阅读说明：本技术 一种制备甘油葡糖苷的方法 (Method for preparing glycerol glucoside ) 是由 郭欣 陈青来 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备甘油葡糖苷的方法,包括如下步骤：将浓度为60～300g/L的蔗糖与浓度为20～150g/L的甘油在浓度为50～150g/L的复合生物酶及浓度为20～60mmol/L的柠檬酸三钠缓冲液中以3∶1∶2∶1的体积比,在45～55℃的条件下反应30～40小时。本发明的有益效果是：直接利用菌体细胞作为生物催化剂,避免了购买昂贵的商业用酶制剂或者进行复杂的菌体破壁处理,可大大减少生产用地及固定资产的投入,生产成本更低,制备工艺简单,且甘油葡糖苷的产量高。(The invention discloses a method for preparing glycerol glucoside, which comprises the following steps: reacting 60-300 g/L of sucrose and 20-150 g/L of glycerol in 50-150 g/L of compound bio-enzyme and 20-60 mmol/L of trisodium citrate buffer solution at a volume ratio of 3: 1: 2: 1 at 45-55 ℃ for 30-40 hours. The invention has the beneficial effects that: the bacterial cells are directly used as biocatalysts, thereby avoiding purchasing expensive commercial enzyme preparations or carrying out complex bacterial wall breaking treatment, greatly reducing the investment of production land and fixed assets, having lower production cost, simple preparation process and high output of the glycerol glucoside.)

一种制备甘油葡糖苷的方法

技术领域

本发明属于2-O-α-D-甘油葡糖苷制备工艺领域，尤其涉及一种制备甘油葡糖苷的方法。

背景技术

甘油葡萄糖苷(又称为2-甘油葡糖苷)，普遍存在于自然界中，特别是在耐盐的蓝藻细菌中，比如蓝绿藻和南非密罗木(也叫不死草、复活草)。它是密罗木能在极端环境中生存和重新激活复生的最主要的活性物质，能牢牢锁住体内珍贵的最后一滴水，因而甘油葡萄糖苷具有极强的″滋润、锁水、保湿″的生理效果，可作为化妆品的功能性原料，具有较大的市场需求。另外，甘油葡萄糖苷也被作为一种无致龋性的甜味剂添加到食品中，日本Takenaka F.等鉴定了日本清酒中3种不同构型的甘油葡糖苷，并通过化学合成的方法实现这3种物质的化学合成(Biosci Biotechnol Biochem，2000，64：378-385)。

目前制备甘油葡糖苷的方法主要包括化学合成和酶催化合成法。植物提取受限于场地、来源等，不能大规模生产；化学合成方法具有高污染、高能耗、制备工艺复杂等缺点，且化学合成存在着杂质较多的问题(合成中会引入1-甘油葡萄苷，而2-甘油葡糖苷的锁水保湿功能最好)，因而目前主要采用专一性高的生物酶法来合成。以蔗糖和甘油为原料，在蔗糖磷酸化酶的作用下生产2-甘油葡萄糖苷。但现有的甘油葡糖苷制备方法存在制备成本高的缺点，尤其是2-O-α-D-甘油葡糖苷的制备方法存在制备成本高，产量低的问题，而2-O-α-D-甘油葡糖苷不仅具有保湿功能，还具有修复功能，使用范围更广。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种制备甘油葡糖苷的方法，包括如下步骤：将浓度为60～300g/L的蔗糖与浓度为20～150g/L的甘油在浓度为50～150g/L的复合生物酶及浓度为20～60mmol/L的柠檬酸三钠缓冲液中以3∶1∶2∶1的体积比，在45～55℃的条件下反应30～40小时，通过超滤膜过滤去除酶；并通过离子交换树脂纯化后减压蒸馏浓缩，过滤去除固体杂质，得到甘油葡糖苷成品；其中，所述柠檬酸三钠缓冲液的pH为4.5～5.5；所述复合生物酶包括蔗糖磷酸化酶和大肠杆菌。

进一步，所述柠檬酸三钠缓冲液的pH为5.5。

进一步，所述复合生物酶为含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物。

进一步，所述复合生物酶加入反应前在35℃、转速200rpm条件下振荡培养10小时。

进一步，所述复合生物酶振荡培养前加入发酵培养基进行发酵培养；所述发酵培养基各组成及重量百分比为：酵母浸粉3.5％、蛋白胨0.2％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钠0.6％、蔗糖0.3％、甘油0.2％、葡萄糖0.1％、氯化钙0.005％，余量为水。

本发明的有益效果是：直接利用菌体细胞作为生物催化剂，避免了购买昂贵的商业用酶制剂或者进行复杂的菌体破壁处理，可大大减少生产用地及固定资产的投入，生产成本更低，制备工艺简单，且甘油葡糖苷的产量高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步描述，实施例是为了更好的说明本发明，而不是对本发明进行限制。

实施例1

将浓度为60g/L的蔗糖与浓度为20g/L的甘油在浓度为50g/L的复合生物酶及浓度为20mmol/L的柠檬酸三钠缓冲液中以3∶1∶2∶1的体积比，在45℃的条件下反应30小时，通过超滤膜过滤去除酶；并通过离子交换树脂纯化后减压蒸馏浓缩，过滤去除固体杂质，得到甘油葡糖苷成品；其中，柠檬酸三钠缓冲液的pH为4.5；复合生物酶为包括蔗糖磷酸化酶和大肠杆菌的菌体浆状物。

复合生物酶加入反应前，先加入发酵培养基进行发酵培养，酵生产蔗糖磷酸化酶；发酵培养基各组成及重量百分比为：酵母浸粉3.5％、蛋白胨0.2％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钠0.6％、蔗糖0.3％、甘油0.2％、葡萄糖0.1％、氯化钙0.005％，余量为水。之后在35℃、转速200rpm条件下振荡培养10小时，之后通过离心机4000转/10min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物。该菌体浆状物即作为本实施例的复合生物酶加入反应中。

本实施例的制备方法制备的甘2-O-α-D-甘油葡糖苷产量高达110.0g/L，基于底物蔗糖的转化率为89.1％。

实施例2

将浓度为300g/L的蔗糖与浓度为150g/L的甘油在浓度为150g/L的复合生物酶及浓度为60mmol/L的柠檬酸三钠缓冲液中以3∶1∶2∶1的体积比，在55℃的条件下反应40小时，通过超滤膜过滤去除酶；并通过离子交换树脂纯化后减压蒸馏浓缩，过滤去除固体杂质，得到甘油葡糖苷成品；其中，柠檬酸三钠缓冲液的pH为5.5；复合生物酶包括蔗糖磷酸化酶和大肠杆菌的菌体浆状物。

复合生物酶加入反应前，先加入发酵培养基进行发酵培养，酵生产蔗糖磷酸化酶；发酵培养基各组成及重量百分比为：酵母浸粉3.5％、蛋白胨0.2％、氯化钠0.3％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钠0.5％、蔗糖0.2％、甘油0.1％、葡萄糖0.1％、氯化钙0.005％，余量为水。之后在40℃、转速200rpm条件下振荡培养20小时，之后通过离心机4000转/10min离心收集含蔗糖磷酸化酶的菌体浆状物。该菌体浆状物即作为本实施例的复合生物酶加入反应中。

本实施例的制备方法甘油葡糖苷产量高达120.0g/L，基于底物蔗糖的转化率为90.3％。

对比例1

与实施例1的区别仅在于：实施例1在45℃的条件下反应30小时，本对比例1在70℃的条件下反应30小时，其余步骤与实施例1相同。

结果：甘油葡糖苷产量仅为35.0g/L，基于底物蔗糖的转化率仅为24.2％。

对比例2

与实施例1的区别仅在于：实施例1在45℃的条件下反应30小时，本对比例2在20℃的条件下反应30小时，其余步骤与实施例1相同。

结果：甘油葡糖苷产量仅为18.3g/L，基于底物蔗糖的转化率仅为12.2％。

结论：转化温度对于实现本发明的技术效果具有重要影响。

对比例3

与实施例1的区别仅在于：实施例1的柠檬酸三钠缓冲液的pH为4.5，本对比例3柠檬酸三钠缓冲液的pH为3.5，其余步骤与实施例1相同。

结果：甘油葡糖苷产量仅为21.0g/L，基于底物蔗糖的转化率仅为13.2％。

对比例4

与实施例1的区别仅在于：实施例1的柠檬酸三钠缓冲液的pH为4.5，本对比例4柠檬酸三钠缓冲液的pH为8，其余步骤与实施例1相同。

结果：甘油葡糖苷产量仅为57.3g/L，基于底物蔗糖的转化率仅为39.2％。

结论：pH值对于实现本发明的技术效果具有重要影响。