阅读说明：本技术 一种多肽螺旋构象稳定化方法 (Polypeptide helix conformation stabilizing method ) 是由 方葛敏 武梦 周兆才 汤扬 陈晓旭 于 2020-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多肽螺旋构象稳定化方法,是通过化学键将多肽N末端氨基与N端第4、5、8或12位侧链巯基之间进行共价交联。本发明通过N端氨基与侧链的共价交联可以构建单匝、双匝和三匝环化的构象锁定螺旋肽,有利于螺旋多肽的结构深度优化,便于高活性多肽类抑制剂的发现。本发明方法使短序列多肽在水溶液中能够保持稳定的螺旋构象,解决了短的线性多肽不具有稳定螺旋构象的问题。(The invention discloses a polypeptide helical conformation stabilizing method, which is to carry out covalent crosslinking between amino at the N terminal of a polypeptide and sulfydryl of a side chain at the 4 th, 5 th, 8 th or 12 th site of the N terminal through a chemical bond. According to the invention, single-turn, double-turn and three-turn cyclized conformation-locked helical peptide can be constructed through covalent crosslinking of N-terminal amino and side chains, so that the structural depth optimization of helical peptide is facilitated, and the discovery of a high-activity polypeptide inhibitor is facilitated. The method of the invention enables the short-sequence polypeptide to keep stable helical conformation in aqueous solution, and solves the problem that the short linear polypeptide does not have stable helical conformation.)

一种多肽螺旋构象稳定化方法

技术领域

本发明涉及一种多肽螺旋构象稳定化方法，使短序列多肽在水溶液中能够保持稳定的螺旋构象，解决了短的线性多肽不具有稳定螺旋构象的问题。

背景技术

蛋白质与蛋白质的相互作用异常是多种疾病发生的生物化学本质，然而传统小分子被认为靶向蛋白质-蛋白质相互作用方面的能力十分有限。蛋白质-蛋白质相互作用面上经常观察到具有螺旋结构的多肽。这一界面上的螺旋肽提供了一个用于干预蛋白质-蛋白质相互作用的理想模拟表位。然而需要指出，直接的截断的短序列线性多肽在溶液中不具有稳定的构象，同时酶学稳定性差，因而通常并不被认为有成药潜力。针对这一问题，人们发展了多种稳定多肽螺旋结构的方法，并在设计和合成多肽抑制剂方面取得了重要进展，包括已经进入临床二期的一个螺旋多肽ALRN-6924。

在前人发展的诸多方法中，N末端螺旋成核法是稳定多肽螺旋构象的一个吸引人的重要策略。该策略在多肽的N末端氨基中引入一个环状结构，引发多肽形成螺旋构象，可以最大程度保留多肽的识别表位。目前该方面主要包括氢键模拟物和N末端氢键帽两种方法。然而需要指出，氢键模拟物需要利用环境不友好的烯烃复分解反应，而N-末端氢键帽则需要在模板中引入高极性的氢键给体和氢键供体，不利于多肽的活性优化。此外，上述两种N末端成核模板目前只能用于构建单匝环化的螺旋肽。固定成核模板位置对于多肽的结构与功能优化非常不利。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种新型的多肽螺旋构象稳定化方法，通过多肽N末端与N端第4、5、8或12位侧链巯基之间的共价交联，发展出一种具有新的结构特征的螺旋多肽体系，可以拓展N末端成核模板的应用范围，例如可以制备包括单匝、双匝和三匝环化的螺旋多肽，有利于设计靶向蛋白-蛋白间相互作用的新型多肽类抑制剂。

前人的N末端成核模板要么需要采用重金属参与的烯烃复分解反应，要么需要在模板中引入高极性的氢键给体和氢键供体。此外，它们目前只能用于构建单匝环化的螺旋肽。这些局限对于生物活性多肽的结构和功能优化十分不利。鉴于以上的技术瓶颈，发明人进行了系统而深入地研究，发现利用一个化学键将多肽N末端氨基与N端第4、5、8或12位侧链巯基之间进行共价交联，可以稳定多肽的螺旋构象。这一方法不再局限于单匝环化的螺旋肽，可以拓展到双匝和三匝环化的螺旋肽，同时额外引入的化学键不需要高极性的氢键给体和氢键供体。

本发明多肽螺旋构象稳定化方法，包括如下步骤：

步骤1：针对一个特定序列的线性多肽，将位于多肽的N端第4、5、8或12位的氨基酸突变为含有巯基的氨基酸(如半胱氨酸)，并通过标准的Fmoc固相合成进行线性肽的拼接。其中，对于N端第4、5、8位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，固相合成中采用FmocCys(Trt)-OH结构单元；对于N端第12位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，固相合成中采用FmocCys(Acm)-OH为结构单元。

步骤2：完成N末端最后一个氨基酸拼接后，脱除N末端Fmoc基团，随后在缩合剂的存在下，采用封闭剂封闭多肽的N末端氨基。

所述封闭剂包括3-(三苯甲硫基)丙酸、2-(三苯甲硫基)乙酸、4-(三苯甲硫基)丁酸、2-(三苯甲硫基)异丁酸、3-(三苯甲硫基)异丁酸、6-(三苯甲硫基)己酸、8-(三苯甲硫基)辛酸、11-(三苯甲硫基)十一烷酸、12-(三苯甲硫基)十二酸、16-(三苯甲硫基)十六酸、3-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯基乙酸、4-(三苯甲硫基)氢化肉桂酸、2-(三苯甲硫基)烟酸或丙烯酸。其中，对于N端第4、5、8位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，N末端氨基采用3-(三苯甲硫基)丙酸、2-(三苯甲硫基)乙酸、4-(三苯甲硫基)丁酸、2-(三苯甲硫基)异丁酸、3-(三苯甲硫基)异丁酸、6-(三苯甲硫基)己酸、8-(三苯甲硫基)辛酸、11-(三苯甲硫基)十一烷酸、12-(三苯甲硫基)十二酸、16-(三苯甲硫基)十六酸、3-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯基乙酸、4-(三苯甲硫基)氢化肉桂酸或2-(三苯甲硫基)烟酸)进行封闭；对于N端第12位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，N末端氨基采用丙烯酸进行封闭。

步骤3：通过三氟乙酸切割液(TFA:间甲苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2，V/V)将多肽从树脂上进行解离，***沉淀，获得线性多肽前体；

步骤4：共价交联

4a、对于N端第4、5或8位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，将线性多肽前体溶解在DMF/H₂O的混合溶剂(1：10～10：1，V/V)中，外加双(溴甲基)苯试剂，在弱碱性条件下(pH＝8)将多肽的N末端巯基与N端第4、5或8位的半胱氨酸共价交联，最后利用反相液相色谱进行纯化分离(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，V/V；流速3mL/min，方法：2→2→90→90→90B％，Time/min：0→2→30→35→40)；

4b、对于N端第12位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，线性多肽前体首先在DMF/H₂O的混合溶剂(1：10～10：1，V/V)中与1，6-己二硫醇发生迈克尔加成反应；接下来溶解在乙酸和水的混合溶剂(1：10～10：1，V/V)中，并在AgOAc的作用下，脱去N端第12位半胱氨酸的侧链Acm保护基团；最后在DMF/H₂O的混合溶剂(1：10～10：1，V/V)中，通过双(溴甲基)苯试剂或者双(溴甲基)联苯完成N末端巯基与N端第12位半胱氨酸的共价交联，并通过液相色谱进行纯化分离(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，V/V；流速3mL/min，方法：2→2→90→90→90B％，Time/min：0→2→30→35→40)。

本发明方法得到的多肽具有以下特征：在N末端氨基与N端第4、5、8或12位的侧链巯基之间通过如下连接臂实现共价交联：

(N端第12位的氨基酸突变为半胱氨酸)、

本发明中，多肽N末端氨基与N端第4、5、8或12位的侧链巯基之间被共价交联结构将能够显著稳定多肽的螺旋构象结构，如下表1所示(交联多肽螺旋含量是线性肽的2～4倍)，其中多肽N末端氨基与N端第8位侧链巯基之间的共价交联结构具有最为稳定的螺旋结构。

本发明稳定多肽螺旋结构的方法，使短序列多肽在水溶液中能够保持稳定的螺旋构象，解决了短的线性多肽不具有稳定螺旋构象的问题。本发明通过N端氨基与侧链的共价交联可以构建单匝、双匝和三匝环化的构象锁定螺旋肽，有利于螺旋多肽的结构深度优化，便于高活性多肽类抑制剂的发现。

附图说明

图1是(N，i+3)-C1的色谱图和质谱图。

图2是(N，i+3)-C2的色谱图和质谱图。

图3是(N，i+3)-C3的色谱图和质谱图。

图4是(N，i+4)-C1的色谱图和质谱图。

图5是(N，i+4)-C2的色谱图和质谱图。

图6是(N，i+4)-C3的色谱图和质谱图。

图7是(N，i+7)-C1的色谱图和质谱图。

图8是(N，i+7)-C2的色谱图和质谱图。

图9是(N，i+7)-C3的色谱图和质谱图。

图10是(N，i+7)-C4的色谱图和质谱图。

图11是(N，i+11)-C3的色谱图和质谱图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明技术方案作进一步分析说明。注意，发明中没有特别说明的地方，该发明中使用的说法和技术术语与该发明所在的领域的科技人员的理解是相同的。此外，其它与本发明内容所述的等同的任意材料对于该发明的实施也是同样地使用。同时，本发明所论述的合成方法并不局限于这里展示的多肽。

本发明所使用的缩写的含义列于下表：

英文缩写	中文含义
		Fmoc	9-芴甲氧羰基
Trt	三苯甲基
		DCM	二氯甲烷
DMF	N,-N二甲基甲酰胺
		TFA	三氟乙酸
DIC	N,N-二异丙基碳化二亚胺
		Oxyma	2-肟氰乙酸乙酯
TIPS	三异丙基硅烷
		DTT	二硫苏糖醇
Tris	三羟甲基氨基甲烷
		HPLC	高效液相色谱
MALDI-TOF	基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪

为了便于展示发明的实施细节，我们以序列为ARAARAARAKARAD的线性多肽作为模型，展示本发明的具体内容。

实施例1：多肽N末端与N端第4位侧链巯基之间的交联的螺旋稳定多肽制备

将模型肽的N端第4位氨基酸Ala突变为Cys，设计得到一条新的序列肽，为ARACRAARAKARAD。通过成熟的Fmoc固相合成，我们可以获得该线性多肽。线性肽的固相合成具体合成过程包括如下步骤：

(1)溶胀Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30μmol)：90mg树脂加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min；

(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min，最后将树脂用DMF洗涤5次；

(3)氨基酸的偶联：称量56mg Fmoc-Asp-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次；

(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂，常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂；

(5)氨基酸的固相重复组装：重复(2)-(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合，直至N端Ala固相组装完成，脱去N端Ala的Fmoc基团；

(6)N端的巯基丙酸缩合：称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤2次；

(7)常温干燥树脂15min后，将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2，v/v)加入合成管中，常温反应2h，收集切割液，用冰***沉淀3次，得到粗肽，并经过HPLC分离纯化(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min，方法(2→2→90→90→90B％)，Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。

接下来，通过烷基化试剂对N末端和N端第4位侧链的巯基进行共价交联。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM，pH 8.0)中；其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯(命名为C1)、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯(命名为C2)、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯(命名为C3)，将其分别溶于0.1mL DMF中；然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组反应混合液，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应；反应结束后，每组反应液中加入10μL 0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀，3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化。色谱的洗脱方法与线性多肽制备方法相同。冷冻干燥后，我们得到了纯度大于96％的三种N末端与N端第4位侧链巯基之间的交联环状多肽，分别命名为(N，i+3)-C1、(N，i+3)-C2、(N，i+3)-C3。将这三条肽溶解在PBS中，进行圆二光色谱分析，通过与线性，母体肽比较，可以确定该结构的多肽具有稳定的螺旋构象。

实施例2：多肽N末端与N端第5位侧链巯基之间的交联的螺旋稳定多肽制备

将模型肽的N端第5位氨基酸Arg突变为Cys，设计得到一条新的序列肽，为ARAACAARAKARAD。通过成熟的Fmoc固相合成，我们可以获得该线性多肽。线性肽的固相合成具体合成过程包括如下步骤：

(1)溶胀Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30μmol)：90mg树脂加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min；

(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min，最后将树脂用DMF洗涤5次；

(3)氨基酸的偶联：称量56mg Fmoc-Asp-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次；

(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂，常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂；

(5)氨基酸的固相重复组装：重复(2)-(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合，直至N端Ala固相组装完成，脱去N端Ala的Fmoc基团；

(6)N端的巯基丙酸缩合:称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤2次；

(7)常温干燥树脂15min后，将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2，v/v)加入合成管中，常温反应2h，收集切割液，用冰***沉淀3次，得到粗肽，并经过HPLC分离纯化(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min，方法(2→2→90→90→90B％)，Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。

接下来，通过烷基化试剂对N末端和N端第4位侧链的巯基进行共价交联。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中；其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯(命名为C1)、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯(命名为C2)、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯(命名为C3)，将其分别溶于0.1mL DMF中；然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组反应混合液，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应；反应结束后，每组反应液中加入10μL 0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀，3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化。色谱的洗脱方法与线性多肽制备方法相同。冷冻干燥后，我们得到了纯度大于96％的三种N末端与N端第4位侧链巯基之间的交联环状多肽，分别命名为(N，i+4)-C1、(N，i+4)-C2、(N，i+4)-C3。将这三条肽溶解在PBS中，进行圆二光色谱分析，通过与线性，母体肽比较，可以确定该结构的多肽具有稳定的螺旋构象。

实施例3：多肽N末端与N端第8位侧链巯基之间的交联的螺旋稳定多肽制备

将模型肽的N端第8位氨基酸Arg突变为Cys，设计得到一条新的序列肽，为ARAARAACAKARAD。通过成熟的Fmoc固相合成，我们可以获得该线性多肽。线性肽的固相合成具体合成过程包括如下步骤：

(1)溶胀Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30μmol)：90mg树脂加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min；

(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min，最后将树脂用DMF洗涤5次；

(3)氨基酸的偶联：称量56mg Fmoc-Asp-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次；

(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂，常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂；

(5)氨基酸的固相重复组装：重复(2)-(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合，直至N端Ala固相组装完成，脱去N端Ala的Fmoc基团；

(6)N末端的巯基丙酸缩合:称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤2次；

(7)常温干燥树脂15min后，将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2，v/v)加入合成管中，常温反应2h，收集切割液，用冰***沉淀3次，得到粗肽，并经过HPLC分离纯化(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min，方法(2→2→90→90→90B％)，Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。

接下来，通过烷基化试剂对N末端和N端第4位侧链的巯基进行共价交联。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM，pH 8.0)中；其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯(命名为C1)、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯(命名为C2)、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯(命名为C3)、8mg的4,4’-二(溴甲基)联苯(命名为C4)将其分别溶于0.1mLDMF中；然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组反应混合液，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应；反应结束后，每组反应液中加入10μL 0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀，3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化。色谱的洗脱方法与线性多肽制备方法相同。冷冻干燥后，我们得到了纯度大于96％的三种N末端与N端第4位侧链巯基之间的交联环状多肽，分别命名为(N，i+7)-C1、(N，i+7)-C2、(N，i+7)-C3、(N，i+7)-C4。将这四条肽溶解在PBS中，进行圆二光色谱分析，通过与线性，母体肽比较，可以确定该结构的多肽具有稳定的螺旋构象。

实施例4：多肽N末端与N端第12位侧链巯基之间的交联的螺旋稳定多肽制备

将模型肽的N端第12位氨基酸Arg突变为Cys，设计得到一条新的序列肽，为ARAARAARAKACAD。通过成熟的Fmoc固相合成，我们可以获得该线性多肽，第12位氨基酸所用的为FmocCys(Acm)-OH。线性肽的固相合成具体合成过程包括如下步骤：

(1)溶胀Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30μmol)：90mg树脂加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min；

(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min，最后将树脂用DMF洗涤5次；

(3)氨基酸的偶联：称量56mg Fmoc-Asp-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μLDIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min，用DMF洗涤树脂3次；

(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂，常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂；

(5)氨基酸的固相重复组装：重复(2)-(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合，直至N端Ala固相组装完成，脱去N端Ala的Fmoc基团；

(6)N-末端丙烯酸缩合：27mg丙烯酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21μL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴37℃，反应1h，重复缩合一次后，用DMF洗涤树脂3次；

(7)常温干燥树脂15min后，将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入合成管中，常温反应2h，收集切割液，用冰***沉淀3次，得到粗肽，并经过HPLC分离纯化(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA；流速为3mL/min；方法:2→2→90→90→90B％，Time/min0→2→30→35→40)，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的N-端丙烯酰基化多肽。

接下来，1，6-己二硫醇与N-端丙烯酰基化多肽的偶联反应。称取10mg上述所得到的N-端丙烯酰基化多肽，溶于4.2mL的DMF/H₂O(2:1，v:v)的混合溶液中；其次，用1M的NH₄CO₃调节pH至8.0(精密试纸确定)，随后加入10μL(10eq)的1,6-己二硫醇，室温振荡反应和HPLC跟踪进程；待反应结束(1小时左右)，利用半制备HPLC反相C18柱进行分离(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA；流速为3mL/min；方法：2→2→90→90→90B％，Time/min 0→2→30→35→40)，样品峰经冷冻干燥后得到纯度大于96％的N端被1,6-己二硫醇修饰的线性多肽。

紧接着，多肽侧链Acm保护基的脱除。称取6mg上述所得到的多肽，溶解在0.6mLH₂O/CH₃COOH(1:1)混合溶剂中，加入6mg AgOAC，常温震荡10h；然后，加入6mL 1M二硫苏糖醇(溶解于6M Gn·HCl，pH7.0，0.2M PBS)，立即形成沉淀物(由Ag-DTT组成)，30min后，离心反应液，上清样经过HPLC反相C18柱进行分离纯化(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA；流速为3mL/min；方法:2→2→90→90→90B％，Time/min 0→2→30→35→40)，样品峰经冷冻干燥后得到纯度大于96％的线性多肽。

最后，通过烷基化试剂对N末端和N端第12位侧链的巯基进行共价交联。首先，称取2.5mg的线性多肽，将其溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中；其次，称取6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其溶于0.1mL DMF中；然后，将含有线性多肽的Tris-HCl溶液与含有小分子的DMF溶液混合，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应；反应结束后，向反应液中加入10μL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀，反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化(流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA；流速为3mL/min；方法:2→2→90→90→90B％，Time/min 0→2→30→35→40)，样品峰经冷冻干燥后得到纯度大于96％的环状多肽，命名为(N，i+11)-C3。将这条肽溶解在PBS中，进行圆二光色谱分析，通过与线性，母体肽比较，可以确定该结构的多肽具有稳定的螺旋构象。

下表1给出了实施例获得的环肽的螺旋比例。

表1