蛋白纯化的系统和方法
阅读说明：本技术 蛋白纯化的系统和方法 (System and method for protein purification ) 是由 倪楠 张赶 梁泊宁 杨晓明 叶峰 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白质纯化技术领域,尤其是涉及一种蛋白纯化的系统和方法。蛋白纯化的系统,包括深层过滤单元、层析单元和蠕动泵；所述蠕动泵的蠕动泵管的出口连接于所述深层过滤单元的入口；所述深层过滤单元的出口连接于所述层析单元的入口；所述层析单元包括层析膜和/或层析柱；所述深层过滤单元包括深层过滤膜；所述深层过滤膜的膜面积与所述层析膜的膜体积之比为1m<Sup>2</Sup>﹕(100～110)mL；所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比为1m<Sup>2</Sup>﹕(0.8～10)L。本发明通过采用深层过滤膜与层析膜和/或层析柱配合,可同时处理多个步骤,极大的提高了生产效率；并且,无需采用现有的全自动化的层析系统,降低了生产成本。(The invention relates to the technical field of protein purification, in particular to a system and a method for protein purification. A system for protein purification, comprising a depth filtration unit, a chromatography unit and a peristaltic pump; the outlet of a peristaltic pump pipe of the peristaltic pump is connected with the inlet of the deep layer filtering unit; the outlet of the depth filtration unit is connected to the inlet of the chromatography unit; the chromatography unit comprises a chromatographic membrane and/or a chromatographic column; the depth filtration unit comprises a depth filtration membrane; the ratio of the membrane area of the deep filtration membrane to the membrane volume of the chromatographic membrane is 1m 2 (100-110) m L, wherein the ratio of the membrane area of the deep filtration membrane to the column volume of the chromatographic column is 1m 2 (0.8-10) L deep filtration is adoptedThe membrane is matched with the chromatographic membrane and/or the chromatographic column, so that a plurality of steps can be processed simultaneously, and the production efficiency is greatly improved; in addition, the existing full-automatic chromatography system is not needed, and the production cost is reduced.)
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化技术领域，尤其是涉及一种蛋白纯化的系统和方法。
背景技术
蛋白质的大规模经济纯化越来越成为生物技术产业的重要问题。生产成本逐渐成为蛋白质纯化的重要因素。过去传统的抗体药物纯化方法一般包括抗体亲和捕获，病毒灭活，中间深层过滤，离子交换层析，浓缩渗滤。在传统的生产中，深层过滤的设备通常由蠕动泵和压力表组成，而层析的设备则是全自动化的层析系统。层析系统通常一次性投入较大，不能同时处理多个步骤，这就导致深层过滤和层析通常需要分开操作，这大大降低了生产效率，同时也增加了生产成本。
层析由于具有很好的分离性及经济性被工业界广泛使用，常用的层析模式包括结合洗脱模式层析和流穿模式层析。目前很多公司使用的下游纯化平台工艺通常是流穿模式的阴离子交换层析与结合洗脱模式的阳离子交换层析相结合去除工艺相关杂质和产品相关杂质。相较于结合洗脱模式，流穿模式使抗体直接经过层析柱，而将杂质结合在填料上，使得流穿模式具有更高的载量，以及较少的洗涤和洗脱步骤，从而提高生产率以及降低生产成本。
然而，目前的蛋白纯化包含多个步骤，如多步深层过滤，多步层析。但这些步骤在实际放大生产中呈现操作零碎化，时间长，设备投入大，生产效率低等缺点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供蛋白质纯化的系统，以解决现有技术中存在的生产效率低、设备投入大的技术问题。
本发明的第二目的在于提供蛋白质纯化的方法，所述能整合多个操作步骤，生产效率高，设备投入低。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
蛋白纯化的系统，包括深层过滤单元、层析单元和蠕动泵；
所述蠕动泵的蠕动泵管的出口连接于所述深层过滤单元的入口；所述深层过滤单元的出口连接于所述层析单元的入口；
所述层析单元包括层析膜和/或层析柱；所述深层过滤单元包括深层过滤膜；
所述深层过滤膜的膜面积与所述层析膜的膜体积之比为1m2﹕(100～110)mL；
所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比为1m2﹕(0.8～10)L。
本发明通过采用深层过滤膜与层析膜和/或层析柱配合，能够同时处理多个步骤，无需将深层过滤处理和层析处理分开操作，极大的提高了生产效率；并且，无需采用现有的全自动化的层析系统，降低了生产成本。
并且，本发明采用相对应的膜面积和层析膜的膜体积或层析柱的柱体积，能够保证在深层过滤后，直接进行层析处理，不会出现单个步骤的压力过高的情况。
本发明的蛋白纯化的系统，在减少时间成本以及层析系统使用的同时，提高生产效率。
在本发明的优选实施方式中，所述系统包括一个蠕动泵。本发明的蛋白纯化的系统，仅通过一个蠕动泵，即可将深层过滤处理与一步层析步骤或多步层析步骤整合在一起，采用合适相对应的膜面积和层析膜的膜体积或层析柱的柱体积，使得各个操作步骤的压力不会出现过高的情况。
所述蠕动泵的蠕动泵管的入口外接水、平衡缓冲液或样品等，根据实际处理操作阶段进行调整。
在本发明的
具体实施方式
中，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析膜的膜体积之比为1m2﹕(102～108)mL，优选为1m2﹕(104～105)mL，更优选为1.1m2﹕115mL。
在本发明的具体实施方式中，当层析单元为层析柱时，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比为1m2﹕(8.5～9.5)L，更优选为1.1m2﹕9.8L。
在本发明的具体实施方式中，当层析单元包括层析柱和层析膜时，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比为1m2﹕(0.8～1)L，更优选为1.1m2﹕1L。
在本发明的具体实施方式中，所述层析单元包括一个层析膜或多个串联的层析膜；
或者，所述层析单元包括一个层析柱或多个串联的层析柱；
或者，所述层析单元包括串联的一个层析膜和一个层析柱；
或者，所述层析单元包括一个层析膜和多个串联的层析柱，所述层析膜和所述多个串联的层析柱串联连接；
或者，所述层析单元包括多个串联的层析膜和一个层析柱，所述多个串联的层析膜和所述层析柱串联连接。
层析柱和层析膜的个数可根据实际操作需求进行调整选择。
在本发明的优选实施方式中，所述系统还包括至少一个压力表。通过压力表监控各个步骤的操作压力，避免过高；根据压力表反馈的压力情况，当压力过高时，可通过蠕动泵适当调低流速使得压力在可控范围内。
在本发明的优选实施方式中，所述压力表设置于所述深层过滤单元和所述层析单元之间。
在本发明的优选实施方式中，所述压力表设置于所述蠕动泵和所述深层过滤单元之间。
在本发明的具体实施方式中，所述层析单元的层析膜和层析膜之间、层析柱和层析柱之间、层析膜和层析柱之间设置有压力表。
在本发明的具体实施方式中，所述层析膜包括阴离子交换层析膜。优选的，所述阴离子交换层析膜为HD-Q阴离子交换层析膜。
在本发明的具体实施方式中，所述层析柱包括混合模式层析柱、阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱中的任一种或多种。优选的，所述层析柱为Capto Adhere ImpRes层析柱或CP-FT层析柱。
Capto Adhere ImpRes层析柱是指填料为Capto Adhere ImpRes；CP-FT层析柱是指填料为CP-FT。
在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤膜为A1HC深层滤膜、C0SP深层滤膜和X0HC深层滤膜中的任一种。
本发明还提供了采用上述任意一种所述蛋白纯化的系统进行的蛋白纯化的方法，包括如下步骤：
待纯化样品经蠕动泵上样后，分别经所述深层过滤单元和所述层析单元进行深层过滤处理和层析处理；所述层析为流穿模式层析。
本发明将深层过滤和其中的流穿模式层析步骤整合起来，使得仅用蠕动泵和压力表等设备同时进行深层过滤和层析步骤。在减少时间成本以及层析系统使用的同时，提高生产效率。
样品在经过深层过滤单元进行深层过滤处理后，直接上样至所述层析单元，如层析膜和/或层析柱上。
在本发明的具体实施方式中，所述流穿模式层析为一步流穿模式层析或多步流穿模式层析。
在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤处理的流速为50～200LMH，所述层析处理的流速为20～50mL/min或200～300cm/hr。
在本发明的具体实施方式中，通过调节流速，以使所述深层过滤处理之前、所述深层过滤处理与所述层析处理之间的压力均为0～2Bar，优选均＞0Bar且≤1Bar。
在实际操作中，上述压力是样品流动在深层过滤处理之前、所述深层过滤处理与所述层析处理之间所带来的压力。
在本发明的具体实施方式中，所述层析单元的上样量为1000～2000g/m2或200～400g/L。
在本发明的具体实施方式中，所述待纯化样品包括单克隆抗体和Fc融合蛋白中的任一种。
进一步的，所述单克隆抗体的样品，pH为7.0～7.6，电导率为5～10mS/cm；所述Fc融合蛋白的样品，pH为5.5～7.6，电导率＜5mS/cm。
在本发明的具体实施方式中，在所述深层过滤处理前，对所述深层过滤单元进行水洗处理。
具体的，所述水洗处理中，所述水的体积为所述深层过滤膜的膜面积的比例为(95～105)L﹕1m2，优选为100L﹕1m2。
在本发明的具体实施方式中，在所述深层过滤处理前，对所述层析单元进行消毒处理。
在本发明的具体实施方式中，所述消毒处理包括碱洗消毒处理。进一步的，采用NaOH水溶液进行所述碱洗消毒处理。具体的，所述NaOH水溶液的浓度可以为0.1～1mol/L，优选为0.5mol/L。
在本发明的具体实施方式中，在所述深层过滤处理前，采用平衡缓冲液对经过所述水洗处理的深层过滤单元和经过所述消毒处理的层析单元进行平衡处理。
具体的，所述平衡处理包括：使用平衡缓冲液平衡所述深层过滤单元和所述层析单元，所述深层过滤单元的平衡通量为15～60L/m2，平衡所述层析单元3～5CV。其中，当层析单元为层析柱时，CV是指柱体积；当层析单元为层析膜时，CV代表层析膜的体积。
在实际操作中，在对深层过滤单元水洗处理，以及对所述层析单元消毒处理后，将深层过滤单元的出口与所述层析单元的入口连接，然后采用平衡缓冲液平衡所述深层过滤单元和所述层析单元。
具体的，所述平衡缓冲液根据不同深层过滤单元和层析单元的种类进行调整。
如在具体实施方式中，当所述深层过滤单元为A1HC深层过滤膜，所述层析单元为HD-Q层析膜时，所述平衡缓冲液的pH为7.5，具体的可以为50mM Tris-HAc；所述深层过滤单元的平衡通量为15～25L/m2，优选为20～25L/m2。当所述深层过滤单元为C0SP深层过滤膜，所述层析单元为Capto Adhere ImpRes层析柱时，所述平衡缓冲液的pH为7.0，电导率为10mS/cm，具体的可以为50mM Tris-HAc，100mM NaCl；所述深层过滤单元的平衡通量为40～50L/m2，优选为45～50L/m2。当所述深层过滤单元为X0HC深层过滤膜，所述层析单元为串联的HD-Q层析膜和CP-FT层析柱时，所述平衡缓冲液的pH为5.5，具体的可以为50mM NaAc-HAc；所述深层过滤单元的平衡通量为50～60L/m2，优选为54～60L/m2。
在本发明的具体实施方式中，在上样结束后，采用所述平衡缓冲液对所述深层过滤单元和所述层析单元进行顶洗处理。
从上样开始处理，在层析单元的末端出口收集流穿液，直至顶洗处理后，收集完成。
在实际操作中，待收集完成后，将所述深层过滤单元和所述层析单元之间的连接断开，可废弃深层过滤单元如深层过滤膜，然后对所述层析单元进行再生处理后，采用足量的保存液进行保存处理。具体的再生处理的操作可根据不同的层析柱和/或层析膜进行调整。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过采用深层过滤膜与层析膜和/或层析柱配合，能够同时处理多个步骤，无需将深层过滤处理和层析处理分开操作，极大的提高了生产效率；并且，无需采用现有的全自动化的层析系统，降低了生产成本；
(2)本发明采用相对应的膜面积和层析膜的膜体积或层析柱的柱体积，能够保证在深层过滤后，直接进行层析处理，不会出现单个步骤的压力过高的情况；
(3)本发明将深层过滤和其中的流穿模式层析步骤整合起来，使得仅用蠕动泵和压力表等设备同时进行深层过滤和层析步骤；在减少时间成本以及层析系统使用的同时，提高生产效率。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本实施例提供了蛋白纯化系统，包括深层过滤单元、层析单元和蠕动泵；所述蠕动泵的蠕动泵管的出口连接于所述深层过滤单元的入口；所述深层过滤单元的出口连接于所述层析单元的入口；
所述层析单元包括层析膜和/或层析柱；所述深层过滤单元包括深层过滤膜；
所述深层过滤膜的膜面积与所述层析膜的膜体积之比为1m2﹕(100～110)mL；
所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比为1m2﹕(8～10)L。
在本发明的优选实施方式中，所述系统包括一个蠕动泵。本发明的蛋白纯化的系统，仅通过一个蠕动泵，即可将深层过滤处理与一步层析步骤或多步层析步骤整合在一起，采用合适相对应的膜面积和层析膜的膜体积或层析柱的柱体积，使得各个操作步骤的压力不会出现过高的情况。
在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析膜的膜体积之比为1m2﹕(102～108)mL，优选为1m2﹕(104～105)mL，更优选为1.1m2﹕115mL。
如在不同实施方式中，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析膜的膜体积之比可以为1m2﹕102mL、1m2﹕103mL、1m2﹕104mL、1m2﹕105mL、1m2﹕106mL、1m2﹕107mL、1m2﹕108mL，可根据实际需求进行选择。经优化，在1.1m2﹕115mL的情况下，稳定性最佳。上述比例是指单个深层过滤膜的膜面积与单个层析膜的膜体积之比。
在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比为1m2﹕(8.5～9.5)L，更优选为1.1m2﹕9.8L。
如在不同实施方式中，所述深层过滤膜的膜面积与所述层析柱的柱体积之比可以为1m2﹕8.5L、1m2﹕8.6L、1m2﹕8.7L、1m2﹕8.8L、1m2﹕8.9L、1m2﹕9.0L、1m2﹕9.1L、1m2﹕9.2L、1m2﹕9.3L、1m2﹕9.4L、1m2﹕9.5L等等，可根据实际需求进行选择。经优化，在1.1m2﹕9.8L的情况下，稳定性最佳。上述比例是指单个深层过滤膜的膜面积与单个层析柱的柱体积之比。
在本发明的具体实施方式中，所述层析单元包括一个层析膜或多个串联的层析膜；
或者，所述层析单元包括一个层析柱或多个串联的层析柱；
或者，所述层析单元包括串联的一个层析膜和一个层析柱；
或者，所述层析单元包括一个层析膜和多个串联的层析柱，所述层析膜和所述多个串联的层析柱串联连接；
或者，所述层析单元包括多个串联的层析膜和一个层析柱，所述多个串联的层析膜和所述层析柱串联连接。
层析柱和层析膜的个数可根据实际操作需求进行调整选择。
在本发明的优选实施方式中，所述系统还包括至少一个压力表。通过压力表监控各个步骤的操作压力，避免过高；根据压力表反馈的压力情况，当压力过高时，可通过蠕动泵适当调低流速使得压力在可控范围内。
在本发明的优选实施方式中，所述压力表设置于深层过滤单元和所述层析单元之间。
在本发明的具体实施方式中，所述层析单元的层析膜和层析膜之间、层析柱和层析柱之间、层析膜和层析柱之间设置有压力表，以监测各个层析膜或层析柱上样前的压力。
在本发明的具体实施方式中，所述层析膜包括阴离子交换层析膜。优选的，所述阴离子交换层析膜为HD-Q阴离子交换层析膜。
在本发明的具体实施方式中，所述层析柱包括混合模式层析柱、阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱中的任一种或多种。优选的，所述层析柱为Capto Adhere ImpRes层析柱或CP-FT层析柱。
Capto Adhere ImpRes层析柱是指填料为Capto Adhere ImpRes；CP-FT层析柱是指填料为CP-FT。
在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤膜为A1HC深层滤膜、C0SP深层滤膜和X0HC深层滤膜中的任一种。
实施例1
本实施例的蛋白纯化系统，将深层过滤与流穿模式的阴离子交换层析膜整合，所述系统包括深层过滤膜、阴离子交换层析膜和蠕动泵；所述蠕动泵的蠕动管的出口连接于所述深层过滤膜的入口，所述深层过滤膜的出口连接于所述阴离子交换层析膜的入口。在所述蠕动泵与所述深层过滤膜之间、所述深层过滤膜和所述阴离子交换层析膜之间设置有压力表。
具体的，所述深层过滤膜为默克公司的A1HC深层过滤膜，所述阴离子交换层析膜为默克公司的HD-Q阴离子交换层析膜。
本实施例提供了蛋白纯化的方法，包括如下步骤：
(1)采用1.1m2的A1HC深层过滤膜和115mL的HD-Q阴离子交换层析膜，先用110L纯水冲洗深层过滤膜，同时用0.5M的NaOH水溶液对阴离子交换层析膜进行碱洗消毒，冲洗和消毒完成后，将A1HC深层过滤膜的出口和HD-Q阴离子交换层析膜的入口连接。
(2)使用超过22L的pH为7.5的50mM Tris-HAc平衡连接好的A1HC深层过滤膜和HD-Q阴离子交换层析膜，平衡完成后进行上样操作。
(3)所述样品为单克隆抗体，上样样品的条件为pH为7.5，电导率小于6mS/cm；通过蠕动泵以200LMH的流速将样品上样至深层过滤膜，样品经过A1HC深层过滤膜深层过滤后直接上样至HD-Q阴离子交换层析膜；上样过程中监控深层过滤膜和阴离子交换层析膜之前的压力，保持压力在0～2Bar范围内，在压力升高超过该范围时，适当调低流速至约50LMH，使压力恢复至上述范围之内；
在上样开始时，即在所述阴离子交换层析膜的出口端收集样品流穿液，在上样量达到1000g/m2之后，结束上样。
(4)上样完成后，通过蠕动泵使用超过33L的所述平衡缓冲液将A1HC深层过滤膜和HD-Q阴离子交换层析膜内部残留的样品顶洗出来，最后收获经深层过滤处理和阴离子交换层析处理的流穿样品。
(5)在收集完成后，将深层过滤膜和阴离子交换层析膜之间的连接断开，废弃深层过滤膜，然后用0.5M的NaOH的水溶液对使用后的阴离子交换层析膜进行消毒再生，之后用保存液对消毒再生后的阴离子交换层析膜进行保存以用于后续的纯化。
实验结果见表1。控制组采用普通纯化工艺，将深层过滤和阴离子交换层析分步走，实验组采用连续流工艺。通过和普通工艺对比，本实施例的生产率提升近50％，并且产品质量保持一致。
表1实施例1实验结果
实施例2
本实施例的蛋白纯化系统，将深层过滤与流穿模式的混合模式层析柱整合，所述系统包括深层过滤膜、混合模式层析柱和蠕动泵；所述蠕动泵的蠕动管的出口连接于所述深层过滤膜的入口，所述深层过滤膜的出口连接于所述混合模式层析柱的入口。在所述蠕动泵与所述深层过滤膜之间、所述深层过滤膜和所述混合模式层析柱之间设置有压力表。
具体的，所述深层过滤膜为默克公司的C0SP深层过滤膜，所述混合模式层析柱为Capto Adhere ImpRes层析柱，其填料为GE公司的Capto Adhere ImpRes。
本实施例提供了蛋白纯化的方法，包括如下步骤：
(1)采用1.1m2的C0SP深层过滤膜和9.8L的Capto Adhere ImpRes层析柱(直径为25cm，柱高为20cm)，先用110L纯水冲洗深层过滤膜，同时用0.5M的NaOH水溶液对CaptoAdhere ImpRes层析柱进行碱洗消毒，冲洗和消毒完成后，将C0SP深层过滤膜的出口和Capto Adhere ImpRes层析柱的入口连接。
(2)使用超过50L的pH为7.0、电导率为10mS/cm的50mM Tris-HAc，100mM NaCl平衡连接好的C0SP深层过滤膜和Capto Adhere ImpRes层析柱，平衡完成后进行上样操作。
(3)所述样品为单克隆抗体，上样样品的条件为pH为7.0，电导率为10mS/cm；通过蠕动泵以200LMH的流速将样品上样至深层过滤膜，样品经过C0SP深层过滤膜深层过滤后直接上样至Capto Adhere ImpRes层析柱；上样过程中监控深层过滤膜和混合模式层析柱之前的压力，保持压力在0～2Bar范围内，在压力升高超过该范围时，适当调低流速至约50LMH，使压力恢复至上述范围之内；
在上样开始时，即在所述Capto Adhere ImpRes层析柱的出口端收集样品流穿液，在上样量达到300g/L之后，结束上样。
(4)上样完成后，通过蠕动泵使用超过50L的所述平衡缓冲液将C0SP深层过滤膜和Capto Adhere ImpRes层析柱内部残留的样品顶洗出来，最后收获经深层过滤处理和混合模式层析柱处理的流穿样品。
(5)在收集完成后，将深层过滤膜和混合模式层析柱之间的连接断开，废弃深层过滤膜，然后用1M的HAc的水溶液对使用后的混合模式层析柱进行再生，再生后用0.5M的NaOH的水溶液对混合模式层析柱进行消毒，之后用保存液对再生消毒后的混合模式层析柱进行保存以用于后续的纯化。
实验结果见表2。控制组采用普通纯化工艺，将深层过滤和混合模式层析分步走，实验组采用连续流工艺。通过和普通工艺对比，本实施例的生产率提升47％，并且产品质量保持一致。
表2实施例2实验结果
实施例3
本实施例的蛋白纯化系统，将深层过滤与流穿模式的阴离子交换层析膜以及流穿模式的阳离子交换层析柱整合，所述系统包括深层过滤膜、阴离子交换层析膜、阳离子交换层析柱和蠕动泵；所述蠕动泵的蠕动管的出口连接于所述深层过滤膜的入口，所述深层过滤膜的出口连接于所述阴离子交换层析膜的入口，所述阴离子交换层析膜的出口连接于所述阳离子交换层析柱的入口。在所述蠕动泵与所述深层过滤膜之间、所述深层过滤膜和所述阴离子交换层析膜之间、所述阴离子交换层析膜与所述阳离子交换层析柱之间设置有压力表。
具体的，所述深层过滤膜为默克公司的X0HC深层过滤膜，所述阴离子交换层析膜为默克公司的HD-Q阴离子交换层析膜，所述阳离子交换层析柱为CP-FT层析柱，其填料为默克公司的CP-FT。
本实施例提供了蛋白纯化的方法，包括如下步骤：
(1)采用1.1m2的X0HC深层过滤膜、115mL的Natrix HD-Q阴离子交换层析膜和1L的CP-FT层析柱(柱高为20cm)，先用110L纯水冲洗深层过滤膜；将Natrix HD-Q阴离子交换层析膜和CP-FT层析柱连接起来，用0.5M的NaOH水溶液对Natrix HD-Q阴离子交换层析膜和CP-FT层析柱同时进行碱洗消毒，冲洗和消毒完成后，将X0HC深层过滤膜的出口和Natrix HD-Q阴离子交换层析膜的入口连接。
(2)使用超过60L的pH为5.5的50mM NaAc-HAc溶液，平衡连接好的X0HC深层过滤膜、Natrix HD-Q阴离子交换层析膜和CP-FT层析柱，平衡完成后进行上样操作。
(3)所述样品为Fc融合蛋白，上样样品的条件为pH为5.5，电导率小于5mS/cm；通过蠕动泵以200LMH的流速将样品上样至深层过滤膜，样品经过X0HC深层过滤膜深层过滤后直接上样至Natrix HD-Q阴离子交换层析膜和CP-FT层析柱；上样过程中监控深层过滤膜、阴离子交换层析膜和层析柱之前的压力，保持压力在0～1Bar范围内，在压力升高超过该范围时，适当调低流速至约50LMH，使压力恢复至上述范围之内；
在上样开始时，即在所述CP-FT层析柱出口端收集样品流穿液，在上样量达到1000g/m2之后，结束上样。
(4)上样完成后，通过蠕动泵使用超过60L的所述平衡缓冲液将X0HC深层过滤膜、Natrix HD-Q阴离子交换层析膜和CP-FT层析柱内部残留的样品顶洗出来，最后收获经深层过滤处理、阴离子交换层析处理和阳离子交换层析处理的流穿样品。
(5)在收集完成后，将深层过滤膜和阴离子交换层析膜之间的连接断开，废弃深层过滤膜，然后用0.5M的NaOH的水溶液对阴离子交换层析膜和阳离子交换层析柱同时进行消毒处理，之后用足量的保存液对消毒后的阴离子交换层析膜和阳离子交换层析柱进行保存以用于后续的纯化。保存完成后，断开阴离子交换层析膜和阳离子交换层析柱的连接。
实验结果见表3。控制组采用普通纯化工艺，将深层过滤和混合模式层析分步走，实验组采用连续流工艺。通过和普通工艺对比，本实施例的生产率提升56％，并且产品质量保持一致。
表3实施例3实验结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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