阅读说明：本技术 一种亚微米级球状生物碳酸钙及其制备方法和应用 (Submicron spherical biological calcium carbonate and preparation method and application thereof ) 是由 李庚英 王林彬 谢攀 雷思捷 何春保 陆金驰 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种亚微米球形生物碳酸钙及其制法和应用。该亚微米球形生物碳酸钙的制法包括以下步骤：将微生物接种于灭菌后的液体培养基中,在恒温摇床中震荡培养制得微生物菌液,于4℃冰箱保藏和备用；将晶种和晶型控制剂加入到无菌水中,搅拌获得晶种悬浮液；将培养后的微生物菌液喷洒到微生物繁殖载体或覆膜物表面,然后再转移至营养液中浸没,置于30～35℃环境中培养,培养过程中向营养液中加入晶种悬浮液和钙源,共持续3～7天,即得亚微米级球状生物碳酸钙。尝试采用该生物碳酸钙修复废旧水泥混凝土再生骨料,经试验测试发现再生骨料的吸水率降低98％,孔径超过50nm的有害孔被修复,孔隙率降低45％以上,孔洞和裂缝被修复。(The invention discloses a submicron spherical biological calcium carbonate and a preparation method and application thereof. The preparation method of the submicron spherical biological calcium carbonate comprises the following steps: inoculating the microorganism into the sterilized liquid culture medium, performing shake culture in a constant temperature shaking table to obtain a microorganism liquid, and preserving in a refrigerator at 4 ℃ for later use; adding the crystal seeds and the crystal form control agent into sterile water, and stirring to obtain a crystal seed suspension; spraying the cultured microbial liquid on the surface of a microbial propagation carrier or a film-coated object, then transferring the microbial liquid to a nutrient solution for immersion, culturing in an environment of 30-35 ℃, adding a seed crystal suspension and a calcium source into the nutrient solution in the culturing process, and continuing for 3-7 days to obtain the submicron spherical biological calcium carbonate. The biological calcium carbonate is tried to repair the waste cement concrete recycled aggregate, and test tests show that the water absorption of the recycled aggregate is reduced by 98%, harmful pores with the pore diameter of more than 50nm are repaired, the porosity is reduced by more than 45%, and pores and cracks are repaired.)

一种亚微米级球状生物碳酸钙及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于交叉学科，涉及微生物学、结晶学及物理化学科学领域，特别涉及一种亚微米(100～1000nm)级球形生物碳酸钙及其制备方法和应用。

背景技术

微生物矿化是指由微生物生理活动导致的矿物沉淀，包括微生物控制矿化、微生物影响矿化和微生物诱导矿化三种机制。其中微生物控制矿化是指在特定情况下，矿化直接在细胞内或细胞上特定位置合成。而微生物影响矿化是指由细胞表面有机物引起矿物沉淀的过程。微生物诱导矿化是大家关注的重点，是指通过微生物代谢活动导致矿物过饱继而沉淀的过程。微生物诱导矿化应用广泛，引起了全世界专家学者的广泛关注。目前微生物诱导生成的矿物种类繁多，包括铁氢化铁、赤铁矿、针铁矿、金属硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、磷矿、铁和铁-铝硅酸盐和金属硫化物等。

微生物诱导碳酸钙沉淀是生物矿化中最广泛和普遍的现象，根据已有的研究报道，至少超过200种微生物可以诱导碳酸钙进行生物矿化。因为微生物的代谢如光合作用、尿素水解和硝化作用等过程引起了生物膜中和生物周边环境中化学组分的改变，进而改变碳酸钙在环境中的饱和度，导致碳酸盐结晶沉淀。微生物诱导碳酸钙沉淀具有易于控制、环境友好，且反应产物具有胶凝能力等特性，有望广泛用于生物技术、古生物学、环境工程、岩土工程、水利工程和土木工程等诸多领域。已有文献表明，生物沉积碳酸钙有望在如下实际工程中发挥重要作用：1)利用其胶凝作用和填孔作用对历史、文化古建筑物的维修加固，并保持建筑物的修新如新、修旧如旧的原始风貌；2)利用其中性和环境友好性能，对土体性能的改良，防止土地流失以及土地酸化和碱化固结；3)利用其胶凝性以及填孔作用对边坡和堤坝进行稳定性防护；4)利用其胶凝性作为固沙剂，对流动沙丘表面进行固定；5)利用生物碳酸钙的离子交换功能对水中及土壤中重金属离子进行固定和去除；6)利用其胶凝性可获得微生物水泥或者实现混凝土结构的自修复。

目前，微生物沉积碳酸钙主要存在四种结晶形态：方解石、文石、球霰石和无定形碳酸钙。其中，方解石是碳酸钙热力学最稳定的晶型，球霰石和文石是方解石型碳酸钙形成过程中的一个次要的、亚稳态的过渡阶段晶型，在一定条件下都可以转化成方解石。无定型碳酸钙最不稳定，它经常是作为一种过渡状态存在，然后转化成方解石、文石或球霰石。值得注意的是，虽然方解石具有热力学最稳定的特点，但是已有的研究(吴昊潼，基于微生物诱导碳酸钙沉积的生物覆膜防渗研究，天津大学硕士论文，2016年)表明，微生物沉积方解石的晶型普通表现为斜方六面体、菱面体或复三方型，尺寸分布单一，并不利于紧密堆积(如图1所示)。而球霰石虽然成球形，但是其溶解性高，热力学稳定性差。而且，无论是方解石还是球霰石，其晶体的尺寸较大，普遍为10～200μm，有些甚至超过200μm。颗粒尺寸大具有如下缺点：1)无法深入到裂缝和孔洞深处，生物沉积碳酸钙的修复和增强效果并不明显；2)比表面积小、粘结力弱。根据表面界面科学以及物理化学可知，材料的颗粒越大，则比表面积越小，范德华力越弱。因此采用现有的微生物沉积碳酸钙难以有效修复建筑、固定沙土等。而且，根据已有的文献可知微生物诱导沉积碳酸钙效率低，颗粒分布不均匀，矿化环境要求苛刻，选用的牛肉膏等营养液会污染修复材料，阻碍了其工业化生产和实际应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙的制备方法。

本发明另一目的在于提供上述方法制备的亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙。

本发明再一目的在于提供上述亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙的制备方法，包括以下步骤：

(1)将微生物接种于灭菌后的液体培养基中，在恒温摇床中震荡培养制得微生物菌液，存放于4℃冰箱保藏和备用；

(2)将晶种和晶型控制剂加入到无菌水中，搅拌获得均匀分布的晶种悬浮液；

(3)将步骤(1)培养后的微生物菌液喷洒到微生物繁殖载体或覆膜物表面，然后再转移至营养液中浸没，置于30～35℃环境中培养，培养过程中向营养液中加入晶种悬浮液和钙源，共持续3～7天，即得亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙。

步骤(1)中的微生物为脲解型巴斯德芽孢杆菌；

步骤(1)中所述的液体培养基的配方：蔗糖10～30g/L、大豆蛋白胨5～20g/L、尿素20～50g/L、食盐3～8g/L、去离子水、pH值8～10；

步骤(1)中所述的灭菌是指采用高压灭菌锅于110～130℃灭菌20～40min。

步骤(1)中所述的微生物与液体培养基的用量满足每100质量份的液体培养基接种0.3～0.8质量份的微生物；优选为每100质量份的液体培养基接种0.5质量份的微生物。

步骤(1)中所述的恒温摇床中振荡培养的温度为30～35℃，振荡频率为150r/min，培养时间为24～36h；

为获得更高浓度的微生物菌液以便缩短生成球状生物碳酸钙的时间，在步骤(1)中恒温摇床中振荡培养后还包括一个离心操作，优选在6000r/min离心5min～10min，然后将微生物菌液存放于4℃冰箱保藏和备用；

步骤(2)中所述的晶种为同源零唯纳米碳酸钙，优选为平均粒径为20nm的方解石型碳酸钙，步骤(3)中所述的晶种的用量满足每100质量份的无菌水中加入0.01～0.5质量份的晶种；

步骤(2)中所述的晶型控制剂为氨基酸类表面活性剂，其中氨基酸类表面活性剂优选为赖氨酸盐、肌氨酸盐、谷氨酸盐、N－椰油酰基谷氨酸盐中的至少一种；步骤(2)中所述的晶型控制剂的用量满足每100质量份的无菌水中加入0.02～0.3质量份的晶型控制剂。

步骤(3)中所述的微生物繁殖载体或覆膜物优选水泥砂浆颗粒，其中水泥砂浆颗粒的pH为9.0～9.5、细度模数为1.5～2.2，使用前用灭菌水润湿。微生物繁殖载体或覆膜物的作用是为了固定微生物以提高局部浓度，并使得生物碳酸钙在预定位置结晶沉积。

步骤(3)中所述的营养液的配方为：3～5g/L蛋白胨、5～10g/L葡萄糖、30～90g/L尿素、去离子水、pH值8.0～9.0。

步骤(3)中所述的钙源均优选为100g/L的CaCl₂水溶液；

步骤(3)中所述的微生物菌液和营养液的用量满足：步骤(1)中每0.3-0.8质量份的微生物培养后获得的微生物菌液对应使用100重量份的营养液。

步骤(3)中所述的培养过程中加入晶种悬浮液和钙源是指：培养过程中，前12小时，每2小时加入一次晶种悬浮液和一次钙源，随后每6小时加入一次晶种悬浮液和一次钙源；其中晶种悬浮液和钙源的用量满足：当步骤(3)中营养液的重量份数为100份时，每次加入的晶种悬浮液重量份数为1～4份，每次加入的钙源的重量份数为5～15份；

一种由上述方法制备得到的亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙。

上述的亚微米级(100～1000nm)球状生物碳酸钙具有比表面积大、表面能高、堆积效应好、级配优良、憎水性好、耐水性强、胶结性能好等特性，可广泛用于固体废渣资源化利用、砂土固化、建筑维修加固和土体改性等工程中。

本发明的机理为：

微生物如巴斯德芽孢杆菌细胞壁带有负电荷的官能团鳌合Ca²⁺，充当成核位点，细菌呼吸作用及尿素酶水解作用致使局部晶体阴离子CO₃ ^2-浓度增大,从而又进一步吸引更多Ca²⁺,直到晶体前驱物浓度增大到利于核化沉积晶体。沉积速率与细胞成长以及尿素酶活性密切相关,动力学研究表明沉积时pH值对尿素酶活性有显著影响，碱性环境中有利于诱导沉积生物碳酸钙。但是，已有的研究表明通常生物诱导碳酸钙沉积率非常低，沉积的碳酸钙颗粒尺寸较大，通常为几十微米到几百微米，限制了其在工程中的应用。

基于固相反应动力学可知，晶体非均相成核具有较低的活化能。另一方面，根据表面界面科学可知，材料颗粒越细，则比表面积越大，表面能越高，界面作用力越强。本发明基于上述原理，从分子尺度上设计碳酸钙结晶过程，达到减少碳酸钙颗粒尺寸和提高沉积效率的目的。为此，我们采用了外掺同源晶核(方解石微晶)和晶型控制剂的方法。具体的，首先采用氨基酸类表面活性剂肌氨酸钠或N－椰油酰基谷氨酸钠作为晶型控制剂。氨基酸类表面活性剂的作用主要有：1)加速碳酸钙晶核的形成，这是由于氨基酸类表面活性剂如肌氨酸钠或N－椰油酰基谷氨酸钠本身就是一种仿生矿化模板，水解后形成带有负电荷的官能团，这些官能团与溶液中的Ca²⁺产生静电、配位等一系列相互作用,充当成核位点并调控晶体的生长。2)氨基酸类表面活性剂本身又是一种蛋白质，能为微生物的生长和繁殖提供养分，进而提高微生物的活性，加速碳酸钙成核和结晶。3)由于氨基酸类表面活性剂具有定向排列特性，在微生物沉积碳酸钙过程中将选择性吸附在矿物特定晶面，起到控制晶体相组成和形状大小的作用(晶型控制剂)。4)纳米碳酸钙颗粒表面被憎水表面活性剂包裹，能降低生物碳酸钙的溶解性并促使沉积物均匀分散。5)氨基酸类表面活性剂还能防止微生物聚集粘连形成生物膜,提高微生物活性。这是由于形成生物膜的微生物细胞常处于相对静止或半休眠状态，各种生理活动及代谢缓慢，矿化形成生物碳酸钙的能力弱。

另外，本发明还加入了适量纳米碳酸钙作为同源晶核(晶种)。根据结晶学可知，由于晶种的存在，有利于降低生物碳酸钙成核活化能，提高生物碳酸钙的沉积速率。另一方面外掺纳米碳酸钙还具有pH稳定性，在生物碳酸钙尚未大量形成时，能够使得溶液成弱碱性。对巴斯德芽孢杆菌而言，弱碱性环境有利于其保持活性和繁殖生长，进而为提高矿化效率提供了条件。

本发明的生物碳酸钙具有矿化效率高、原材料易得、工艺简单、绿色环保等特征，为其工程应用奠定了条件。而且生成的微生物碳酸钙具有亚微米(100～1000nm)结构，表面能高，粘结力强。这些生物碳酸钙能够密闭和填充各种孔隙和裂缝，修复效率高。更为重要的是，本发明获得的亚纳米级生物碳酸钙不溶于水，为提高材料的耐久性提供了条件。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明尝试采用该方法修复废旧水泥混凝土再生骨料，经试验测试发现再生骨料的吸水率降低98％，孔径超过50nm的有害孔被修复，孔隙率降低45％以上，孔洞和裂缝被修复。

附图说明

图1为微生物沉积方解石的形貌图。

图2为实施例1和对比实施例1制备的微生物碳酸钙的形貌图，其中左侧的三幅图代表实施例1制备的微生物碳酸钙的形貌图，右侧的三幅图代表对比实施例1制备的微生物碳酸钙的形貌图。

图3为实施例1和对比实施例1制备的微生物碳酸钙TEM粒径分布图；其中左侧为实施例1制备的微生物碳酸钙的TEM粒径分布图，右侧为对比实施例1制备的微生物碳酸钙的TEM粒径分布图。

图4为再生矿料修复前后对比图，其中(a)代表未修复前的酸性骨料的实物图以及SEM图，(b)代表利用本发明的亚微米生物碳酸钙修复后的骨料的实物图及SEM图。

图5为再生矿料修复前后的孔径孔隙率测试结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

实施例中如无特殊说明，份数均指重量份数。

实施例1

一种亚微米级球状生物碳酸钙，其主要包括以下组分及重量份：培养基(蔗糖20g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素30g/L、食盐5g/L、去离子水)100份；微生物菌种(巴斯德芽孢杆菌，Bacillus pasteurii，购自DSMZ，德国微生物菌种保藏中心)0.5份；晶种悬浮液(纳米碳酸钙的浓度为0.05wt％，晶型控制剂的浓度为0.1wt％)32份；100g/L CaCl₂溶液160份；营养液(3g/L蛋白胨、10g/L葡萄糖、60g/L尿素、去离子水)100份。

一种亚微米级球状生物碳酸钙的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)按照培养基配方(蔗糖20g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素30g/L、食盐5g/L)称量大豆蛋白胨、蔗糖、食盐溶于去离子水中，125℃灭菌20min再加入尿素，制得液体培养基；

(2)将0.5重量份的巴斯德芽孢杆菌接种于100重量份的液体培养基中，然后在恒温摇床中震荡培养，恒温摇床的温度为35℃，震荡频率为150r/min，培养24h后将所得产物离心处理(6000r/min，5min)，获得高浓度的巴斯德芽孢杆菌种子(10⁹cells/mL)，存放于4℃冰箱保藏和备用；

(3)将平均粒径为20nm的纳米碳酸钙(芮城华纳纳米材料有限公司)溶于无菌水中，加入晶型控制剂(赖氨酸钠氨基酸表面活性剂)，采用搅拌机在转速1000r/min条件下搅拌30分钟获得均匀分布的晶种悬浮液(悬浮液中纳米碳酸钙浓度为0.05wt％，晶型控制剂的浓度为0.1wt％；

(4)按3g/L蛋白胨、10g/L葡萄糖、60g/L尿素、去离子水的比例配置营养液；按100g/L配置CaCl₂溶液。

(5)将步骤(2)培养后的高浓度菌液全部移植到载体(水泥砂浆试块)表面(用量为5ml/cm²)。静置5分钟后缓慢移入并浸没于步骤(4)的营养液中(100份)，随后12h里，每隔2h向营养液中喷2份晶种悬浮液和10份CaCl₂溶液；接着，每隔6个小时喷晶种悬浮液2份和10份CaCl₂溶液，置于30～35℃环境中培养，共持续3天。

对比实施例1

一种球状生物碳酸钙，其主要包括以下组分及重量份：培养基(蔗糖20g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素30g/L、食盐5g/L、去离子水)100份；微生物菌种(巴斯德芽孢杆菌)0.5份；营养液(3g/L蛋白胨、10g/L葡萄糖、60g/L尿素、去离子水)100份。100g/L CaCl₂溶液160份。

球状生物碳酸钙的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)按照培养基配方(蔗糖20g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素30g/L、食盐5g/L)称量大豆蛋白胨、蔗糖、食盐溶于去离子水中，125℃灭菌20min再加入尿素，制得液体培养基；

(2)将0.5重量份的巴斯德芽孢杆菌接种于100重量份的液体培养基中，然后在恒温摇床中震荡培养，恒温摇床的温度为35℃，震荡频率为150r/min，培养24h后将所得产物离心处理(6000r/min，5min)，获得高浓度的巴斯德芽孢杆菌种子(10⁹cells/mL)。存放于4℃冰箱保藏和备用；

(3)按配比配置营养液(3g/L蛋白胨、10g/L葡萄糖、60g/L尿素，去离子水)；

(4)将步骤(2)培养后的高浓度菌液全部涂布到水泥砂浆块表面(用量为5ml/cm²),静置5分钟后缓慢移入步骤(4)的营养液中(100份)，随后12h里，每隔2h喷10份CaCl₂溶液；接着，每隔6个小时喷10份CaCl₂溶液，置于30～35℃环境中培养，共持续3天。

对上述实施例1制备得到的碳酸钙和对比实施例1制备的碳酸钙的形貌以及粒径进行测试，结果如图2和图3所示，从图中可以看出，1)实施例1中溶液为白色悬浮液，而对比实施例1为透明溶液，表明实施例1中微生物沉积的碳酸钙量远高于对比实施例1。2)实施例1获得了亚微米球状生物碳酸钙，SEM和TEM观测发现碳酸钙粒径小于1000nm；而对比实施例1的碳酸钙粒径为微米级，粒径普遍超过5μm。3)激光粒度仪测试结果进一步表明，实施例1获得的亚微米生物碳酸钙的粒径在100nm～1000nm之间，粒径中值为284.2nm；而对比实施例1中碳酸钙颗粒尺寸分布在3000nm～18000nm之间，粒径中值为12591.6nm。

应用实施例：

本发明尝试采用微生物矿化纳米生物碳酸钙的方法修复废旧水泥混凝土再生骨料，主要包括以下步骤：

(1)按照培养基配方(蔗糖20g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素30g/L、食盐5g/L)称量大豆蛋白胨、蔗糖、食盐溶于去离子水中，125℃灭菌20min再加入30份尿素，制得液体培养基；

(2)将0.5重量份的巴斯德芽孢杆菌接种于100重量份的液体培养基中，然后在恒温摇床中震荡培养，恒温摇床的温度为35℃，震荡频率为150r/min，培养24h后将所得产物离心处理(6000r/min，5min)，获得高浓度的巴斯德芽孢杆菌种子(10⁹cells/mL)，存放于4℃冰箱保藏和备用；

(3)按3g/L蛋白胨、10g/L葡萄糖、60g/L尿素、去离子水的比例配置营养液；按100g/L配置CaCl₂溶液。

(4)将纳米碳酸钙(20nm，芮城华纳纳米材料有限公司)(浓度为0.05wt％)和晶型控制剂(赖氨酸钠氨基酸表面活性剂)(浓度为0.1wt％)溶于无菌水中，采用搅拌机在转速1000r/min条件下搅拌30分钟获得均匀分布的晶种悬浮液；

(5)采用水泥砂浆颗粒作为微生物沉积碳酸钙载体或覆膜物，其中水泥砂浆颗粒的pH为9～9.5、细度模数为1.5～2.2，接种前用灭菌水润湿。将步骤(2)培养后的菌液喷洒到润湿的水泥砂浆颗粒(菌液:砂浆＝1:2)，搅拌均匀，覆盖在被修复材料上(废弃水泥混凝土再生骨料)。随后12h里，每隔2h喷一次步骤(3)制得的营养液6份，步骤(4)制得的晶种悬浮液2份(内含浓度为0.05wt％的纳米碳酸钙和0.1wt.％的晶型控制剂)和10份CaCl₂溶液；接着，每隔6个小时喷一次营养液6份、晶种悬浮液2份和10份CaCl₂溶液，置于30～35℃环境中培养，共持续3天。

废弃水泥混凝土再生骨料修复前后的形貌图如图4所示，其中(a)代表未修复前的酸性骨料的实物图以及SEM图，(b)代表利用本发明的亚微米生物碳酸钙修复后的骨料的实物图及SEM图。从图4中可以看出，未经本发明的亚微米级微生物碳酸钙修复前的再生骨料存在大量的裂缝和孔洞，表面化学性质不均匀；而经本发明的亚微米级微生物碳酸钙修复后的再生骨料裂缝和孔洞被修复、表面被一层生物碳酸钙覆盖，化学性质均匀。经试验测试发现再生骨料的吸水率降低98％，孔径超过50nm的有害孔被修复，孔隙率降低45％以上(孔径分布如图5所示)，孔洞和裂缝被修复。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。