阅读说明：本技术 一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用 (Preparation method and application of phosphatidyl glycoside ) 是由 薛长湖 刘炎峻 徐杰 姜晓明 李兆杰 丛培旭 王玉明 王静凤 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于活性物质筛选技术领域,具体涉及一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用。本发明通过磷脂酶D水解磷脂酰胆碱,同时与糖类底物作用,生成磷脂酰糖苷。实现了酶法合成磷脂酰糖苷,并证实了所得到的磷脂酰糖苷具有预防减轻阿尔兹海默病症的能力,能改善行为认知障碍。(The invention belongs to the technical field of active substance screening, and particularly relates to a preparation method and application of phosphatidyl glycoside. The invention hydrolyzes phosphatidylcholine through phospholipase D, and reacts with carbohydrate substrate to generate phosphatidyl glycoside. Realizes the enzymatic synthesis of the phosphatidyl glycoside, and proves that the obtained phosphatidyl glycoside has the capacity of preventing and relieving Alzheimer disease and can improve behavior cognitive disorder.)

一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用

技术领域：

本发明属于活性物质筛选技术领域，具体涉及一种磷脂酰糖苷的制备方法及其应用。

背景技术：

阿尔茨海默症(Alzheimer'sdisease,AD)是一种神经退行性疾病，是目前最常见和最具破坏性的痴呆症，被世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)认定为全世界公共卫生的首要问题之一，影响了全世界近5000万人。阿尔兹海默症患者的海马和皮质会发生萎缩，最重要的神经病理学标志是Tau蛋白的过度磷酸化以及神经原纤维缠结的过度积累和淀粉样蛋白β(Amyloidbeta,Aβ)形成的淀粉样斑块沉积。此外，主要发病特征还有突触与神经元的功能丧失，反应性神经胶质增生，氧化和炎症损害。令人遗憾的是，目前AD的药物治疗仍处于初期阶段，可提供症状缓解但不会减缓疾病进展，由于社会和医疗保健的高成本，高患病率和死亡率，同时又缺乏有效的治疗方式，阿尔茨海默症已经成为一个亟待迫切解决的问题。

磷脂酰葡糖苷(PtdGlc)是目前唯一发现的磷脂酰糖苷化合物，从胎儿啮齿动物的大脑中成功分离出的纯PtdGlc仅具有一种脂肪酸组合：即sn-1和sn-2链分别分别是硬脂酸(C18：0)和花生酸(C20：0)。PtdGlc也存在于人类嗜中性粒细胞中，其脂肪酸组成包含C18:0/C18:0和C18:0/C20:0。磷脂酰葡糖苷这种糖基化脂质，已经被发现在多种细胞过程中起着基本作用。磷脂酰葡糖苷已被证明与神经传导相关，特别是TrkA与TrkC相关的轴突调控。磷脂酰葡糖苷的代谢产物，溶血磷脂酰-β-d-葡萄糖苷(LysoPtdGlc)，一种亲水性甘油磷脂，也被证明了其在激活GPR55在脊髓感觉轴突的形态特异性排斥指导中的作用。虽然知道磷脂酰糖苷在脑中的重要性，但是目前仍没有研究摄入磷脂酰糖苷对神经退行性疾病的作用。同时，由于分离技术的限制，极其难以纯化得到高纯度的磷脂酰葡糖苷。

发明内容

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本发明要解决的技术问题是目前仍没有研究摄入磷脂酰糖苷对神经退行性疾病的作用；同时，由于分离技术的限制，极其难以纯化得到高纯度的磷脂酰葡糖苷。

为解决上述问题，本发明利用磷脂酶D实现了酶法合成磷脂酰糖苷，并证实了所得到的磷脂酰糖苷具有预防减轻阿尔兹海默病症的能力，能改善行为认知障碍。

为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种磷脂酰糖苷的制备方法，通过磷脂酶D水解磷脂酰胆碱，同时与糖类底物作用，生成磷脂酰糖苷。

进一步的，所述磷脂酰胆碱在反应前与硅胶粉末充分混合，便于后续磷脂酰胆碱底物能够均匀分散于反应体系中。

进一步的，所述磷脂酶D和糖类底物在反应前混合溶于磷酸盐缓冲液中，提供酶反应需要的水环境。

进一步的，将混合硅胶粉末后的磷脂酰胆碱与磷脂酶D(10-40U/ml)和糖类底物的溶液(磷脂酰胆碱：糖类底物＝1:40-1:10mol/mol)混合，然后于35-45℃温度环境下充分搅拌12h后离心收集沉淀，在此期间，磷脂酶D可以催化水解磷脂酰胆碱中的胆碱基团，并与糖类底物进行脂交换反应，生成我们所需要的磷脂酰糖苷。温度和时间的改变或者糖类底物的不足会导致底物中磷脂酸等副产物的产生。

进一步的，将石油醚与乙醇溶液按照4:1(V/V)的比例混合后，加入反应后的沉淀，搅拌十分钟，静置分层后取走上层石油醚相，提取反应后的沉淀3次，每次加入等量的加入相同体积的石油醚，此时产物磷脂酰糖溶于上层石油醚相，而多余的胆碱与底物丝氨酸则呈絮状沉淀，而多余的底物磷脂酰胆碱则溶于乙醇层。

进一步的，合并石油醚相并去除后得到高纯度的磷脂酰糖苷。

进一步的，所述糖基底物(构成磷脂酰糖苷的极性头部)来源为不同构型的单糖，寡糖，多糖，氨基糖、以及糖醇，具体包括葡萄糖、海藻糖、核糖、脱氧核糖、赤藓糖、苏力糖、***糖、木糖、来苏糖、甘露糖、半乳糖、UDP-葡糖、鼠李糖、岩藻糖、ADP-葡糖、CDP-葡糖、GDP-葡糖、TDP-葡糖、蔗糖、麦芽糖、龙胆二糖，乳糖，纤维二糖，棉子糖、水苏糖，山梨醇、木糖醇、核糖醇、甘露糖醇、葡萄糖醇、葡糖胺、半乳糖胺；磷脂酰胆碱底物来源为大豆，蛋黄，海洋动物(鱿鱼，海参，鳕鱼，三文鱼，鲅鱼，贻贝，牡蛎，海胆，海星，海螺)等提取而来的磷脂酰胆碱。

一种上述方法制备的磷脂酰糖苷，为sn-1与sn-2位连接为脂肪酸，sn-3位具有由磷酸相连的糖基构成极性头部的磷脂化合物，其纯度在85％以上。

一种磷脂酰糖苷在治疗神经退行性疾病制品中的应用以及在预防、改善以及治疗阿尔兹海默症制品中的应用。

所述的制品包含有药理有效浓度的磷脂酰糖苷。

所述的制品为药品或特医食品，保健品以及生物制剂，优选为药品或特医食品。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所制备的磷脂酰糖苷，纯度在85％以上。

(2)本发明所制备的磷脂酰糖苷可以显著降低阿尔兹海默病症小鼠的行为认知功能，改善大脑Aβ聚集，Tau蛋白聚集，可用于制备预防和治疗阿尔兹海默病症等疾病的药物，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为实施案例2中，本发明所制备的磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷，对APP/PS1阿尔兹海默病症小鼠的行为认知水平的改善作用(水迷宫结果统计图)。

图2为实施案例2中，本发明所制备的磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷，对APP/PS1阿尔兹海默病症小鼠的Aβ1-42表达水平的改善作用。(上方为黑白图、下方为该图片的彩图)

图3为实施案例2中，本发明所制备的磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷，对APP/PS1阿尔兹海默病症小鼠的Tau蛋白表达水平以及Tau蛋白聚集病理的改善作用。(上方为黑白图、下方为该图片的彩图)

具体实施方式

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为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种磷脂酰葡糖苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)将100g磷脂酰胆碱与相同重量的硅胶粉末充分混合；

(2)将400g葡萄糖和磷脂酶D(200000U)溶于10L磷酸盐缓冲液中；

(3)将硅胶粉与上述磷酸盐缓冲液混合后于40℃温度环境下充分搅拌12h；

(4)离心收集沉淀，用1L石油醚/乙醇溶液(4:1)溶液提取3次，每次补充800mL石油醚后搅拌十分钟；

(5)合并石油醚相，通过旋蒸去除有机溶剂后得到高纯度的磷脂酰糖苷。

将上述产物用HPLC-ELSD方法检测磷脂酰糖苷含量，磷脂酰葡糖苷含量为92.5％。

实施例2：

一种磷脂酰葡糖苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)将100g磷脂酰胆碱与相同重量的硅胶粉末充分混合；

(2)将600g海藻糖和磷脂酶D(200000U)溶于10L磷酸盐缓冲液中；

(3)将硅胶粉与上述磷酸盐缓冲液混合后于40℃温度环境下充分搅拌12h；

(4)离心收集沉淀，用1L石油醚/乙醇溶液(4:1)溶液提取3次，每次补充800mL石油醚后搅拌十分钟；

(5)合并有机相，通过旋蒸去除有机溶剂后得到高纯度的磷脂酰糖苷。

将上述产物用HPLC-ELSD方法检测磷脂酰糖苷含量，磷脂酰葡糖苷含量为94.6％。

其中，实施例1和实施例2中的磷脂酰糖苷含量检测过程如下：通过HPLC-ELSD(Waters1525型液相色谱仪，配置2424型ELSD检测器)方法进行检测，流动相A：正己烷：异丙醇：5mM甲酸铵(82:17:1.0，v/v/v)；流动相B：异丙醇：水：5mM甲酸铵(85:14:1.0，v/v/v)。洗脱程序为25.5分钟逐步从100％A升高到100％B，并降回100％A。色谱分析条件：色谱柱为ZORBAXRx-SIL型正相硅胶色谱分析柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温35℃，流速1mL/min，进样量20μL，ELSD参数：漂移管温度60℃，雾化气(空气)压力25psi。

实施例3：磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷的生物活性评价

磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷是sn-3位通过磷酸基团连接葡萄糖和海藻糖的磷脂化合物。本发明通过提取制备可得到高纯度的磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷，在三个月连续摄入磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷后，通过检测对APP/PS1双转基因阿尔兹海默病症模型小鼠的认知水平，Aβ合成与Tau蛋白聚集，发现其可以改善阿尔兹海默症。具体实验步骤如下：

实验对象：17周龄雄性APP/PS1双转基因小鼠，SPF级，体重30～40克，20只，常规环境饲养。

实验分组：对照组(野生型小鼠)；模型组(APP/PS1小鼠)；磷脂酰葡糖苷治疗组(摄入磷脂酰葡糖苷组，饲料中含0.5％磷脂酰葡糖苷)；磷脂酰海藻糖苷治疗组(摄入磷脂酰海藻糖苷组，饲料中含0.5％磷脂酰海藻糖苷)；每组10只。

表达水平检测：通过免疫荧光检测Aβ蛋白表达，通过免疫印迹检测磷酸化Tau蛋白表达水平。

小鼠学***台所用的时间)，路径作为衡量小鼠学习记忆和测试成绩的指标。

统计学分析：采用SPSS软件进行Tukey’stest分析，以P<0.05作为显著差异。

实验结果：

(1)如图1所示，实施案例2采用Morris水迷宫测试系统，通过检测其潜伏期(即小鼠从入水点起到找到平台所用的时间)，路径作为衡量小鼠学***台所用的时间与模型组相比显著下降。其结果证明APP/PS1阿尔兹海默病症模型小鼠跟正常组相比，找到平台所需潜伏期时间最长，其学习记忆能力受到损伤，而在给予磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷后，治疗组小鼠潜伏期时间变短，其行为认知能力得到明显改善。

(2)如图2所示，黑白图中灰色区域对应彩图红色荧光信号，即海马组织的Aβ1-42荧光信号，野生型小鼠组的Aβ1-42荧光信号较弱，即黑白图中灰色区域较少，APP/PS1模型组则具有较强的Aβ1-42红色荧光信号(彩图)和灰色Aβ斑点(黑白图)，代表阿尔茨海默症模型中Aβ斑块的聚集，而与APP/PS1模型组相比，磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷组具有较低的Aβ1-42红色荧光信号(彩图)和灰色Aβ斑点(黑白图)。由于大脑Aβ聚集是阿尔茨海默病病人的重要病理学特征，这些免疫荧光结果证明磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷治疗后，Aβ1-42显著下降。

(3)如图3所示，黑白图中灰色斑块区域对应彩图黄色的Tau蛋白沉积斑块，野生型小鼠组的Tau蛋白沉积斑块较弱，即黑白图中灰色区域较少，APP/PS1模型组则具有较多的Tau蛋白沉积斑块(彩图)和灰色斑块区域(黑白图)，代表阿尔茨海默症模型中Tau蛋白的异常聚集，而与APP/PS1模型组相比，磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷组具有较少的Tau蛋白沉积斑块(彩图)和灰色斑块区域(黑白图)。由于大脑Tau蛋白异常聚集也是阿尔茨海默病病人的核心病理学特征之一，这些免疫荧光结果证明饮食摄入磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷后，Tau蛋白的聚集病理现象显著得到改善。

综上，磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷组均能明显改善小鼠行为认知水平并降低Aβ1-42以及磷酸化Tau蛋白的表达水平，效果最佳，提示磷脂酰葡糖苷和磷脂酰海藻糖苷能够预防、改善或治疗阿尔兹海默病症。而且本发明的产品生产工艺简单，具有良好的防治阿尔兹海默病症的活性，具有广阔的市场前景。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可以利用上述技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。