阅读说明：本技术 一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法 (Biological agent for inhibiting whitish disease of procambarus clarkii and preparation method thereof ) 是由 朱长健 于 2019-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法,它是由人工培养菌种,利用培养基中的真菌溶液进行发酵,再配合纯净水制成,它主要成分包括10-20份乳酸菌种、10-20份酵母菌种、10-20份芽孢杆菌种、2-5份营养激活剂和20-50份水。该一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法,该生物制剂在水中溶解,利用多菌种微生物能快速分解有机质,降低氨氮,亚硝酸盐等有害因子,净化了水质；该生物制剂中富含多种生物活性有机酸和氨基酸,具有较强的解毒作用,能够稳定藻相,调节了酸碱度；调节肠道微生物生态菌群结构,有主消化,减少肠炎,缓解了“白便”症状,降低了白浊病患病的概率,增加了克氏原螯虾的存活率。(The invention discloses a biological preparation for inhibiting whitish and turbid disease of procambarus clarkia and a preparation method thereof, which is prepared by artificially culturing strains, fermenting by using fungus solution in a culture medium and then matching with purified water, and mainly comprises 10-20 parts of lactic acid bacteria, 10-20 parts of yeast strains, 10-20 parts of bacillus strains, 2-5 parts of nutrition activating agent and 20-50 parts of water. The biological agent for inhibiting the whitish and turbid disease of the procambarus clarkii is dissolved in water, and the multi-strain microorganisms can be used for quickly decomposing organic matters, reducing harmful factors such as ammonia nitrogen, nitrite and the like, and purifying water quality; the biological preparation is rich in various bioactive organic acids and amino acids, has strong detoxifying effect, can stabilize algal phase, and adjust pH value; the intestinal microorganism ecological flora structure is adjusted, the digestion is mainly realized, the enteritis is reduced, the white feces symptom is relieved, the probability of suffering from the turbid urine disease is reduced, and the survival rate of the procambarus clarkii is increased.)

一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法

技术领域

本发明涉及生物药剂技术领域，具体为一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法。

背景技术

克氏原螯虾又名小龙虾，是淡水经济虾类，因肉味鲜美广受人们欢迎，其主要栖息于永久性溪流和沼泽，临时的栖息地，包括沟渠和池塘，其摄食范围包括水草、藻类、水生昆虫、动物尸体等，因其杂食性、生长速度快、适应能力强而被人们广泛养殖。

目前克氏原螯虾中肠腺白浊病的病原为中肠腺坏死杆状病毒，病虾通常在近表层水中游动，活动力差，对刺激的反应迟钝，病虾中肠腺(又叫肝胰腺)呈不透明白浊状，严重时肠道也变混浊，病毒主要侵害克氏原螯虾的仔虾。该病流行于5-9月，发病期主要为仔虾第2-12天，死亡率一般为70％-100％。对于克氏原螯虾中肠腺白浊病现阶段多采用西药抗生素进行治疗，尽管水产药品控制较严格，但西药抗生素滥用情况仍十分严重，且耐药菌株出现较快，使得克氏原螯虾中肠腺白浊病的治疗难度加大，药物残留问题越来越重，给食品安全问题造成严重威胁。

我国中药资源丰富，通过对传统中药进行合理筛选和组方，作为治疗克氏原螯虾中肠腺白浊病的首选，将具有非常重要的生产实践意义。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，解决了克氏原螯虾因白浊病导致死亡的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，它是由人工培养菌种，利用培养基中的真菌溶液进行发酵，再配合纯净水制成，它主要成分包括10-20份乳酸菌种、10-20份酵母菌种、10-20份芽孢杆菌种、2-5份营养激活剂和20-50份水。

优选的，具体的制备工艺包括以下步骤：

S1、按照重量比例取出10-20份乳酸菌种、10-20份酵母菌种、10-20份芽孢杆菌种、2-5份营养激活剂和20-50份水放入培养基中，其中乳酸菌种、酵母菌、杆菌、营养激活剂和水的比例为1：1：2：0.5：3；

S2、将培养基放置于培养室中2-5小时，培养基的温度为30-50℃，PH为8-9碱性环境；

S3、在培养基中注入3.5份的水，发酵20小时左右，然后将培养基中液体取出，最终利用纯净水在常温下稀释五倍，然后装袋，即可。

优选的，所述乳酸菌种的培养包括发酵基质10～20份、稳定剂0.2～0.5份、甜味剂0.01～0.02份、酸度调节剂0.001～1份、食用香精0.001～0.5份、抗氧化剂0.001～0.5份、防腐剂0.001～0.5份、乳酸菌0.0001～0.001份、水75～86份，其发酵步骤如下：

A1、发酵基质处理：将富含碳水化合物的物质粉碎后加到温度为40～50℃的水中，搅拌均匀后加入葡糖淀粉酶，然后保温30～90min；然后迅速在10～35min内将温度升至75～80℃，再保温60～90min，然后经过100目过滤后取上清，既得处理好的发酵基质；

A2、发酵液的制备：将稳定剂、甜味剂、酸度调节剂、防腐剂加入700L水中，保持温度在121～124℃，高压灭菌20～30min，得到发酵初液；然后将抗氧化剂加入纯化水中并经过0.22um孔径过滤，等抗氧化剂水溶液在降温至37～40℃时，加入上述发酵初液中，得到发酵液；

A3、接种：将步骤A1处理好的发酵基质加入步骤A2得到的发酵液中后，降温至温度为35～37℃时，接种乳酸菌；

A4、产品分装：在发酵的第三天加入0.5～2kg食用香精，搅拌均匀后进行产品分装。

其中，发酵基质配方采用重量比为富含碳水化合物的物质30～40份、葡糖淀粉酶0.005～0.02份、水60～70份，富含碳水化合物的物质为大米，玉米，大麦，土豆，山药，薯类中的一种或者几种，稳定剂为黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、结冷胶、瓜尔豆胶中的一种或者几种，甜味剂为阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、异麦芽酮糖醇中的一种或者几种，酸度调节剂为柠檬酸钠、苹果酸钠、乳酸钠中的一种或者几种。

优选的，所述酵母菌的原料包括：20份马铃薯、20份葡萄糖、1-2份琼脂、100份蒸馏水，所述酵母菌种的培养方法如下：

B1、先将马铃薯去皮，切片，称20份并加100份蒸馏水，煮沸半小时，用纱布过滤，10分钟后，制成20％的马铃薯汁；

B2、在20％的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分钟；

B3、加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

B4、取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊；

B5、用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30℃再培养24小时或稍长；

B6、马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落，挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养的酵母菌种。

优选的，所述芽孢杆菌种包括了枯草芽孢杆菌或蜡质芽孢杆菌、乙基纤维素、羧甲基纤维素、白炭黑和泥炭土，其主要成分为降克枯草芽孢杆菌；15-18份乙基纤维素；2-10份羧甲基纤维素；1-10份白炭黑；81.5-42份泥炭土，以及菌块外包被的生物降解无纺布。

优选的，所述营养激活剂为金属微元素培养液，主要包括锌、铁微元素。

(三)有益效果

本发明提供了一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，具备以下有益效果：

(1)该一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，该生物制剂在水中溶解，利用多菌种微生物能快速分解有机质，降低氨氮，亚硝酸盐等有害因子，净化了水质。

(2)该一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，该生物制剂中富含多种生物活性有机酸和氨基酸，具有较强的解毒作用，能够稳定藻相，调节了酸碱度，也保证了克氏原螯虾自身的干净。。

(3)该一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，该生物制剂调节肠道微生物生态菌群结构，有主消化，减少肠炎，缓解了“白便”症状，降低了白浊病患病的概率，增加了克氏原螯虾的存活率。

具体实施方式

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、

一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，它是由人工培养菌种，利用培养基中的真菌溶液进行发酵，再配合纯净水制成，它主要成分包括15份乳酸菌种、15份酵母菌种、15份芽孢杆菌种、3.5份营养激活剂和35份水，营养激活剂为金属微元素培养液，主要包括锌、铁微元素。

具体的制备工艺包括以下步骤：

S1、按照重量比例取出15份乳酸菌种、15份酵母菌种、15份芽孢杆菌种、3.5份营养激活剂和35份水放入培养基中，其中乳酸菌种、酵母菌、杆菌；

S2、将培养基放置于培养室中2-5小时，培养基的温度为30-50℃，PH为8-9碱性环境；

S3、在培养基中注入3.5份的水，发酵20小时左右，然后将培养基中液体取出，最终利用纯净水在常温下稀释五倍，然后装袋，即可。

乳酸菌种的培养包括发酵基质10～20份、稳定剂0.2～0.5份、甜味剂0.01～0.02份、酸度调节剂0.001～1份、食用香精0.001～0.5份、抗氧化剂0.001～0.5份、防腐剂0.001～0.5份、乳酸菌0.0001～0.001份、水75～86份，其发酵步骤如下：

A1、发酵基质处理：将富含碳水化合物的物质粉碎后加到温度为40～50℃的水中，搅拌均匀后加入葡糖淀粉酶，然后保温30～90min；然后迅速在10～35min内将温度升至75～80℃，再保温60～90min，然后经过100目过滤后取上清，既得处理好的发酵基质；

A2、发酵液的制备：将稳定剂、甜味剂、酸度调节剂、防腐剂加入700L水中，保持温度在121～124℃，高压灭菌20～30min，得到发酵初液；然后将抗氧化剂加入纯化水中并经过0.22um孔径过滤，等抗氧化剂水溶液在降温至37～40℃时，加入上述发酵初液中，得到发酵液；

A3、接种：将步骤A1处理好的发酵基质加入步骤A2得到的发酵液中后，降温至温度为35～37℃时，接种乳酸菌；

A4、产品分装：在发酵的第三天加入0.5～2kg食用香精，搅拌均匀后进行产品分装。

其中，发酵基质配方采用重量比为富含碳水化合物的物质30～40份、葡糖淀粉酶0.005～0.02份、水60～70份，富含碳水化合物的物质为大米，玉米，大麦，土豆，山药，薯类中的一种或者几种，稳定剂为黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、结冷胶、瓜尔豆胶中的一种或者几种，甜味剂为阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、异麦芽酮糖醇中的一种或者几种，酸度调节剂为柠檬酸钠、苹果酸钠、乳酸钠中的一种或者几种。

酵母菌的原料包括：20份马铃薯、20份葡萄糖、1-2份琼脂、100份蒸馏水，酵母菌种的培养方法如下：

B1、先将马铃薯去皮，切片，称20份并加100份蒸馏水，煮沸半小时，用纱布过滤，10分钟后，制成20％的马铃薯汁；

B2、在20％的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分钟；

B3、加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

B4、取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊；

B5、用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30℃再培养24小时或稍长；

B6、马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落，挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养的酵母菌种。

芽孢杆菌种包括了枯草芽孢杆菌或蜡质芽孢杆菌、乙基纤维素、羧甲基纤维素、白炭黑和泥炭土，其主要成分为降克枯草芽孢杆菌；15-18份乙基纤维素；2-10份羧甲基纤维素；1-10份白炭黑；81.5-42份泥炭土，以及菌块外包被的生物降解无纺布。

实施例2、

一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，它是由人工培养菌种，利用培养基中的真菌溶液进行发酵，再配合纯净水制成，它主要成分包括10份乳酸菌种、10份酵母菌种、10份芽孢杆菌种、2份营养激活剂和20份水，营养激活剂为金属微元素培养液，主要包括锌、铁微元素。

具体的制备工艺包括以下步骤：

S1、按照重量比例取出10份乳酸菌种、10份酵母菌种、10份芽孢杆菌种、2份营养激活剂和20份水放入培养基中，其中乳酸菌种、酵母菌、杆菌；

S2、将培养基放置于培养室中2-5小时，培养基的温度为30-50℃，PH为8-9碱性环境；

S3、在培养基中注入3.5份的水，发酵20小时左右，然后将培养基中液体取出，最终利用纯净水在常温下稀释五倍，然后装袋，即可。

乳酸菌种的培养包括发酵基质10～20份、稳定剂0.2～0.5份、甜味剂0.01～0.02份、酸度调节剂0.001～1份、食用香精0.001～0.5份、抗氧化剂0.001～0.5份、防腐剂0.001～0.5份、乳酸菌0.0001～0.001份、水75～86份，其发酵步骤如下：

A1、发酵基质处理：将富含碳水化合物的物质粉碎后加到温度为40～50℃的水中，搅拌均匀后加入葡糖淀粉酶，然后保温30～90min；然后迅速在10～35min内将温度升至75～80℃，再保温60～90min，然后经过100目过滤后取上清，既得处理好的发酵基质；

A2、发酵液的制备：将稳定剂、甜味剂、酸度调节剂、防腐剂加入700L水中，保持温度在121～124℃，高压灭菌20～30min，得到发酵初液；然后将抗氧化剂加入纯化水中并经过0.22um孔径过滤，等抗氧化剂水溶液在降温至37～40℃时，加入上述发酵初液中，得到发酵液；

A3、接种：将步骤A1处理好的发酵基质加入步骤A2得到的发酵液中后，降温至温度为35～37℃时，接种乳酸菌；

A4、产品分装：在发酵的第三天加入0.5～2kg食用香精，搅拌均匀后进行产品分装。

其中，发酵基质配方采用重量比为富含碳水化合物的物质30～40份、葡糖淀粉酶0.005～0.02份、水60～70份，富含碳水化合物的物质为大米，玉米，大麦，土豆，山药，薯类中的一种或者几种，稳定剂为黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、结冷胶、瓜尔豆胶中的一种或者几种，甜味剂为阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、异麦芽酮糖醇中的一种或者几种，酸度调节剂为柠檬酸钠、苹果酸钠、乳酸钠中的一种或者几种。

酵母菌的原料包括：20份马铃薯、20份葡萄糖、1-2份琼脂、100份蒸馏水，酵母菌种的培养方法如下：

B1、先将马铃薯去皮，切片，称20份并加100份蒸馏水，煮沸半小时，用纱布过滤，10分钟后，制成20％的马铃薯汁；

B2、在20％的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分钟；

B3、加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

B4、取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊；

B5、用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30℃再培养24小时或稍长；

B6、马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落，挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养的酵母菌种。

芽孢杆菌种包括了枯草芽孢杆菌或蜡质芽孢杆菌、乙基纤维素、羧甲基纤维素、白炭黑和泥炭土，其主要成分为降克枯草芽孢杆菌；15-18份乙基纤维素；2-10份羧甲基纤维素；1-10份白炭黑；81.5-42份泥炭土，以及菌块外包被的生物降解无纺布。

实施例3、

一种抑制克氏原螯虾白浊病的生物制剂及其制作方法，它是由人工培养菌种，利用培养基中的真菌溶液进行发酵，再配合纯净水制成，它主要成分包括20份乳酸菌种、20份酵母菌种、20份芽孢杆菌种、5份营养激活剂和50份水，营养激活剂为金属微元素培养液，主要包括锌、铁微元素。

具体的制备工艺包括以下步骤：

S1、按照重量比例取出20份乳酸菌种、20份酵母菌种、20份芽孢杆菌种、5份营养激活剂和50份水放入培养基中，其中乳酸菌种、酵母菌、杆菌；

S2、将培养基放置于培养室中2-5小时，培养基的温度为30-50℃，PH为8-9碱性环境；

S3、在培养基中注入3.5份的水，发酵20小时左右，然后将培养基中液体取出，最终利用纯净水在常温下稀释五倍，然后装袋，即可。

乳酸菌种的培养包括发酵基质10～20份、稳定剂0.2～0.5份、甜味剂0.01～0.02份、酸度调节剂0.001～1份、食用香精0.001～0.5份、抗氧化剂0.001～0.5份、防腐剂0.001～0.5份、乳酸菌0.0001～0.001份、水75～86份，其发酵步骤如下：

A1、发酵基质处理：将富含碳水化合物的物质粉碎后加到温度为40～50℃的水中，搅拌均匀后加入葡糖淀粉酶，然后保温30～90min；然后迅速在10～35min内将温度升至75～80℃，再保温60～90min，然后经过100目过滤后取上清，既得处理好的发酵基质；

A2、发酵液的制备：将稳定剂、甜味剂、酸度调节剂、防腐剂加入700L水中，保持温度在121～124℃，高压灭菌20～30min，得到发酵初液；然后将抗氧化剂加入纯化水中并经过0.22um孔径过滤，等抗氧化剂水溶液在降温至37～40℃时，加入上述发酵初液中，得到发酵液；

A3、接种：将步骤A1处理好的发酵基质加入步骤A2得到的发酵液中后，降温至温度为35～37℃时，接种乳酸菌；

A4、产品分装：在发酵的第三天加入0.5～2kg食用香精，搅拌均匀后进行产品分装。

其中，发酵基质配方采用重量比为富含碳水化合物的物质30～40份、葡糖淀粉酶0.005～0.02份、水60～70份，富含碳水化合物的物质为大米，玉米，大麦，土豆，山药，薯类中的一种或者几种，稳定剂为黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、结冷胶、瓜尔豆胶中的一种或者几种，甜味剂为阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、异麦芽酮糖醇中的一种或者几种，酸度调节剂为柠檬酸钠、苹果酸钠、乳酸钠中的一种或者几种。

酵母菌的原料包括：20份马铃薯、20份葡萄糖、1-2份琼脂、100份蒸馏水，酵母菌种的培养方法如下：

B1、先将马铃薯去皮，切片，称20份并加100份蒸馏水，煮沸半小时，用纱布过滤，10分钟后，制成20％的马铃薯汁；

B2、在20％的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分钟；

B3、加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

B4、取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊；

B5、用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30℃再培养24小时或稍长；

B6、马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落，挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养的酵母菌种。

芽孢杆菌种包括了枯草芽孢杆菌或蜡质芽孢杆菌、乙基纤维素、羧甲基纤维素、白炭黑和泥炭土，其主要成分为降克枯草芽孢杆菌；15-18份乙基纤维素；2-10份羧甲基纤维素；1-10份白炭黑；81.5-42份泥炭土，以及菌块外包被的生物降解无纺布。

实验例、

取四千只同期的克氏原螯虾每1000只分为一组，共分成四组实验组，五组实验组在同样的环境下养殖，其除了克氏原螯虾生物制剂不同外，其他条件均相同，前三组按照实施例1-3中的配方试剂进行饲养，最后一组不使用生物制剂进行饲养，最终成表记录每组克氏原螯虾的存活率数据如下：

一组克氏原螯虾为三个月后存活率为93.5％；

二组克氏原螯虾三个月后存活率为96.6％；

三组克氏原螯虾三个月后存活率为92.6％；

四组克氏原螯虾为三个月后存活率为81.5％。

对比出本发明中的克氏原螯虾的生物制剂具有显著的提高单个克氏原螯虾的重量，同时可也可以显著的降低克氏原螯虾的死亡率。

使用方法：将本品加入自来水或干净的井水，搅拌均匀后密封，静置培养24-30小时即可使用，温度越高培养时间越短，每袋加入水约四十公斤和半斤红糖进行发酵，可以用10-15亩。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。