阅读说明：本技术 一种治疗腹泻的四联活菌制剂及其应用 (Quadruple viable bacteria preparation for treating diarrhea and application thereof ) 是由 德艳艳 廖洪 张艳花 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗腹泻的四联活菌制剂及其应用,包括5-50％益生菌混合物、6-10％低聚木糖,余量为葡萄糖,益生菌混合物包括动物双歧杆菌冻干粉、副干酪乳酸杆菌冻干粉、屎肠球菌冻干粉和酿酒酵母菌冻干粉。本发明的双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌复合活菌制剂用于治疗犬肠道菌群失调引起腹泻,该制品对犬肠道菌群失调引起的腹泻症状有明显的治疗效果。且双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌四种菌具有很好的耐酸耐胆盐效果,其组合物能有效改善肠道菌群结构、抑制病原菌、增加肠道有益菌群,提高机体免疫力,以达到防病、治病的效果。(The invention discloses a tetragenous viable bacteria preparation for treating diarrhea and application thereof, wherein the tetragenous viable bacteria preparation comprises 5-50% of probiotic mixture, 6-10% of xylooligosaccharide and the balance of glucose, and the probiotic mixture comprises animal bifidobacterium freeze-dried powder, lactobacillus paracasei freeze-dried powder, enterococcus faecium freeze-dried powder and saccharomyces cerevisiae freeze-dried powder. The composite live bacterium preparation of bifidobacterium, lactobacillus, enterococcus faecium and saccharomyces cerevisiae is used for treating diarrhea caused by dog intestinal flora imbalance, and has an obvious treatment effect on diarrhea symptoms caused by dog intestinal flora imbalance. The composition can effectively improve the intestinal flora structure, inhibit pathogenic bacteria, increase the intestinal beneficial flora and improve the immunity of the organism so as to achieve the effects of preventing and treating diseases.)

一种治疗腹泻的四联活菌制剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种治疗腹泻的四联活菌制剂及其应用。

背景技术

动物肠道的菌群平衡对消化道的健康状态有重要影响。以犬科类动物为代表的宠物市场，主流的药物为抗生素。虽然其在一段时间上很好的控制了各种病原菌的发展，如空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌及一些病毒性疾病造成的肠道菌群紊乱的病症见效较快，但使用抗生素后的弊端也逐渐显现，比如耐药病原菌的产生，药物在畜牧产品中的残留，抗生素也可消灭敏感的具有保护屏障和拮抗外袭菌作用的有益菌，加重菌群失调，继而产生诸如呕吐、腹泻、食欲不振等一系列肠道菌群紊乱的典型症状，并且引起真菌感染加重腹泻。因此我们需注意腹泻病犬，在临床实践中治疗腹泻时不应盲目使用抗生素进行治疗，防止进一步加剧菌群的紊乱，而应考虑合理使用微生态制剂进行治疗。而且由医源性、食源性等外因造成的病症都可通过益生菌剂加以调节恢复。随着人们对抗生素所产生严重弊端的认识，益生菌逐渐取代抗生素，具有无副作用且能促进动物生长等各种优点，受到人们的广泛关注。同时，一些非感染性因素如饲粮转换过快过频、营养结构不当、环境应激等外源因素也可造成犬的肠道菌群失调。

但目前国内市场上犬用微生态制剂产品参差不齐，且尚无犬用微生态制剂药品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗腹泻的四联活菌制剂及其应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种治疗腹泻的四联活菌制剂，包括5-50％益生菌混合物、6-10％低聚木糖，余量为葡萄糖；

所述益生菌混合物包括动物双歧杆菌冻干粉、副干酪乳酸杆菌冻干粉、屎肠球菌冻干粉和酿酒酵母菌冻干粉。

进一步的，所述动物双歧杆菌、副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的活菌数比为10-20:10-20:1-2:1-2。

进一步的，所述动物双歧杆菌B1014菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，所述副干酪乳酸杆菌L1056菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，所述屎肠球菌EF1012菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g，所述酿酒酵母菌S1072菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g。

进一步的，所述副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率高于70％；所述动物双歧杆菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率为58.3％，所述动物双歧杆菌和酿酒酵母菌在0.3％的3号胆盐中培养4h菌株存活率高于50％，所述副干酪乳酸杆菌和屎肠球菌在0.3％的3号胆盐中培养2h菌株存活率高于30％。

本发明的另一个目的是公开一种治疗腹泻的四联活菌制剂的应用，其特征在于：所述四联活菌制剂用于治疗由犬肠道菌群失衡引起的腹泻。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌复合活菌制剂用于治疗犬肠道菌群失调引起的腹泻，该制品对犬肠道菌群失调引起的腹泻症状有明显的治疗效果，且双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌能有效改善肠道菌群结构、抑制病原菌、提高机体免疫力，以达到防病、治病的效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种治疗腹泻的四联活菌制剂，包括5％益生菌混合物、6％低聚木糖，余量为葡萄糖；

益生菌混合物包括动物双歧杆菌冻干粉、副干酪乳酸杆菌冻干粉、屎肠球菌冻干粉和酿酒酵母菌冻干粉。

动物双歧杆菌、副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的活菌数比为10:10:1:1。

动物双歧杆菌B1014菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，副干酪乳酸杆菌L1056菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，屎肠球菌EF1012菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g，酿酒酵母菌S1072菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g。

副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率高于70％；动物双歧杆菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率为58.3％，动物双歧杆菌和酿酒酵母菌在0.3％的3号胆盐中培养4h菌株存活率高于50％，副干酪乳酸杆菌和屎肠球菌在0.3％的3号胆盐中培养2h菌株存活率高于30％。

一种治疗腹泻的四联活菌制剂的应用，其特征在于：所述四联活菌制剂用于治疗由犬肠道菌群失衡引起的腹泻。

实施例2

一种治疗腹泻的四联活菌制剂，包括50％益生菌混合物、10％低聚木糖，余量为葡萄糖；

所述益生菌混合物包括动物双歧杆菌冻干粉、副干酪乳酸杆菌冻干粉、屎肠球菌冻干粉和酿酒酵母菌冻干粉。

动物双歧杆菌、副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的活菌数比为5:5:1:1。

动物双歧杆菌B1014菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，副干酪乳酸杆菌L1056菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，屎肠球菌EF1012菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g，酿酒酵母菌S1072菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g。

副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率高于70％；动物双歧杆菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率为58.3％，动物双歧杆菌和酿酒酵母菌在0.3％的3号胆盐中培养4h菌株存活率高于50％，副干酪乳酸杆菌和屎肠球菌在0.3％的3号胆盐中培养2h菌株存活率高于30％。

一种治疗腹泻的四联活菌制剂的应用，其特征在于：所述四联活菌制剂用于治疗由犬肠道菌群失衡引起的腹泻。

实施例3

一种治疗腹泻的四联活菌制剂，包括25％益生菌混合物、8％低聚木糖，余量为葡萄糖；

益生菌混合物包括动物双歧杆菌冻干粉、副干酪乳酸杆菌冻干粉、屎肠球菌冻干粉和酿酒酵母菌冻干粉。

动物双歧杆菌、副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的活菌数比为15:15:2:2。

动物双歧杆菌B1014菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，副干酪乳酸杆菌L1056菌株活菌数≥2.0×10⁹CFU/g，屎肠球菌EF1012菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g，酿酒酵母菌S1072菌株活菌数≥2.0×10⁸CFU/g。

副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率高于70％；动物双歧杆菌在pH为3.0的胃酸中培养4h菌株存活率为58.3％，动物双歧杆菌和酿酒酵母菌在0.3％的3号胆盐中培养4h菌株存活率高于50％，副干酪乳酸杆菌和屎肠球菌在0.3％的3号胆盐中培养2h菌株存活率高于30％。

一种治疗腹泻的四联活菌制剂的应用，其特征在于：所述四联活菌制剂用于治疗由犬肠道菌群失衡引起的腹泻。

实施例4

本发明提供的四联活菌制剂的四种菌株耐酸耐胆盐特性研究

(1)双歧杆菌耐酸耐胆盐特性研究：向1支菌种斜面试管中加入5ml的无菌水，将斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基(摇瓶培养基中的各原料的质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，示蛋白胨0.5％，胰蛋白胨0.5％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，微量盐4％，pH值调至7.4，115℃，20min灭菌备用)中，在37℃静置培养14-16h；

耐酸特性研究：以10％接种量将菌液加入人工胃液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

耐胆盐特性研究：以10％接种量将菌液加入到含0.3％的人工肠液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

(2)乳酸杆菌耐酸耐胆盐特性研究：向1支菌种斜面试管中加入5ml的无菌水，将斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基(摇瓶培养基中的各原料的质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，示蛋白胨0.5％，胰蛋白胨0.5％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，微量盐4％，pH值调至7.0，115℃，20min灭菌备用)中，在37℃静置培养培养14-16h；

耐酸特性研究：以10％接种量将菌液加入人工胃液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

耐胆盐特性研究：以10％的接种量将菌液加入到含0.3％的人工肠液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

(3)屎肠球菌耐酸耐胆盐特性研究：向1支菌种斜面试管中加入5ml的无菌水，将斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基(摇瓶培养基中的各原料的质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，示蛋白胨0.5％，胰蛋白胨0.5％，微量盐4％，pH值调至7.0，115℃，20min灭菌备用)中，在37℃，150r/min摇床培养12-14h；

耐酸特性研究：以10％接种量将菌液加入人工胃液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

耐胆盐特性研究：以10％的接种量将菌液加入到含0.3％的人工肠液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

(4)酿酒酵母菌耐酸耐胆盐特性研究：向1支菌种斜面试管中加入5ml的无菌水，将斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基(摇瓶培养基中的各原料的质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，示蛋白胨0.5％，胰蛋白胨0.5％，微量盐4％，pH值调至6.5，115℃，20min灭菌备用)中，在32℃，220r/min摇床培养12-14h；

耐酸特性研究：以10％接种量将菌液加入人工胃液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

耐胆盐特性研究：以10％的接种量将菌液加入到含0.3％的人工肠液中，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定菌株存活率。

上述微量盐配方为：由0.2g/LCaCl₂，0.48g/LMgSO₄，10g/LNaHCO₃，1.0g/L KH₂PO₄，1.0g/LK₂HPO₄和2.0g/LNaCl组成；

上述四种菌种耐酸特性研究结果见表1，表1为人工胃液处理后的结果。

表1人工胃液处理结果

由表1的实验结果可知，乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的耐胃酸效果较好，在pH为3.0的胃酸中培养4h时存活率仍高于70％。而双歧杆菌的耐胃酸特性略差些，但其在pH为3.0的胃酸中培养4h时存活率也达到58.3％。表明该四种菌株对胃酸的耐受特性较好，可在动物肠道中存活。

上述四种菌种耐胆盐特性研究结果见表2，表2为人工肠液(含胆盐)下的处理结果。

表2人工肠液(含胆盐)处理结果

由表2的试验结果可知，双歧杆菌和酿酒酵母菌在0.3％的3号胆盐中培养4h时菌株存活率高于50％。而乳酸杆菌和屎肠球菌在0.3％的3号胆盐中培养2h时菌株存活率高于30％，表明双歧杆菌和酿酒酵母菌的耐胆盐的效果较好，乳酸杆菌和屎肠球菌的耐胆盐的效果略差。

实施例5：四联活菌制剂治疗腹泻的临床试验

本临床试验共入组240例。适应症：肠道菌群失调引起的腹泻，其中治疗组200例，对照组40例(其中阴性对照组20例，空白对照组20例)。入选犬腹泻病例特征：出现稀便，粪便溏泄，喷射状稀便，排便次数增加；不同程度的乏力，机敏性降低；厌食症状，呕吐反应；以排稀粪便为主要特征。

给药方案：治疗组：小型犬(10kg以下)1g/次，中型犬(10-20kg)2g/次，大型犬(20kg以上)3g/次，每日早晚各1次，连用7天，首次用药剂量加倍；阴性(抗生素)对照组：烟酸诺氟沙星(抗生素)治疗，以诺氟沙星计，犬16mg/kg/次，每日早晚各1次，连用3天；空白对照组：不使用药物治疗。通过观察试验犬的临床症状、粪便状态及检测犬粪便微生物，考察四联活菌制剂的治疗效果。

治疗组、空白对照组及阴性对照组临床观察及治疗情况统计见表3，具体如下所示：

表3临床试验的治疗情况

组别/治疗效果	空白对照组	阴性对照组	治疗组
				有效(例)	15	18	191
复发(例)	1	2	4
				无效(例)	4	0	5
治愈率/％	75％	90％	95.5％
				无效率/％	20％	0	2.5％

从表3中可以看出四联活菌制剂治疗组治愈率高达95％，高于空白对照组及阴性对照组治愈率。表明四联活菌制剂的临床治疗效果较好，在试验期间康复的犬只，精神良好，食欲旺盛，皮毛肤色正常，排便排尿色泽形态正常，无其他异常临床症状。由于微生态制剂可以增加有益菌，维持肠道菌群平衡，使肠粘膜免受病原菌侵害，腹泻犬在康复后不易复发。

表4为犬粪便各菌种活菌计数结果，具体如下表所示：

表4犬粪便各菌种活菌计数结果(logcfu/g)(X±SD,n≥20)

注：表4中“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01)由表4可知各组犬只粪便中在治疗前各种菌群的活菌数基本一致，无显著性差异，而在治疗后各组中各菌群有了较明显的变化。其中肠球菌：治疗组(8.37±0.58)高于阴性对照组(7.50±0.77)和空白对照组(7.81±0.93)；乳酸杆菌：治疗组(7.47±0.70)明显高于阴性对照组(6.45±0.56)和空白对照组(6.89±0.67)；双歧杆菌：治疗组(6.47±0.69)明显高于阴性对照组(5.81±0.58)和空白对照组(6.18±0.81)，且统计学检查差异极显著；而肠杆菌细菌数方面，阴性对照组(5.02±0.66)肠杆菌细菌数最低，其他各组之间差异不显著。研究表明治疗组四联活菌制剂对致病菌有一定的抑制作用，可有效治疗腹泻，帮助犬肠道补充益生菌，并促进益生菌的增殖，有利于维持体内菌群平衡。虽然抗生素对肠杆菌有很好的抑制效果，但同时会消灭敏感的具有保护屏障和拮抗外袭菌作用的有益菌，加重犬肠道菌群失调，不利于犬的健康生长。因此本发明提供的四联活菌制剂可以有效治疗腹泻、抑制肠道致病菌的生长，维持肠道菌群平衡，提高机体免疫力。

本发明的双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌复合活菌制剂具有改善动物肠道微生态环境，增加肠道有益菌群的功效，用于治疗犬肠道菌群失调引起的腹泻，该制品对犬肠道菌群失调引起的腹泻症状有明显的治疗效果，且双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌能有效改善肠道菌群结构、抑制病原菌、提高机体免疫力，以达到防病、治病的效果。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。