阅读说明：本技术 一种黑果枸杞多糖lrp3-s1、其制备方法及其用途 (Lycium ruthenicum polysaccharide LRP3-S1, and preparation method and application thereof ) 是由 丁侃 陈霞 张世海 何菲 于 2019-04-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了从黑果枸杞果实当中获得一种黑果枸杞多糖LRP3-S1的制备方法和该多糖抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的用途、在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物或保健品中的用途。采用水提醇沉的方法及层析柱分离纯化得到均一多糖,通过化学和物理方法鉴定了该多糖的RG-I结构。经体外实验证明,该多糖能抑制胰腺癌细胞的增殖并减弱其侵袭能力。因此,所述多糖具有潜在的治疗胰腺癌的作用,可能成为一种抗胰腺癌的糖类药物。(The invention provides a preparation method of lycium ruthenicum polysaccharide LRP3-S1 obtained from lycium ruthenicum fruits, application of the polysaccharide in inhibiting proliferation and invasion of pancreatic cancer cells, and application in preparing a medicament or a health-care product for preventing and/or treating pancreatic cancer. Homogeneous polysaccharide is obtained by adopting a water extraction and alcohol precipitation method and chromatographic column separation and purification, and the RG-I structure of the polysaccharide is identified by chemical and physical methods. In vitro experiments prove that the polysaccharide can inhibit the proliferation of pancreatic cancer cells and weaken the invasive ability of the pancreatic cancer cells. Therefore, the polysaccharide has potential effect of treating pancreatic cancer, and can be used as a carbohydrate drug for resisting pancreatic cancer.)

一种黑果枸杞多糖LRP3-S1、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及了一种多糖的用途，确切的说涉及了一种从黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murr)当中提取得到的RG-I型果胶，还提供了其制备方法，以及其在治疗胰腺癌过程中的用途、在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物或保健品中的用途。

背景技术

胰腺癌(Pancreatic cancer)是恶性程度最高，预后最差，五年存活率最低的实体性肿瘤之一。同时胰腺癌具有较高的侵略性，通常在癌症的早期进行转移，侵袭到基质和血管及其外周组织，使死亡率大大提高。因此，成为目前人们备受关注的重大疾病之一。

黑果枸杞是中国西北地区一种特有的药食两用植物，具有补肾益精，养肝明目，补血安神清热除蒸等功效，民间具有“软黄金”之称，主要分布于宁夏、甘肃、青海和新疆等省。黑果枸杞主要用于治疗心脏病、高血压、***、更年期紊乱、尿道结石、牙龈出血等。多糖作为黑果枸杞当中的主要成分，已被报道具有抗疲劳、免疫调节、消炎、降血糖、抗氧化的功效，而对抗肿瘤方面的报道较少。

发明内容

本发明用一种简单有效的提取和纯化植物多糖的工艺和方法，以青海产地的黑果枸杞为原料获得了一种果胶多糖，通过体外实验证明，该多糖能剂量依赖性地抑制体外胰腺癌细胞的生长，减弱了胰腺癌细胞的侵袭能力。该多糖通过阻断FAK/AKT/GSK-3β和p38信号通路来干预胰腺癌细胞的增殖和侵袭，从而达到抗胰腺癌的作用。因此该多糖具有潜在的治疗胰腺癌的效果，有望开发成为一种治疗胰腺癌疾病的糖类药物。

为解决上述发明目的，本发明提供了一种黑果枸杞多糖LRP3-S1，其单糖组成的摩尔百分比为：鼠李糖14.4％，半乳糖醛酸17.7％，半乳糖26.6％，木糖16.4％和***糖24.9％。

优选地，所述黑果枸杞多糖LRP3-S1具有如下结构：

其中，所述黑果枸杞多糖LRP3-S1的分子量在100–120kDa，优选为114.8kDa；其中a,b,c三部分的比例固定不变。

本发明还提供了所述黑果枸杞多糖LRP3-S1的制备方法，其包括如下步骤：

(1)多糖的提取：黑果枸杞沸水提取，得到提取液，对提取液进行浓缩，向浓缩液中加入乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，得粗多糖；

(2)多糖的纯化：粗多糖经DEAE Sepharose^TM Fast Flow阴离子交换柱分离，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组份；该洗脱组份再经过Sephacryl S-300HR凝胶柱进一步纯化，得到所述黑果枸杞多糖LRP3-S1。

优选地，步骤(1)中，在进行沸水提取前，先用乙醇对黑果枸杞浸泡3～10天(比如7天)，然后风干；

优选地，步骤(1)中，沉淀所用乙醇为体积分数95％的乙醇；沉淀所用的乙醇体积为浓缩液的3～6倍(比如5倍)；

优选地，步骤(1)中，在进行乙醇沉淀前，先对浓缩液进行离心，然后对离心上清液进行透析，透析时间优选为24～48h；

优选地，步骤(1)得到的粗多糖在进行步骤(2)的多糖纯化前进行洗涤，采用乙醇和丙酮交替洗，各洗涤2-4次；

优选地，步骤(2)所述阴离子交换柱分离时依次使用0.05M、0.1M、0.2M的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组份；

优选地，步骤(2)所述Sephacryl S-300HR凝胶柱进一步纯化时，使用0.2M NaCl洗脱液进行洗脱，收集得到的洗脱组分为黑果枸杞多糖LRP3-S1。

本发明对所得到的黑果枸杞多糖LRP3-S1的鉴定，包括进行纯度及分子量的测定，然后采用部分酸水解，糖组成的测定，甲基化，红外及核磁共振等方法对其结构进行解析。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述黑果枸杞多糖LRP3-S1，以及药学上可接受的辅料。

本发明还提供了所述黑果枸杞多糖LRP3-S1或所述药物组合物在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物或保健品中的用途。

附图说明

图1为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1高效液相色谱的纯度图。

图2为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1的红外谱图。

图3为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1的1H NMR和13C NMR图谱。

图4为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1对胰腺癌细胞和正常细胞存活率情况的影响柱状图。

图5为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1影响BxPC-3胰腺癌细胞侵袭的小室穿膜实验图。

图6为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1对BxPC-3细胞当中蛋白水平表达的免疫印迹图。

具体实施方式

制备实施例1黑果枸杞多糖LRP3-S1的提取分离纯化和结构表征

(1)多糖的提取分离

将黑果枸杞果实用工业乙醇浸泡一周，浸泡之后的黑果枸杞进行风干，然后用沸水提取法提取，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。合并提取液，浓缩至小体积后，离心去沉淀。将上清液用对流水透析两天。透析内液用体积分数95％的乙醇以提取液与乙醇的体积比为1：5(v/v)进行醇沉，静置过夜。弃掉上层多余乙醇，沉淀离心后将沉淀用乙醇和丙酮交替洗三次，干燥后得水提粗多糖(93.3g)。

(2)多糖的纯化

每次取6g粗多糖溶解于80mL去离子水中，搅拌过夜，离心取上清上样于DEAESepharose^TM Fast Flow阴离子交换柱，用去离子水和不同浓度的NaCl溶液(0.05M、0.1M、0.2M)进行梯度洗脱，流速控制在13mL/15min，用自动收集仪收集。每管取100μL用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度，用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集分离的多糖进行减压浓缩、透析、冷冻干燥，最后得到0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分(次级粗多糖LRP3)。

每次将200mg的次级粗多糖LRP3溶于3mL去离子水中，离心(4,000r/min)取上清上样于Sephacryl S-300HR凝胶柱，经0.2M NaCl洗脱液洗脱，流速控制在5mL/15min，自动收集仪收集。经过硫酸苯酚法显色、酶标仪检测吸光度并绘制洗脱曲线，收集所需的分离组分进行浓缩透析，最后冷冻干燥得到该均一的黑果枸杞多糖LRP3-S1(0.5g)。

(3)多糖的结构鉴定

多糖LRP3-S1在串连Ultrahydrogel^TM802和Ultrahydrogel^TM804分析凝胶柱上的特征图谱如图1所示，其色谱条件为：流动相：0.1M NaNO₃；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；Agilent 1260液相色谱仪；检测器：示差检测器和紫外检测器。

取黑果枸杞多糖LRP3-S1样品约2mg，采用溴化钾压片法测定多糖的红外光谱，结果如图2，3429.52cm^-1为O-H的伸缩振动吸收峰。2931.54cm^-1为C-H的伸缩振动吸收峰。1420.32cm^-1和1050.29cm^-1分别为环外和环内的C-O伸缩振动。1735.01cm^-1来自于羧基的C＝O的伸缩振动，说明该多糖是一个酸性多糖。

取黑果枸杞多糖LRP3-S135mg，加D₂O 0.5mL溶解，加2.5μL丙酮为内标(δ_H＝2.29ppm，δ_C＝31.5ppm)，于BrukerAVANCE III 500M核磁共振仪上，25℃分别测定一维核磁共振谱，结果如图3所示。图3A表示多糖的¹³C NMR图谱，化学位移110.38ppm,108.71ppm和108.34ppm分别归属于T-linkedα-L-Araf,1,5-linkedα-L-Araf和1,3,5-linkedα-L-Araf。化学位移105.44ppm and 104.86ppm归属于1,3,6-linkedβ-D-Galp和1,3-linkedβ-D-Galp。104.69ppm和104.60ppm归属于T-linkedβ-D-Galp和1,6-linkedβ-D-Galp。化学位移在103.87ppm归属于T-linked Xylp。99.86ppm被归属于1,2-linkedα-L-Rhap和1,2,4-linkedα-L-Rhap，98.76ppm归属于1,4-linkedα-D-GalA。图3B表示多糖的¹H NMR图谱，化学位移在5.31ppm被同时归属于T-linkedα-L-Araf，1,2-linkedα-L-Rhap和1,2,4-linkedα-L-Rhap的H-1。5.18ppm和5.15ppm被分别归属于1,3,5-linkedα-L-Araf和1,5-linkedα-L-Araf的H-1。5.07ppm和4.68ppm被归属于1,4-linkedα-D-GalA和T-linkedβ-D-Galp的H-1。4.70ppm被同时归属于1,3,6-linkedβ-D-Galp和1,3-linkedβ-D-Galp的H-1。化学位移在4.61ppm和4.58ppm被分别归属于1,6-linkedβ-D-Galp和T-linkedβ-D-Xylp的H-1。单糖组成分析结果显示，其单糖组成的摩尔百分比为：鼠李糖14.4％，半乳糖醛酸17.7％，半乳糖26.6％，木糖16.4％和***糖24.9％。所述的黑果枸杞多糖LRP3-S1具体结构为：

经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定黑果枸杞多糖LRP3-S1的相对分子质量为114.8kDa

测试实施例1黑果枸杞多糖LRP3-S1的抗胰腺癌活性

(1)MTT实验检测黑果枸杞多糖LRP3-S1对胰腺癌细胞AsPC-1，BxPC-3和PANC-1增殖的影响

取生长状态良好的胰腺癌细胞或正常细胞(细胞密度为5×10⁴个)种入96孔板中。每孔加100μL，设置3个复孔，同时设置空白组(等体积的培养基)和对照组(用等体积培养基孵育的细胞)，培养过夜。将不同浓度的黑果枸杞多糖LRP3-S1溶液分别加入96孔板中，和空白组、对照组一起在37℃，5％CO₂的条件下培养72h。加入5mg/mL MTT(PBS溶解)10μL，于培养箱中继续培养4h。弃去培养基，加入150μL DMSO(含甲瓒Formazan)，震荡30min，在酶标仪下检测490nm处的吸光度。细胞存活率按照以下公式进行计算：细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。结果如图4所示，当给药浓度为8.71μM时，LRP3-S1对AsPC-1、PANC-1和BxPC-3细胞增殖的抑制率达到了30.1％，29.0％和67.1％(图4A)。但在同等条件下，多糖LRP3-S1对HPDE6-C7和LO2的抑制率仅为10％(图4B)，抑制率较低，说明该多糖无明显的毒副作用。

(2)Transwell小室穿膜实验检测了LRP3-S1对BxPC-3胰腺癌细胞侵袭能力的影响。

用孔径为8μm的transwell小室作为内室，24孔板作为外室进行实验，在4℃下溶解Matrigel，用无血清的预冷培养基稀释Matrigel至5mg/mL，取80μL稀释胶加入到transwell小室中，37℃孵育5h。用无血清培养基清洗凝胶以水化基底膜。在内室中分别加入含有LRP3-S1(0、4.36、8.71μM)及BxPC-3细胞(1.5×10⁵)的无血培养基100μL，外室加入含有15％FBS的培养基600μL，继续培养24h后弃去培养基，用体积分数90％的乙醇固定细胞30min，0.1％结晶紫染色30min，上层未迁移细胞用棉签擦去，用倒置显微镜拍照记录，放大倍数为200×。从图5能观察到BxPC-3细胞大量侵袭到Transwell小室下层，而在给药处理48h之后，下层细胞随着浓度的增加而大幅度的减少。在8.71μM时，下层细胞的细胞面积比0μM时低了43％，上述结果说明LRP3-S1能显著抑制BxPC-3细胞的侵袭。

(3)免疫印迹实验检测LRP3-S1对FAK、AKT、GSK-3β和p38及其磷酸化后的蛋白表达。

取对数生长期的BxPC-3细胞，以5×10⁵个/孔的密度种于12孔板中，培养24h后。用4.63μM及8.71μM的黑果枸杞多糖LRP3-S1处理，处理24h后，弃上清，用预冷的PBS漂洗细胞，加入细胞裂解液RIPA(临用前加入蛋白酶抑制剂cocktail，购自碧云天公司)冰上裂解细胞30min，离心收集上清液。加入5×上样缓冲液后将蛋白于煮样器中变性15-30min，冷却后储存于-80℃，免疫印迹检测FAK、AKT、GSK-3β和p38磷酸化的蛋白表达情况。

实验结果如图6所示，随着给药浓度的增加(0、4.63μM、8.71μM)，AKT(图6A)、GSK-3β(图6B)、FAK(图6C)和P38(图6C)的磷酸化水平都逐渐减弱，而FAK、AKT和p38的蛋白表达水平则没有显著性的改变。以上实验说明FAK/AKT/GSK-3β和p38信号通路参与了LRP3-S1调控的人胰腺癌细胞的增殖抑制和侵袭能力的减弱。

综上，通过实施例可知，黑果枸杞多糖LRP3-S1能剂量依赖性地抑制胰腺癌细胞的增殖并减弱其侵袭能力，同时毒副作用低，对正常人体细胞无杀伤作用，进一步地分子机制研究表明，LRP3-S1能明显抑制FAK、AKT、GSK-3β和p38的磷酸化的表达，从而抑制胰腺癌细胞的活性。该多糖LRP3-S1能成为治疗胰腺癌的潜在糖类药物。