阅读说明：本技术 一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂 (Composite microecological preparation for preventing calf diarrhea ) 是由 张文举 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明为一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂。一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂,含有嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌。本发明通过对分离鉴定腹泻犊牛粪便中致病性大肠杆菌,对嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌、枯草芽孢杆菌3株益生菌在耐酸性、耐胆盐及抑菌性生物学特性比较分析发现,三株益生菌均具有较好的耐受性,并通过对三株益生菌的混配对抑制大肠杆菌k99具有较好的抑菌效果；在哺乳期犊牛上进行了应用,它还具有提高犊牛日增重,增加犊牛采食量,降低腹泻率、提高犊牛免疫性能和抗氧化性能的作用,可以调节动物肠道菌群。(The invention relates to a composite microecological preparation for preventing calf diarrhea. A composite microecological preparation for preventing calf diarrhea contains Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces boulardii and Bacillus subtilis. According to the invention, through the comparison and analysis of the biological characteristics of acid resistance, cholate resistance and bacteriostasis of 3 probiotics including lactobacillus acidophilus, saccharomyces boulardii and bacillus subtilis, the pathogenic escherichia coli in the diarrhea calf feces is identified through separation, and the three probiotics have better tolerance and have better bacteriostasis effect on inhibiting escherichia coli k99 through the mixing of the three probiotics; the feed additive is applied to calves in lactation period, has the effects of increasing daily gain of the calves, increasing feed intake of the calves, reducing diarrhea rate, improving immunity and oxidation resistance of the calves, and can adjust intestinal flora of animals.)

一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂

技术领域

本发明属于牲畜领域，具体涉及一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂。

背景技术

在过去的几十年里，抗生素在防治畜禽感染、抵抗疾病方面使用量逐年增加，据报道中国是世界上抗生素生产和消费最多的国家，给畜牧业发展带来生产效益的同时，人类和畜禽所处的生态环境及健康状况也面临的巨大风险，这也导致了人类的生活环境、畜禽养殖环境、畜禽机体等中的病原体和常见细菌耐药性的上升。因此在2003年，全球逐步禁止使用抗生素瑞典与1986年禁止使用抗生素，欧盟也于2006年禁止使用抗生素。随着全球范围内禁止使用抗生素生长促进剂(AGPS)的趋势日益严峻，导致对AGPS替代品的需求日益迫切。

犊牛作为奶牛养殖业的后备力量，对于奶牛生产潜力的发挥具有至关重要的作用，而犊牛腹泻(Calf diarrhea)是导致犊牛死亡的主要原因。犊牛腹泻是一种常见疾病，对犊牛生长发育危害巨大，其病因复杂，是当前犊牛多发病之一，给养牛业带来较大经济损失。据统计新疆北疆垦区规模化发病率占40-60％不等，死亡率50-70％，导致犊牛腹泻的微生物因素主要有细菌性(平均发病率36.7％)和病毒性(平均发病率7.5％)因素。

研究发现引起新疆地区近两年来犊牛腹泻的致病性大肠杆菌对氨苄西林、庆大霉素、氯霉素和环丙沙星等抗生素均产生不同程度的耐药性。因此，目前迫切需要寻找替代抗生素作为预防性抗菌药物的替代方案。为了提高动物福利和保护环境，饲用微生物因其具有无污染、无残留、绿色的特点且具有提高畜禽生长性能、优化肠道菌群、提高动物机体免疫力等生物学功能而备受关注，许多研究也正是饲用微生态制剂已被认为是潜在的替代品。

有鉴于此，本发明提出一种新的预防犊牛腹泻的复合微生态制剂，可以替代抗生素、预防幼龄犊牛消化道疾病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂，可以替代抗生素、预防幼龄犊牛消化道疾病。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂，所述的复合微生态制剂含有嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌。

进一步地，所述的嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌的活菌数之比为1-3：1-3：1-3。

再进一步地，所述的嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌的活菌数之比为1：2：1或3：3：1。

再进一步地，所述的嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌的活菌数之比为3：3：1。

进一步地，所述的复合微生态制剂为液态制剂。

再进一步地，所述的复合微生态制剂由活菌数浓度均为1×10⁹cfu/mL嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌配比而成。

进一步地，所述的复合微生态制剂用于预防犊牛大肠杆菌K99导致的腹泻。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明以分离致病性大肠杆菌k99和实验室保藏的益生菌为研究对象，比较分析各益生菌株间的生物学特性，筛选出最佳抑制预防犊牛腹泻复合微生态制剂3株菌种的配比优化组合。为开发防治犊牛腹泻的微生态制剂提供理论基础。

同时，本发明的技术方案具有提高犊牛日增重，增加犊牛采食量，降低腹泻率、提高犊牛免疫性能和抗氧化性能的作用，可以调节动物肠道菌群。

附图说明

图1为大肠杆菌的镜检图；

图2为大肠杆菌k99扩增图；

图3为NCBI Genbank进行BLAST结果图；

图4为嗜酸乳杆菌人工胃液不同PH值的耐受性；

图5为芽孢杆菌人工胃液不同PH值的耐受性；

图6为布拉迪酵母菌人工胃液不同PH值的耐受性；

图7为3种益生菌人工肠液不同时间的耐受性；

图8为3种益生菌牛胆盐的耐受性图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体的实施例，对本发明一种预防犊牛腹泻的复合微生态制剂做进一步的详细介绍：

本方面通过采用分子生物学方法分离鉴定腹泻犊牛粪便中致病性大肠杆菌k99。同时对嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌、枯草芽孢杆菌3株益生菌在耐酸性、耐胆盐及抑菌性生物学特性比较分析发现，在pH为3时，存活率为84.34％。芽孢杆菌在pH为5时，存活率为142.24％；在人工胃液中9小时存活率都很高，与0小时的OD₆₀₀相比，布拉迪酵母菌和嗜酸乳杆存活率分别为108.7％、129.73％，嗜酸乳杆菌达到了96.37％。在含有不同浓度的牛胆盐培养基中，布拉迪酵母菌存活率较对照组的存活率最高为60.49％，嗜酸乳杆菌存活率较对照组最高为85.1％，芽孢杆菌存活率较对照组的存活率最高为47.42％。三株益生菌对大肠杆菌、沙门氏菌均有一定的抑菌特性。说明布三株益生菌对人工胃液、人工肠液、牛胆盐具有较好的耐受性，并具有一定的抑菌性。

通过对三株益生菌的不同配比抑制大肠杆菌k99发现，三种益生菌按照不同配比在培养12h后，试验组第1、2、3、4、5、6、7、8、9组较对照组相比差异显著(P＜0.05)，与第2、4、8组之间差异显著(P＜0.05)；在培养24h后，试验组第2、3、4、5、6、8较对照组相比差异显著(P＜0.05)，但第2、3、4、5、6、8之间差异不显著(P＞0.05)。第8个处理组在培养12h后对大肠杆菌K99的抑菌效果较好，从而可以确定嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母菌最佳的复配比例为3:3:1。为开发替代抗生素、预防幼龄犊牛消化道疾病微生态制剂提供理论基础。

具体操作步骤如下：

一微生物制剂对幼龄犊牛消化道疾病的影响

1材料与方法

1.1试验材料

(1)试验菌株

益生菌菌株：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，由石河子大学动物科技学院生物饲料实验室提供。

试验病菌:大肠杆菌(K99)自主分离；沙门氏菌、金黄色葡萄球菌购买于上海鲁微科技有限公司。

(2)培养基：

LB营养琼脂培养基、LB肉汤、麦康凯琼脂培养基、MRS液体培养基、MRS固体培养基、YPD液体培养基、YPD固体培养基、芽孢杆菌培养基均购买于青岛高科园海博生物技术有限公司。

(3)主要试剂

PBS缓冲液，用于菌液的稀释。细菌DNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆盐购买于Beijing Biotopped Science&Technology Co.，Ltd。生理生化鉴定管购于杭州滨河微生物试剂有限公司。K99引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成，测序由华大基因有限公司完成。

(4)主要器材

移液枪；电子天平JM-500，昆山金珂华电子有限公司，电子天平BS224S，北京赛多利斯仪器有限公司；酸度计WTW PH3110，凯铭态仪器；立式超低温保温箱GSP-9160MBE、恒温培养箱HPX-9162MBE、超净工作台SW-CJ-2F，上海***实业有限公司医疗设备厂；酶标仪WD-2102B，BEIJING北京六一生物科技有限公司；PCR仪，上海纳兹仪器有限公司。离心机TG16-W，湘南湘仪实验室仪器开发有限公司

1.2试验方法

1.2.1腹泻犊牛粪便大肠杆菌k99进行细菌分离鉴定

采用棉拭子无菌采集四个某规模化牛场7日龄以内腹泻的犊牛采集腹泻粪样，通过在无菌生理盐水中稀释并在LB肉汤培养基中进行37℃培养，进一步在LB固体培养基中纯化，并分离纯化，革兰氏染色之后镜检，对纯化菌落进行-80℃保存，同时采用试剂盒提取纯化细菌的DNA，采用大肠杆菌k99特异性引物(5’-TATTATCTGGTGGTATGG-3’，5’-GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC-3’)进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件为:采用20uL反应体系:2×master PCR Mix lOuL，DNA模板3uL、上下游引物各0.5uL(引物浓度为20umol/L)，加灭菌超纯水至20uL。94℃5min预变性；94℃、30s变性；52.6℃、30s退火；72℃、30s延伸；循环35次，72℃延伸10min。对扩增产物进行回收并进行测序，同时对大肠杆菌K99菌株进行生理生化鉴定。

1.2.2菌种的活化和活菌含量测定

菌株活化：将3种菌株接种于相应的液体培养基中37℃摇床培养18h使用接种环在MRS固体培养基、YPD固体培养基、芽孢杆菌培养基中涂面和划线，挑取单个菌株接种到MRS肉汤培养基、YPD肉汤培养基、芽孢杆菌肉汤培养基中，其中嗜酸乳杆菌于37℃培养静置培养24h，布拉迪酵母菌和枯草芽孢杆菌37℃培养静置培养24h，活化2-3代，备用。

活菌含量测定：无菌条件下，将活化2代的益生菌(嗜酸乳杆菌，枯草芽孢杆菌，布拉迪酵母菌、大肠杆菌)进行梯度稀释，将悬浊液10倍倍比稀释至10^-7、10^-8、10^-9，然后取三个稀释度的菌液各100uL进行平板涂布，每个稀释度涂布三个平板，37℃倒置培养12-24h后，进行菌落计数。

1.2.3三种益生菌不同pH值耐受性试验

人工胃液制备：取质量分数为0.1kg/L的盐酸16.4mL，将其pH值调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0。然后加入胃蛋白酶，比例为0.01g/mL，待其溶解均匀后，微孔滤膜除菌，备用。将已经活化的嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌、枯草芽孢杆菌按照1％接种比例接种到上述不同PH值的胃蛋白酶溶液中，37℃恒温培养箱中培养3h，测定OD₆₀₀。

1.2.4人工肠液耐受性试验

人工肠液制备:准确称取KH₂P0₄3.4g，加蒸馏水250mL溶解，用质量分数4g/L NaOH溶液调pH至6.8，加入胃蛋白酶，使其浓度为0.01g/mL，待其溶解均匀后，微孔滤膜除菌，置于4℃冰箱备用。将活化后的3株益生菌菌株分别以10％接种量接入到上述人工肠液中，每个处理重复3次，37℃培养，分别在0、3、6、9小时取样，用酶标仪测定各菌株的OD₆₀₀值。

1.2.5胆盐耐受性试验

分别向MRS、YPD、芽孢杆菌液体培养基中添加牛胆盐，使其配制成牛胆盐浓度分别为0.15g/L、0.3g/L和0.06g/L的培养基。然后将3种培养基在118℃的条件下灭菌15分钟，冷却之后备用。把上述己活化菌种分别接种到上述配制的相应牛胆盐培养基中，以未加胆盐的培养基作参照，37℃的恒温条件下培养8h，观察菌种的生长情况，测OD₆₀₀，计算存活率。

1.2.6抑菌性试验

将分离的大肠杆菌k99、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别培养24h，按20倍稀释，取100uL致病菌液均匀涂布到事先准备好的无菌琼脂平板上。采用牛津杯及打孔发法，37℃培养12-24h，测定抑菌圈直径，以无菌普通液体培养基作对照。

1.2.73株菌种抑制大肠杆菌k99的配比优化

将活化好的3株益生菌，稀释为10^-1的稀释悬液。然后再将稀释至相同浓度(1×10⁹cfu/mL)，按照表1中种不同配比比例进行接种，并设置对照组，共11组，分别加入到一定量的LB液体培养基中，使其终体积为5mL，于37℃，165rpm进行摇床培养。培养时间设置为12h和24h。之后进行梯度稀释，取10^-6、10^-7、10^-7100uL涂布麦康凯琼脂培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h后进行大肠杆菌计数，同时设定对照组。

表1三种益生菌不同配比的接种量单位：uL

1.2.8检测指标：

检测OD₆₀₀值及大肠杆菌K99活菌数。

1.2.9数据分析：

试验数据采用Spss21.0统计软件对单因素方差分析(ONE-WAY ANONA)和Duncan氏多重分析，结果用“平均值士标准差”表示，P<0.05为差异显著。

2.结果与分析

2.1腹泻犊牛粪便大肠杆菌k99进行细菌分离鉴定

大肠杆菌纯化菌落经革兰氏染色，镜检为G^-，短杆状，结果如图1所示，大肠杆菌k99扩增图2；在NCBI Genbank进行BLAST，结果显示相似度为99.99％，如图3所示。生化鉴定如表2所示。

同时采用分离的大肠杆菌k99对小鼠进行攻毒，每小鼠注射0.2mL培养18小时的大肠杆菌菌液，结果显示80％小鼠死亡。证明分离的大肠杆菌k99具有较强的毒力。

表2大肠杆菌k99生理生化鉴定表

2.2三种益生菌不同pH值耐受性试验

试验果如图4-6所示，三种益生菌在不同pH值培养条件下都具有较好的耐受性，其中嗜酸乳杆菌在pH为5时，存活率达到了118.75％，在pH为3时，存活率为84.34％。

布拉迪酵母菌对不同pH值均表现成活率达到了100％以上。芽孢杆菌在pH为5时，存活率为142.24％，在不同的pH条件下，存活率均达到了100％以上，具有较好的耐受性。

2.3三种益生菌人工肠液耐受性试验

结果如图7所示，三种益生菌对人工肠液在不同的培养时间下具有较好的耐受性，三种益生菌在人工胃液中9小时存活率都很高，与0小时的OD₆₀₀相比，布拉迪酵母菌和嗜酸乳杆存活率分别为108.7％、129.73％，嗜酸乳杆菌达到了96.37％。

2.4三种益生菌胆盐耐受性试验

结果如图8所示：随着牛胆盐浓度的提高，布拉迪酵母菌存活率较对照组的存活率分别为50.64％、60.49％、46.37％，嗜酸乳杆菌存活率较对照组分别为81.65％、85.1％、81.19％，芽孢杆菌存活率较对照组的存活率分别为45.1％、45.11％、47.42％。布拉迪酵母菌和嗜酸乳杆菌对牛胆盐的耐受能力较强，而芽孢杆菌较弱。

2.5三种益生菌的抑菌性试验

结果如表3所示，布拉迪酵母菌、嗜酸乳杆菌、芽孢杆菌、对大肠杆菌、沙门氏菌均有一定的抑菌特性，嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌性较强，布拉迪酵母菌、嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌抑菌性较差。

表3三种益生菌的抑菌圈直径

2.6三株菌种抑制大肠杆菌k99的配比优化

嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌、芽孢杆菌按不同配比组合，在培养12h、24h后对牛源大肠杆菌K99的体外抑菌试验结果如表4所示。

表4三种益生菌制剂按不同配比对大肠杆菌k99的体外抑菌试验(n＝3)logcfu/mL

同行无字母或数据肩标相同字母，表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

从表4可以看出，三种益生菌按照不同配比在培养12h后，试验组第1、2、3、4、5、6、7、8、9组较对照组相比差异显著(P＜0.05)，第10组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，第1、3、5、6、7、9、10组之间差异不显著(P＞0.05)，与第2、4、8组之间差异显著(P＜0.05)；在培养24h后，试验组第2、3、4、5、6、8较对照组相比差异显著(P＜0.05)，但第2、3、4、5、6、8之间差异不显著(P＞0.05)，试验组第1、2、7、9、10组较对照组相比差异不显著(P＞0.05)。

综上，结合实际应用中，牛肠道蠕动12h后复合微生物制剂被排出，第8个处理组在培养12h后对大肠杆菌K99的抑菌效果较好，从而可以确定嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母菌最佳的复配比例为3:3:1。

益生菌的益生特性分析：

由于本研究是针对犊牛大肠杆菌K99研究复合益生菌，所以根据初生犊牛的消化系统发育不完善特点，主要依靠皱胃和小肠来消化吸收日粮中的营养物质，并且在两周龄以内的犊牛不出现反刍行为，其消化功能的特征基本上类似于单胃动物，而此时犊牛的消化道酸度pH值波动较大，对其消化生理具有较大的影响，研究表明犊牛进食前后皱胃pH值24h变化较大，犊牛在饲喂前皱胃pH值在1.5-2.0之间，饲喂之后皱胃pH值可以从1.5升高到6.0，之后又会降低到1.5-2.0之间，可见犊牛的皱胃pH在进食前后波动较大，但随着进食时间也会呈现稳定的状态。犊牛不同肠断中胰蛋白酶也有所不同，其中十二指肠中活性最低，空肠最高，回肠次之。犊牛肠道内胆汁浓度是不断变化的，因而很难预测其在某一时间段内的浓度，但总的来说，小肠中胆盐含量通常在0.03-0.3％。

而益生菌体外鉴定已广泛应用于评价候选菌的益生菌潜能。包括对胃液和胆盐含量的耐受性、抗菌作用等。益生菌能够在动物机体存活的一个重要特征是其耐受胃的酸性条件和小肠中胆汁盐能力。

本实验结果表明三株益生菌嗜酸乳杆菌、芽孢杆菌、布拉迪酵母菌对酸性条件、牛胆盐、胰蛋白酶的均具有较高的耐受性。

嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母菌不同配比对大肠杆菌(K99)的抑菌作用：

饲用微生物添加剂为一种活性制剂，由于具有绿色、无污染，在促进动物生长、肠道健康等方面的应用取得了前所未有的发展，在操纵宿主的健康轨迹(包括和超越免疫成分)中起着很大的作用，且具有促进营养物质吸收、调节肠道菌群结构及提高畜禽机体免疫力等生物学功能。

嗜酸乳杆菌是一种典型的益生菌，具有抑制肠道病原体、促进免疫细胞的稳态及肠道健康、具有抑制产肠毒素大肠杆菌K99的作用等生理作用。有研究表明嗜酸乳杆菌菌在菌株在pH 3中存活率较高、含有胆盐的培养基中具有较强的生存能力，且临界浓度为0.3％，表明该菌株在通过小肠时具有抵抗其抗菌作用的能力。

布氏酵母菌是急性胃肠炎(AGE)中研究得最好的益生菌之一，被证明是安全的。布拉迪酵母菌具有抗毒素，布拉迪酵母菌分泌的磷酸酶可以显著破坏大肠杆菌分泌的内毒素。对鼠伤寒沙门氏杆菌、大肠杆菌、白色念球菌等具有抑制生长的作用，它能够提高机体肠道内短链脂肪酸的活性，调节肠道的代谢功能，促进肠道粘膜的营养效应，增强机体的免疫功能，防治病原性感染的作用增加机体SCFA的含量。由于它是好氧菌，并且具有较高的粘附性，能够消耗肠道内的氧气同时分解过氧化氢，促进厌氧菌的增值，并且能够调节因抗生素使用不当而引起的菌群失衡，从而促进肠道菌群平衡。在家禽、猪、水产上应用研究已有相关报道，但是在反刍动物尤其是犊牛上的研究较少。在犊牛上应用具有增加犊牛日增重，降低腹泻率，提高免疫力等作用。

枯草芽抱杆菌在动物机消化道内的含量较少。由于其实耗氧菌，能够快速消耗动物消化道内的氧气，使其产生厌氧的环境，抑制有害致病菌的生长。同时，芽抱杆菌具有杀菌作用，其产生的代谢产物中的细菌素能够有效的杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等病原性菌群，从而维持动物机体的健康。

在本试验中，通过对分离鉴定腹泻犊牛粪便中致病性大肠杆菌，对嗜酸乳杆菌、布拉迪酵母菌、枯草芽孢杆菌3株益生菌在耐酸性、耐胆盐及抑菌性生物学特性比较分析发现，三株益生菌均具有较好的耐受性，并通过对三株益生菌的不同配比抑制大肠杆菌k99发现，确定嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母菌最佳的复配比例为3:3:1时具有较好的抑菌效果，可用于后期开发替代抗生素、预防幼龄犊牛消化道疾病提供理论基础。

二微生态制剂对犊牛生长性能、腹泻率、血液免疫指标和抗氧化性能的影响

试验选用5日龄犊牛40头，随机分为4组，每组10头，每个重复1头牛。Ⅰ组为对照组，饲喂等量的生理盐水，Ⅱ组饲喂微生物制剂0.5g，Ⅲ组饲喂微生物制剂1g，Ⅳ组饲喂微生物制剂2g，验期为8周，分别与试验开始第0、2、4、6、8周采集试验数据。以生长性能、腹泻率、血液免疫指标和抗氧化性能作为评价指标。

微生物制剂为表4中的第8个微生物制剂。

(一)试验方法和数据采集

1、生长性能、采食量、粪便评分

(1)采食量：每天记录犊牛代乳品、开食料和苜蓿的采食量。

(2)粪便评分：根据评分标准(表)评估试验犊牛粪便情况。1分，正常形状；2分，软并松散；3分，松散呈水样；4分，水样、粘液、少量血丝；5分，水样、粘液、大量血丝。当粪便被评为3分及以上时记为腹泻。

腹泻率(％)＝Σ(腹泻头数×腹泻天数)/(总头数×试验天数)×100。

2、血清样品采集与测定

与饲养第2、4、6、周龄当天晨饲前用含肝素钠的真空采血管颈静脉采血5mL，室温下静置30min，然后3000r/min离心15min，取血清装入1.5mL的冻存管中，标注组别及牛号，采样日期，液氮保存。测血清中Ig A、Ig G、Ig M、IL-2、IL-4、IL-1β和TNF-α的浓度，测定血清总蛋白((TP)、球蛋白(Glb)、白蛋白(Alb)、葡萄糖(Glu)，尿素氮(BUN)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐、谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)浓度。

3、粪样采集：

(1)液氮冻存粪样：分别于犊牛0、2、4、6、8周龄晨饲前采集粪样置于50ml离心管中，每组随机选取6头牛直肠取粪，每头牛采集的粪样分装6个小管。液氮冻存。

4、血液免疫指标和抗氧化性能

采用试剂盒检测。

(二)结果：

1、复合益生菌对犊牛生长性能的影响

如表5所示，在第2周，试验组Ⅲ的平均日增重高于对照组Ⅰ，差异有显著性(P<0.05)，但各组间无显著性差异(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组平均日采食量高于Ⅰ组(P<0.05)，但各组间差异无显著性(P>0.05)。4wk时，各组间的平均日增重和平均日采食量无显著性差异(P>0.05)。6wk时，Ⅱ、Ⅲ组日增重显著高于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.05)，Ⅱ、Ⅳ组与Ⅰ组比较差异有显著性(P<0.05)。8wk时，各组间ADG无显著性差异(P>0.05)，但Ⅱ、Ⅳ组ADG高于Ⅰ组。与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组比较，Ⅳ组的admi有显著性差异(P<0.05)，而Ⅱ组与Ⅲ组之间无显著性差异(P>0.05)。

表5复合微生态制剂对犊牛生长性能的影响

在同一行中，标注不同小写字母表示差异有显著性(P＜0.05)，相同或无字母上标均无显著性差异(P＞0.05)，下同。ADG(平均日增重)、ADMI(日均采食量)。

2、复合益生菌对犊牛粪便评分和腹泻率的影响

表6复合微生态制剂对犊粪便评分和腹泻率的影响

从表6可以看出，粪便评分在2WK和4WK时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组粪便评分组间无显著性差异(P>0.05)，Ⅱ、Ⅳ组粪便评分组间无显著性差异(P>0.05)，Ⅰ、Ⅲ组较Ⅳ粪便评分组间显著性差异显著(P<0.05)；在6WK和8WK时，各组组之间差异不显著(P>0.05)。

在2WK和4WK时，试验组较对照组的腹泻率有所降低，在2WK时，Ⅳ组较Ⅰ组降低了51.65％，在4WK时，Ⅳ组腹泻率为0。

3、复合益生菌对哺乳犊牛免疫功能的影响

如表7所示，不同周龄犊牛血清中IgA含量不同。第2周时，Ⅱ、Ⅳ差异显著(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ显著高于Ⅰ(P<0.05)；第4周，Ⅲ、Ⅳ差异极显著(P<0.001)，Ⅱ、Ⅲ差异显著(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ差异不显著(P>0.05)0.05)，Ⅲ、Ⅳ间差异显著(P<0.001)，Ⅱ、Ⅲ差异显著(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ之间差异不显著(P>0.05)；6wk时，Ⅱ、Ⅳ组间差异极显著(P<0.05)(P<0.001)，Ⅲ与Ⅰ、Ⅱ差异显著(P<0.05)，Ⅳ与Ⅰ、Ⅱ差异显著(P<0.001)；8wk时，Ⅳ与Ⅰ差异显著(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ无显著性差异(P>0.05)。

不同周龄犊牛血清IgM水平不同。第2周时，Ⅱ、Ⅳ差异显著(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ显著高于Ⅰ(P<0.05)；第4周，Ⅲ、Ⅳ差异极显著(P<0.001)，Ⅱ、Ⅲ差异显著(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ差异不显著(P>0.05)0.05)，Ⅲ、Ⅳ间差异显著(P<0.001)，Ⅱ、Ⅲ差异显著(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ差异不显著(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ之间差异不显著(P>0.05)；6wk时，Ⅱ、Ⅳ组间差异极显著(P<0.05)(P<0.001)，Ⅲ与Ⅰ、Ⅱ差异显著(P<0.05)，Ⅳ与Ⅰ、Ⅱ差异显著(P<0.001)；8wk时，Ⅳ与Ⅰ差异显著(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ无显著性差异(P>0.05)。

IgM在2wk时，Ⅲ、Ⅳ组较Ⅰ组差异极显著(P<0.001)，Ⅲ组较Ⅱ差异显著(P<0.05)，Ⅲ组、Ⅳ组差异不显著(P>0.05)，Ⅰ、Ⅱ差异不显著(P>0.05)；

4wk时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组较Ⅰ组差异显著(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)；

6wk时，Ⅳ较Ⅰ差异显著(P>0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)；

8wk时，Ⅳ较Ⅰ、Ⅱ差异显著(P>0.05)，Ⅱ组较Ⅰ组差异显著(P<0.05)，Ⅲ组较Ⅰ组差异极显著(P<0.001)，Ⅲ、Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)；

表7复合微生态制剂对哺乳犊牛血清免疫球蛋白含量的影响(ng/L)

4、复合益生菌对哺乳犊牛血清细胞因子含量的影响

如表8所示，不同周龄犊牛血清IL-1β水平不同。第2周时，第2组与第2组比较有显著性差异(P<0.05)，而第1、3、4组间差异无显著性(P>0.05)；第4周时，Ⅰ、Ⅱ组、Ⅲ、Ⅳ组间差异无显著性(P>0.05)，而Ⅲ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05)；6wk时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异有显著性(P<0.05)，差异无显著性(P>0.05)，但Ⅲ组与Ⅳ组之间有显著性差异(P<0.05)；8wk时各组间差异无显著性(P<0.05)；

在第2周和第4周，各组间IL-2的差异无显著性(P>0.05)；在第6周，第4组与第4组之间的IL-2差异显著(P<0.05)；在第3、第3组之间，IL-2的差异无显著性(P>0.05)；在第8周，两组之间的差异无显著性(P>0.05)Ⅳ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组比较差异有显著性(P<0.05)，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)；

在第2周和第6周，各组间IL-2水平无显著性差异(P>0.05)；在第4周，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组之间无显著性差异(P>0.05)，而Ⅲ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05)。8wk时，Ⅲ组与Ⅳ组比较差异有显著性(P<0.05)，而Ⅲ、Ⅳ、Ⅱ、Ⅳ组间差异无显著性(P>0.05)，Ⅰ、Ⅱ组间差异无显著性(P>0.05)。

2周时，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清TNF-α无显著性差异(P>0.05)，而Ⅱ、Ⅳ组间差异显著(P<0.05)；4周时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间无显著性差异(P>0.05)，而Ⅱ、Ⅳ组间无显著性差异，Ⅲ、Ⅳ组(P>0.05)，Ⅳ组与Ⅰ组比较有显著性差异(P<0.05)；6wk时，各组间无显著性差异(P<0.05)；8wk时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间差异无显著性(P>0.05)，Ⅳ组间差异显著(P<0.05)；

表8复合微生态制剂对哺乳犊牛血清抗氧化指标的影响(ng/L)

通过表5-6可知，本申请的微生物制剂不仅仅可以达到减少腹泻的次数，还同时刺激犊牛的食欲，增加采食量。在止泻的同时，及时的补充营养，从两方面快速消除犊牛腹泻的不利影响。表7-8也说明了使用本发明的微生物制剂后，犊牛的细胞免疫和体液免疫力快速增强。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。