阅读说明：本技术 核桃分心木中酚酸葡萄糖苷类化合物的分离方法及应用 (Separation method and application of phenolic acid glucoside compounds in diaphragma juglandis fructus ) 是由 孙秀兰 徐一达 徐德平 张银志 耿树香 宁德鲁 马婷 于 2020-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了核桃分心木中酚酸葡萄糖苷类化合物的分离方法及应用,属于食品技术领域。所述方法包括以下步骤：(1)提取：核桃分心木经粉碎后,采用乙醇提取得到核桃醇提物；(2)分离：将步骤(1)得到的核桃醇提物进行柱层析,并依次采用不同浓度乙醇依次洗脱,反复净化洗脱,分离得到酚酸葡萄糖苷类化合物；所述酚酸葡萄糖苷类化合物为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。通过药理实验证实这三种化合物具有良好的抗氧化活性。(The invention discloses a separation method and application of phenolic acid glucoside compounds in diaphragma juglandis, and belongs to the technical field of food. The method comprises the following steps: (1) extraction: crushing walnut diaphragma juglandis, and extracting with ethanol to obtain walnut ethanol extract; (2) separation: performing column chromatography on the walnut alcohol extract obtained in the step (1), sequentially eluting by adopting ethanol with different concentrations, repeatedly purifying and eluting, and separating to obtain phenolic acid glucoside compounds; the phenolic acid glucoside compounds are 2-hydroxy-5-methoxyphenyl-O-beta-D-glucopyranoside, 6-hydroxynaphthyl-1, 2- (2-O-beta-D-glucopyranoside) and 2, 6-dihydroxynaphthyl-O-beta-D-glucopyranoside. Pharmacological experiments prove that the three compounds have good antioxidant activity.)

核桃分心木中酚酸葡萄糖苷类化合物的分离方法及应用

技术领域

本发明涉及核桃分心木中酚酸葡萄糖苷类化合物的分离方法及应用，属于食品技术领域。

背景技术

核桃是胡桃(Juglans regial L.)的成熟种子，含有丰富的不饱和脂肪酸，有“木本油料王”之称，具有改善脑缺血，抗疲劳，提高记忆力的作用。然而目前对核桃产品的综合利用与开发依旧不够，比如核桃副产物中分心木。目前关于核桃分心木的文献报到说明核桃分心木中有槲皮素、儿茶素等黄酮类化合物，薄荷醇、雪松醇等挥发性物质，没食子酸等酚酸类化合物，且具有抗菌、抗氧化、降糖、抑制脑功能衰退、抗肿瘤等多种活性功能。然而，具体是哪几个化合物且其对应的生物活性功能尚不明确，还需要进一步深入研究确证。为提高核桃副产物的综合利用，提升核桃产品附加值，弄清核桃分心木中的功效成分十分必要。

发明内容

本发明首次从核桃分心木中分离得到三种酚酸葡萄糖苷类化合物，分别为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)以及2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，通过药理实验证实具有良好的抗氧化活性。

本发明的第一个目的是提供一种从核桃分心木中分离酚酸葡萄糖苷类化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取：核桃分心木经粉碎后，采用乙醇提取得到核桃醇提物；

(2)分离：将步骤(1)得到的核桃醇提物进行柱层析，并依次采用不同浓度乙醇依次洗脱，反复净化洗脱，分离得到酚酸葡萄糖苷类化合物；酚酸葡萄糖苷类化合物为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)或2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明一种实施方式中，所述2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷结构式为：

在本发明一种实施方式中，所述6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)结构式为：

在本发明一种实施方式中，所述2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷结构式为：

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中核桃分木和乙醇溶液的料液比为1:10-20(M/V，g/mL)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)提取是：核桃分心木经粉碎后，按料液比1:10-20(M/V，g/mL)加入75％的乙醇，于40-70℃条件下搅拌提取2-5h，过滤取上清液，如此重复3次，将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃醇提物。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)是将步骤(1)得到的核桃醇提物上MCI柱，并依次用去离子水、30％、50％、70％的乙醇洗脱，收集水洗脱和30％乙醇洗脱部分后合并，减压浓缩后上样到MCI柱，依次用去离子水、体积分数为10％、20％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，收集10％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用去离子水、体积分数为5％、10％、20％的乙醇溶液洗脱收集，然后再反复净化洗脱，分离得到酚酸葡萄糖苷类化合物。

本发明的第二个目的是提供一种酚酸葡萄糖苷类化合物在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病药物和保健品中的应用，所述酚酸葡萄糖苷类化合物为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)或2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化应激诱发疾病为慢性阻塞性肺疾病、呼吸道炎症、皮肤病变、糖尿病、神经退行性疾病或肿瘤疾病。

本发明一种实施方式中，所述酚酸葡萄糖苷类化合物为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式为：

在本发明一种实施方式中，所述酚酸葡萄糖苷类化合物为6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)，结构式为：

在本发明一种实施方式中，所述酚酸葡萄糖苷类化合物为2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式为：

在本发明一种实施方式中，所述应用为提高超氧化物歧化酶SOD活力，降低肝脏丙二醛MDA水平的应用。

本发明的第三个目的是提供一种对氧化应激相关疾病具有治疗或保健作用的组合物，所述组合物中的有效成分为酚酸葡萄糖苷类化合物，所述组合物含有2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷中的一种或多种。

在本发明一种实施方式中，所述的组合物还包括载体和/或辅料。

在本发明一种实施方式中，所述的组合物的剂型为医学上认可的任意一种剂型，剂型包括粉剂、片剂、针剂、口服液或注射液。

本发明的第四个目的是提供一种酚酸葡萄糖苷类化合物在制备具有抗氧化功能的食品或化妆品中的应用，所述酚酸葡萄糖苷类化合物为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)或2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明的有益效果：

在核桃分心木提取物的研究过程中，我们首次在核桃分心木中发现了三种酚酸葡萄糖苷，并提供了一种从核桃中制备得到该三种化合物的方法，并通过药理实验证实这三个化合物可提高SOD活力，并降低MDA水平，具有良好的抗氧化活性。

附图说明

图1为化合物1的¹H-NMR谱图。

图2为化合物1的¹³C-NMR谱图。

图3为化合物1的¹³⁵DEPT-NMR谱图。

图4为化合物1结构式。

图5为化合物2的¹H-NMR谱图

图6为化合物2的¹³C-NMR谱图

图7为化合物2的¹³⁵DEPT-NMR谱图

图8为化合物2结构式。

图9为化合物3的¹H-NMR谱图。

图10为化合物3的¹³C-NMR谱图。

图11为化合物3的¹³⁵DEPT-NMR谱图。

图12为化合物3结构式。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

实施例1：

从核桃中获得该三种酚酸葡萄糖苷类化合物的提取方法，具体如下：

核桃分心木经粉碎后，按料液比1:15(M/V)加入75％的乙醇，于50℃条件下搅拌提取3h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃醇提物。将核桃醇提物上MCI柱，并依次用去离子水、30％、50％、70％的乙醇洗脱，收集水洗脱和30％乙醇洗脱部分后合并，减压浓缩后上样到MCI柱，依次用去离子水、体积分数为10％、20％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，收集10％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用去离子水、体积分数为5％、10％、20％的乙醇溶液洗脱收集，然后再反复净化洗脱，分离得到三种新化合物，分别为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物1)，6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)(化合物2)以及2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物3)。经HPLC测定，所得三种化合物的收率分别为92％、90％、93％，纯度为97.8％、98.0％、98.1％。

实施例2：

从核桃中获得该三种化合物的提取方法，具体如下：

核桃分心木经粉碎后，按料液比1:10(M/V)加入75％的乙醇，于40℃条件下搅拌提取5h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃醇提物。将核桃醇提物上MCI柱，并依次用去离子水、30％、50％、70％的乙醇洗脱，收集水洗脱和30％乙醇洗脱部分后合并，减压浓缩后上样到MCI柱，依次用去离子水、体积分数为10％、20％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，收集10％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用去离子水、体积分数为5％、10％、20％的乙醇溶液洗脱收集，然后再反复净化洗脱，分离得到三种新化合物，分别为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物1)，6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)(化合物2)以及2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物3)。经HPLC测定，所得三种化合物的收率分别为90％、86％、90％，纯度为98.0％、98.1％、98.1％。

实施例3：

从核桃中获得该三种化合物的提取方法，具体如下：

核桃分心木经粉碎后，按料液比1:20(M/V)加入75％的乙醇，于70℃条件下搅拌提取2h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃醇提物。将核桃醇提物上MCI柱，并依次用去离子水、30％、50％、70％的乙醇洗脱，收集水洗脱和30％乙醇洗脱部分后合并，减压浓缩后上样到MCI柱，依次用去离子水、体积分数为10％、20％、30％、50％的乙醇进行梯度洗脱，收集10％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用去离子水、体积分数为5％、10％、20％的乙醇溶液洗脱收集，然后再反复净化洗脱，分离得到三种新化合物，分别为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物1)，6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)(化合物2)以及2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物3)。经HPLC测定，所得三种化合物的收率分别为93％、92％、93.5％，纯度为97.2％、97.7％、97.8％。

实施例4：

本发明中提供了三种新化合物的结构解析步骤，具体如下：

化合物1为黄色无定形粉末，易溶于水，乙醇等，不溶于氯仿。

该化合物的¹H-NMR谱图见图1，从图中可知，δ6.46，δ6.64，δ6.68处各有1个质子信号，为同一个苯环上的3个氢，从偶合常数看3个H分布在苯环上邻位和间位。δ5.31处为葡萄糖端基质子信号，且该糖为β构型，δ3.01～δ3.21为糖上的其他质子信号。

化合物1的¹³C-NMR谱图如图2，从图中可知，化合物1中有13个碳，其中6个碳为糖中的碳。δ141.52，δ148.06，δ150.98为苯环上的连氧碳信号，δ102.00，δ108.16，δ115.44为苯环上的-CH-信号。δ55.74为苯环上的甲氧基信号。

结合该化合物的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱和¹³⁵DEPT-NMR谱(图3)数据并参照文献可确定该化合物为2-羟基-5-甲氧基苯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,结构式见图4。

化合物2为白色粉末，易溶于水、乙醇等，不溶于氯仿。

该化合物的¹H-NMR谱图见图5，从图中可知，δ6.84和δ7.01处分别有一个质子信号，是连接羟基的碳的邻位碳上的氢。δ5.45处有两个葡萄糖端基质子信号，且两个葡萄糖均为β构型，葡萄糖6’位上的两个质子，分别在δ3.50和δ3.54，δ3.18～δ3.44为糖上的其他质子信号。

化合物的¹³C-NMR谱图见图6，从图中可知化合物2共有22个碳，其中12个碳为糖中的碳。δ148.81、δ149.00、δ153.35为萘环上的连氧碳信号，δ126.96和δ128.05为两苯环连接处的碳信号，δ109.39～δ115.78为萘环上的-CH-信号。

根据化合物2的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱和¹³⁵DEPT-NMR谱(图7)，并参考文献可确定该化合物为6-羟基萘基-1,2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)，结构式见图8。

化合物3为棕色无定形粉末，易溶于水、乙醇等，不溶于氯仿。

该化合物的¹H-NMR谱图见图9，由图可知，δ6.00、δ6.40、δ6.46、δ6.84、δ6.85为萘环上的芳氢质子信号。δ5.87处有葡萄糖端基质子信号，且该糖为β构型。

化合物的¹³C-NMR谱图见图10，由图可知，化合物3共有16个碳，其中6个为糖中的碳。δ148.92、δ150.83、δ155.03为萘环上的连氧碳，δ108.52～δ129.15为萘环上的其他碳信号。δ62.86～δ105.64为糖基上的碳信号。

根据化合物3的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱和¹³⁵DEPT-NMR谱(图11)，参考文献可确定该化合物为2,6-二羟基萘基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式见图12。

实施例5：三种化合物的抗氧化作用

材料与方法

1材料

1.1动物ICR小鼠，6周龄，20-25g，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2试剂D-半乳糖，美国Sigma公司；丙二醛(MDA)试剂盒，南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，上海艾莱萨生物科技有限公司。

2实验方法

2.1动物分组与给药小鼠适应性饲养一周后，随机分成5组，每组10只。其中给药组分别灌胃化合物1-3，每种各500mg/kg，空白组与衰老模型组分别灌胃等体积生理盐水，连续6周。同时对衰老模型组与给药组分别皮下注射D-半乳糖150mg/kg，建立小鼠亚急性衰老模型，空白对照组注射等体积生理盐水，连续6周。

2.2样本制备与指标测定小鼠末次给药24h后，眼球取血，收集血液；后脱臼处死，摘取肝脏，经清洁后低温研磨，制得10％组织匀浆液，于3500rpm，4℃下离心10min，取上清液，-20℃保存。用比色法测定肝组织MDA含量，用酶联免疫测定血清中SOD活力。

2.3统计学分析结果以x±s表示，采用SPSS 20软件，通过One-way Anova Dunnett检验来分析结果。

3结果

3.1结果以通过对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠给药后，小鼠饮食正常，体重未出现异常变化。测定实验各组小鼠的血清SOD水平、肝脏MDA含量的，结果如表1所示。结果表明，模型组小鼠的血清SOD活性极显著(P<0.01)低于正常组，肝脏MDA含量显著(P<0.05)高于正常组，说明造模成功。与模型组相比，化合物1给药组小鼠的血清SOD活性显著(P<0.05)升高，肝脏MDA含量显著(P<0.05)降低；化合物2给药组小鼠的血清SOD活性极显著(P<0.05)升高，肝脏MDA含量显著(P<0.05)降低；化合物3给药组小鼠的血清SOD活性显著(P<0.05)高于模型组，肝脏MDA含量显著(P<0.05)低于模型组。说明化合物1-3均具有显著的抗氧化活性。

表1化合物1-3对D-半乳糖致衰老模型小鼠血清SOD活性、肝脏MDA含量的影响

注：a代表P<0.05，b代表P<0.01，均与模型组比较。

对比例1：

参照实施例1方法提取酚酸葡萄糖苷类化合物，区别在于，仅改变上MCI柱时乙醇洗脱浓度，将核桃醇提物上MCI柱，并依次用去离子水、20％、50％、70％的乙醇洗脱，其他条件和实验步骤同实施例1。结果发现20％乙醇时化合物1洗脱不完全，得率小于60％，并在50％乙醇下检测到，说明需要30％乙醇洗脱后化合物1才能洗脱完全。

对比例2：

参照实施例1方法提取酚酸葡萄糖苷类化合物，区别在于，仅改变ODS柱中乙醇洗脱条件，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用去离子水、10％、20％的乙醇溶液洗脱收集，其他条件和实验步骤同实施例1。结果发现如果不先用5％乙醇洗脱，10％乙醇会将化合物2和3一并洗脱，说明需要先用5％洗脱，再用10％乙醇洗脱。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。