活性和稳定性的测定
将上述获得的苏云金菌素纯品制成终浓度为20μg/mL的试验样品。利用上述介绍的琼脂扩散法检测该浓度下的苏云金菌素对肺炎链球菌ATCC49619、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54002、单核细胞增生李斯特菌LM201及蜡样芽胞杆菌ATCC14579的抑菌活性。结果如图7所示。表明本发明鉴定的苏云金菌素在20μg/mL浓度下对几种上述病原细菌均具有高效抑菌活性。
参考文献
1.Bravo A,Likitvivatanavong S,Gill SS,Soberon M.Bacillusthuringiensis:a story of a successful bioinsecticide.Insect biochemistry andmolecular biology,2011,41:423-31.
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5.Xin B,Zheng J,Liu H,Li J,Ruan L,Peng D,Sajid M,Sun M.Thusin,a noveltwo-component lantibiotic with potent antimicrobial activity against severalGram-positive pathogens.Frontiers in microbiology,2016,7:1115。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 对几种病原细菌有抑菌活性的苏云金菌素的前体肽
<141> 2020-05-05
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 144
<212> DNA
<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(144)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(144)
<400> 1
atg gaa cca att caa cgt gat gac tat tgg ggt tgt gct tta aaa tgt 48
Met Glu Pro Ile Gln Arg Asp Asp Tyr Trp Gly Cys Ala Leu Lys Cys
1 5 10 15
gcg ggc ccg tgt ctc gga gtt tgt gct att gat aca gca agt cca gta 96
Ala Gly Pro Cys Leu Gly Val Cys Ala Ile Asp Thr Ala Ser Pro Val
20 25 30
atg gat gca gtt gga aca gca tca gga tat gct gga gga cat ggt taa 144
Met Asp Ala Val Gly Thr Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly His Gly
35 40 45
<210> 2
<211> 47
<212> PRT
<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 2
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1 5 10 15
Ala Gly Pro Cys Leu Gly Val Cys Ala Ile Asp Thr Ala Ser Pro Val
20 25 30
Met Asp Ala Val Gly Thr Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly His Gly
35 40 45
<210> 3
<211> 6533
<212> DNA
<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(6533)
<400> 3
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agaatttaaa gaaaaagtaa ttgctggtga gaaattagat ccactttcta gattgttgtt 1620
tgctttacca ctatatgaaa ttattaatag accagttaat gcacctttaa aagaattaaa 1680
gccagaattt ttacctttta ccggcacttg tgtaccagga actaaagttg ctgttgatac 1740
taaaggggta ttacatagtt gcgaaaaagt gaatgataaa atgcctatcg gtacagttag 1800
aggatggatt gatattgata aaatagcaga aagcttagaa gagtataatc aatatatggg 1860
tactcaatgt gttaattgtc ctattcaacg tctatgtcca acatgtttta gaaatttcat 1920
tgataatgag ggtggttttg atagaaaatt aagcaaacct tgtaaagaat ttattaatga 1980
gaaaaagaat gcatttaaaa ccacctatac tctgttagaa caaggcataa aactagatga 2040
tatattaaat atgtaattta taaaaagggg cagatgttca tgaataaata ctttaattta 2100
tactctcatt gcgttcctgt taatggacaa tttcgtagca tattgtatga ctttaataaa 2160
gaaacgttat ttcacctcaa agaaaaagaa agtattatta taaatctaat tactaatggt 2220
aaagaaatta aagagattaa gaagaatatt gatgggaacg ttgtagatga gtttataaat 2280
ttacttatag ataaaaatat gggggaatat tcgaattact ttcttcctag agaaacttat 2340
cgaaaaggag caataaaaaa tttattaaaa gatgaaaata ttcccatgca aaatttcttt 2400
atagaactac catgtgaatg caataaaaat tgtatacatt gcgataatac taaaataaac 2460
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gaaaaagcta tgcaaataat acaaactatg aaaacaatag ttcaaaactg tgataaaaat 2820
gataagatta ttatagttaa tgtgttgttt agtacggaaa atttaaaaaa ttataaatta 2880
atatatgaga aattaaaaca gatcggtatt cagcagatta ttccttcagt tcttattaaa 2940
agtattgatg ataaagtagt ttaccatcaa aatttgcctg tttttacaaa agatattaat 3000
tctttttcgt atttaggaga atatcatcct tgtttggcag gtactttggc aattggtgca 3060
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<210> 4
<211> 1493
<212> DNA
<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1493)
<400> 4
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