阅读说明：本技术 一种利用微生物或酶发酵或转化葵粕和葵壳增产黑色素的方法 (Method for increasing melanin production by fermenting or converting sunflower meal and sunflower shells by using microorganisms or enzymes ) 是由 陈育如 王屹东 王鸿飞 江慧玲 曾茜 钱者东 罗海波 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用微生物或酶发酵或转化葵粕和葵壳增产黑色素的方法,葵粕和葵壳混合或分别加入微生物或酶,经发酵或转化产黑色素。本发明利用微生物对葵粕和葵壳发酵或酶转化深加工可大大增加黑色素的产量和提取效率。(The invention discloses a method for increasing melanin production by fermenting or converting sunflower meal and sunflower shells by using microorganisms or enzymes. The invention can greatly increase the yield and extraction efficiency of melanin by utilizing the fermentation or enzyme conversion deep processing of the microorganism sunflower meal and sunflower shell.)

一种利用微生物或酶发酵或转化葵粕和葵壳增产黑色素的 方法

技术领域

本发明涉及黑色素的生产方法，特别涉及一种利用微生物或酶发酵或转化葵粕和葵壳增产黑色素的方法。

背景技术

天然黑色素是植物、动物和真菌等表现黑色的本源，在植物、动物和微生物中广泛分布，是所有已知生物色素中存在最多、最广的一类色素。黑色素最早由瑞士科学家Berzelius命名，是由多羟基吲哚或多羟基酚类物质聚合形成的一类结构复杂多样的大分子物质，常存在细胞中的与生物大分子结合，无定形，不溶于水、酸性溶液和大多数有机溶剂，但易溶于碱性溶液，且能和蛋白质、鞣质和碳水化合物等大分子紧密结合。生物体在有氧条件下，通过多酚氧化酶将多酚类物质氧化为醌类物质，醌类物质聚合产生黑色素，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶Tyrosinase，EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶Catechol oxidse，EC.1.10.3.2)和漆酶(Laccase，EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

在各类天然色素中，黑色素具有很好的光热稳定性。随着对黑色素研究的不断深入，黑色素的生物活性越来越受到重视，包括抗氧化、清除自由基、抗辐射、防衰老和提高免疫力等多种生物活性，在化妆品、医学和新型材料等领域得到广泛应用(邹宇，尹冬梅，胡文忠等.天然黑色素理化性质与功能特性研究进展[J].食品工业科技，2012，33(24)：445-447)。合成黑色素由于其毒副作用较大，而生物黑色素的安全系数高，具有广泛的应用，用微生物制备安全无毒的黑色素(Zou Y，Xie C，Fan G，et al.Optimization ofultrasound-assisted extraction of melanin from Auricularia auricula fruitbodies[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2010，11(4)：0-615)。生物黑色素可用于人体抗氧化和免疫调节，还可作为食品或日用品添加剂，用于酒类、饮料和糖果等食品着色和化妆品行业，具有极大的发展潜力和应用前景。

植物体内广泛存在有生物黑色素，植物黑色素难溶于水，不溶于有机溶剂，是结构复杂的大分子物质。根据结构植物黑色素可以分为二类：一类为多酚和酪氨酸及其相关化合物代谢的最终产物；另一类为母核是类黄酮的花色苷类。植物黑色素主要存在于一些黑色果实或种子的表皮组织中，目前主要研究对象有黑米、黑芝麻、香蕉皮、花椒籽和山杏种皮等。

葵粕是优质的蛋白资源，既能食用，又能用作饲料；葵壳富含纤维素，黑壳品种富含黑色素。脱壳葵粕蛋白质含量高于豆粕，必须氨基酸除赖氨酸外含量都高于豆粕(王继强，龙强，李爱琴，张宝彤.葵粕的营养价值及在饲料生产中的应用[J].广东饲料，2010，19(01)：36-38)，且与豆粕比较，葵粕不含有显著影响动物生长的抗营养因子如胃蛋白酶抑制因子、寡糖、脂肪氧化酶、植物凝集素和皂甙等(夏明亮，程璐.葵花籽粕的营养价值及其在养猪生产中的合理使用[J].饲料研究，2019，42(04)：87-90)。葵粕和葵壳是用向日葵籽生产葵花籽油的副产物，含量大量蛋白质和粗纤维等，经过粗加工后部分用作动物饲料，但附加值很低。现有技术中葵壳和葵粕的深加工很少，没有用葵粕经发酵法或酶法产黑色素的报道。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种利用微生物或酶发酵或转化葵粕和葵壳提高黑色素产量和提取效率的方法。

技术方案：本发明提供一种利用微生物或酶发酵或转化葵粕和葵壳增产黑色素的方法，葵粕和葵壳混合或分别加入微生物或酶，经发酵或转化产黑色素。加酶或利用微生物产酶促进葵粕中的绿原酸等成分产黑色素，葵壳改善葵粕的不透气缺点，提高发酵效率。葵粕本身因其中所含绿原酸等的氧化变黑而呈现黑色，本发明用其作为培养基进行微生物发酵，增加黑色素的含量，并使其中原有的黑色素和增加的黑色素更易浸提。葵粕的蛋白质含量很高，作为真菌培养基通气性不良，与葵壳混合后可以增加培养基的通气性，有利于所培养微生物的生长和黑色素的增产。

产纤维素酶等的微生物可利用葵壳作为培养基，与葵粕配伍后发酵可增加黑色素的产量，通过碱性条件等浸提，酸沉后得到黑色素。提取黑色素后剩余的滤液和残渣可用作饲料或肥料。

进一步地，所述微生物是黑曲霉(Aspergillus niger)及其变种。

进一步地，所述微生物是冠突散蓑菌(Eurotium cristatum)及其变种。

进一步地，所述微生物是木霉(Trichoderma spp.)及其变种。

进一步地，所述微生物是米曲霉(Asp.oryzae)及其变种。

进一步地，所述微生物是酵母(Saccharomyce)及其变种。优选产黑色素的酵母，又名出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)及其变种。

进一步地，所述微生物是脉孢菌(Neurospora)及其变种。优选产黑色素的脉孢菌，脉孢菌使纤维素等水解，发酵葵粕促进以酚酸类等物质的黑色素和葵壳物料中的黑色素。

进一步地，所述酶为儿茶酚氧化酶或儿茶酚氧化酶的酶曲。

进一步地，所述酶为酪氨酸分解酶或酪氨酸分解酶的酶曲。

进一步地，所述酶为漆酶(Laccase)或含漆酶的云芝、裂褶菌等发酵酶曲。

酪氨酸酶(Tyrosinase)在黑色素生物合成中扮演重要角色，它是酪氨酸(Tyr)和多巴向黑色素转变过程中的主要限速酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中。微生物和人体内，酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下被氧化为多巴醌；多巴醌会自动氧化生成多巴和多巴色素，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌，多巴醌进入DOPA途经最终形成黑色素。在植物中，大量的酚类化合物可作为其底物，当组织受到损伤时，酪氨酸酶会将它们氧化成褐色。微生物黑色素的DOPA合成路径如下：

儿茶酚氧化酶(Catechol oxidse)又被称为甲酚酶、酪氨酸酶、酚氧化酶、儿茶酚酶等，广泛存在于植物器官或组织内，并不严格地表达于植物的特定组织部位中，随着植物的生长其含量和活性也会发生相应改变。植物组织暴露于空气中时，其中存在儿茶酚氧化酶催化各种酚类(儿茶酚、单宁酸、酪氨酸等)氧化形成醌，这些醌类再经聚合成黑色素，因此组织颜色从褐到黑逐步加深。

漆酶(Laccase)作为一种广泛存在于真菌、细菌、昆虫和植物中含铜的多酚氧化酶。与酪氨酸酶和儿茶酚氧化酶不同，漆酶不能催化酪氨酸反应，能够催化酚类化合物及其衍生物，使之生成相应的苯醌和水。漆酶催化底物范围较广，专一性较低，除酚类物质外，还可催化抗坏血酸、苯二胺等物质发生氧化。漆酶通过催化3，4-左旋多巴(L-DOPA)氧化聚合形成黑色素。

微生物所产的黑色素主要分为胞内、胞外和胞壁结合黑色素。微生物通过DOPA途径，酪氨酸在酪氨酸酶的催化下，经由DOPA、多巴、醌、吲哚醌等形式。最后生成黑色素。许多霉菌、细菌和放线菌都能产生黑色素，通过微生物生产并提取黑色素的优点是原料不受地域和季节限制，易于工业化生产。真菌黑色素是广泛存在于各类真菌的菌丝体细胞壁上的非均质类多酚聚合物，具有光保护、抗辐射、结合金属离子、清除自由基和抗氧化等方面的生物学功能，对提高真菌在胁迫环境中的生存能力起至关重要的作用。

黑曲霉(Aspergillus niger)属子囊菌门，散囊菌纲，散囊菌目，发菌科，曲霉属，是丝状真菌，具有强大的蛋白分泌能力。黑曲霉的孢子颜色黝黑，表面覆盖有一层黑色素，在其抗逆性方面起关键性作用，具有抗紫外辐射、吸收能量和改变疏水作用及静电作用。

脉孢菌(Neurospora)是子囊菌门，子囊菌纲，粪壳目，粪壳科。它具有疏松网状的长菌丝，有隔膜、分枝、多核，无性繁殖形成分生孢子，一般为卵圆形，在气生菌丝顶部形成分枝链。纤维素酶能降解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质。脉孢菌具有产黑色素的能力。

金花菌又名冠突散囊菌(Eurotium cristatum)，生长时通常会代谢产生大量的色素物质，初期主要色素为黄色素，随着培养时间的增长有大量黑色素产生。

黑酵母又名出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，为半知菌类短梗霉属是一种具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌，其厚垣孢子可积累黑色素。

木霉(Trichoderma spp.)被认为是最好的纤维素酶产生菌之一，其产生的纤维素酶系比例恰当，可以有效地酶解纤维素类物质。

有益效果：本发明利用微生物对葵粕和葵壳发酵或酶转化深加工可大大增加黑色素的产量，对比单纯提取葵粕黑色素产量提高约72-350％，提取效率提高约22-78％。充分利用葵粕和葵壳进行发酵，可充分利用资源，降低生产成本，获到高附加值的黑色素等产品。

具体实施方式

实施例1

将100kg葵粕进行除杂，加葵壳10kg(10∶1，w/w)后，用常规的碱法黑色素提取方法提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到6.2kg黑色素产品和13.8kg固体提取剩余物，提取率18.3％，黑色素色价为89。黑色素的色阶也称比吸光度，是指1％浓度的色素溶液透过1cm比色皿在其最大吸收峰处的吸光度值。

实施例2

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳10kg(10∶1，w/w)后灭菌，冷却后接入木霉，于30℃固体培养5d，用常规的黑色素提取方法提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到10.5kg色价为162的黑色素和99.5kg固体提取剩余物，黑色素提取率从不加木霉发酵的18.3％提高到89.5％。

实施例3

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳20kg(10∶2，w/w)后灭菌，冷却后接入黑曲霉，于30℃固体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到31.0kg黑色素产品和79.0kg固体提取剩余物，提取率99.3％，黑色素色价为186。

实施例4

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1，w/w)后灭菌，冷却后接入脉孢菌，于32℃固体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到14.7kg黑色素产品和固体提取剩余物95.3kg，提取率88.9％，黑色素色价为166。

实施例5

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1.2，w/w)后灭菌，冷却后接入米曲霉，于32℃固体培养6d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到8.7kg黑色素产品和固体提取剩余物98.3kg，提取率87.0％，黑色素色价为149。

实施例6

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳30kg(10∶3，w/w)后灭菌，冷却后接入冠突散蓑菌，于30℃固体培养7d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到28.9kg黑色素产品和固体提取剩余物96.1kg，提取率96.1％，黑色素色价为257。

实施例7

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1，w/w)后灭菌，冷却后接入黑酵母，于28℃固体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到16.1kg黑色素产品和固体提取剩余物93.9kg，提取率87.9％，黑色素色价为251。

实施例8

将100kg葵粕进行除杂，灭菌，冷却后后接入冠突散蓑菌，于30℃固体培养8d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤分离不溶物，分别得到16.0kg黑色素产品和84.0kg固体提取剩余物，提取率47.6％，黑色素色价为121。

实施例9

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶5，w/w)后灭菌，冷却后后接入冠突散蓑菌，于30℃固体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤分离不溶物，分别得到50.3kg黑色素产品和98.7kg固体提取剩余物，提取率99.7％，黑色素色价为170。

实施例10

将100kg葵粕进行除杂，灭菌，冷却后接入木霉，于30℃液体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到9.8kg黑色素产品和90.2kg固体提取剩余物，提取率76.8％，黑色素色价为164。

实施例11

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(15∶1，w/w)后灭菌，冷却后接入散蓑菌变种，于30℃固体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到7.2kg黑色素产品和93.7kg固体提取剩余物，提取率88.2％，黑色素色价为153。

实施例12

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1，w/w)后灭菌，冷却后接入黑曲霉，于30℃固体培养5d，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到17.3kg黑色素产品和93.7kg固体提取剩余物，提取率89.5％，黑色素色价为186。

实施例13

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1，w/w)后，加入儿茶酚氧化酶，于30℃液体转化18小时，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到12.6kg黑色素产品和97.4kg固体提取剩余物，提取率78.8％，黑色素色价为167。

实施例14

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1，w/w)后加入酪氨酸氧化酶，于35℃液体转化48小时，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到13.5kg黑色素产品和96.5kg固体提取剩余物，提取率91.1％，黑色素色价为171。

实施例15

将100kg葵粕进行除杂，混合葵壳(10∶1，w/w)后加入漆酶或含漆酶的云芝、裂褶菌等发酵酶曲。，于30℃液体转化28小时，用常规的植物黑色素提取方法在碱性条件下提取黑色素，抽滤取出不溶物，分别得到20.2kg黑色素产品和89.8kg固体提取剩余物，提取率77.7％，黑色素色价为123。