一种氨解液及氨解方法
阅读说明：本技术 一种氨解液及氨解方法 (Ammonolysis solution and ammonolysis method ) 是由 曹春艳 赵双 靳开宝 纪磊 韩承昊 朱知浩 于 2020-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种氨解液及氨解方法,所述氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液,所述氨解方法包括：(1)向装有固相载体的固相合成柱中加入氨解液；(2)将所述固相合成柱置于装有氨解缓冲液的密封容器内,并保持所述固相合成柱不接触氨解缓冲液；(3)加热所述密封容器,使固相载体处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中,随后冷却；(4)从所述密封容器中取出固相合成柱,用洗脱液处理固相合成柱中的固相载体,并收集流出液。本发明的氨解液配方温和,氨解缓冲液不仅提供氨解氛围,而且辅助氨解反应,氨解工艺不使用有毒气体、安全性高、环境友好、不破坏引物结构,同时后处理步骤简单,避免交叉污染,可以实现大规模工业化应用。(The invention provides an ammonolysis solution and an ammonolysis method, wherein the ammonolysis solution comprises amine, butanol, amino alcohol and an alkaline aqueous solution, and the ammonolysis method comprises the following steps: (1) adding the ammonolysis solution into a solid-phase synthesis column filled with a solid-phase carrier; (2) placing the solid phase synthesis column in a sealed container filled with an ammonolysis buffer solution, and keeping the solid phase synthesis column not in contact with the ammonolysis buffer solution; (3) heating the sealed container to expose the solid support to a vapor atmosphere of an aminolysis buffer, followed by cooling; (4) and taking the solid phase synthesis column out of the sealed container, treating the solid phase carrier in the solid phase synthesis column with eluent, and collecting the effluent. The ammonolysis solution disclosed by the invention is mild in formula, the ammonolysis buffer solution not only provides ammonolysis atmosphere, but also assists in ammonolysis reaction, the ammonolysis process does not use toxic gas, is high in safety and environment-friendly, does not damage a primer structure, and meanwhile, the post-treatment step is simple, so that cross contamination is avoided, and large-scale industrial application can be realized.)
技术领域
本发明属于核酸的合成技术领域，涉及一种氨解液及氨解方法。
背景技术
短链DNA又称为寡核苷酸（Oligo），通常采用固相合成技术进行人工合成。固相合成以控制孔径玻璃球（CPG）为固相载体，以亚磷酰胺为单体，按照3’-5’方向，经过脱保护、缩合、氧化和盖帽四个反应的循环，将目标序列逐渐连接在固相载体上。固相合成方法的优势在于：每一步反应都在固相载体上进行，反应结束后可以将未反应的原料通过抽滤的方式除去，后处理步骤简单。因此，固相合成被广泛应用于Oligo和多肽合成。在现在大部分的Oligo合成工艺中，亚磷酰胺单体的5’-OH被二甲氧基三苯基（DMT）基团保护，可以在2~3%CCl3COOH/CH2Cl2溶液中被切除，称为脱保护反应；脱保护后裸露出的自由羟基与亚磷酰胺发生亲核取代反应，即缩合反应；缩合反应结束后，为避免未反应的羟基进入下一轮缩合，需要将未反应的自由羟基乙酰化，俗称“盖帽”；最后，由于亚磷酰胺非常不稳定，需要用氧化剂如碘液将亚磷酰胺氧化为+5价磷。每连接一个碱基都需要经历四个反应，将目标碱基全部合成后，将Oligo从CPG上剪切下来。同时，由于A、C、G碱基含有活性氨基，会干扰缩合反应，所以一般预先采用乙酰基（Ac）、苯甲酰基（Bz）和二氮甲基甲脒基（dmf）将氨基保护，当反应结束后，再将Ac、Bz和dmf基团切除。在这里，将Oligo从CPG上剪切下来和脱除保护基的反应称为氨解反应。氨解反应的主要包括：（1）将Oligo从固相载体上切割下来；（2）将Oligo的3’-OH暴露；（3）将A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf切除；（4）将磷酸上的氰乙基切除。
氨解反应最初采用氨水进行，其问题主要包括反应时间长，55℃反应需要16小时，65℃反应需要8小时；在反应过程中需要将合成柱浸泡在氨水中，容易造成交叉污染；由于氨水可以溶解Oligo，后处理步骤繁琐；氨水中的杂质会积累，造成Oligo污染。后来研发的甲胺:氨水=1:1（AMA）的氨解反应体系大大降低了反应时间（M.P. Reddy, N.B. Hanna,and F. Farooqui, Nucleos. Nucleot., 1997, 16, 1589-1598.），但是仍然存在交叉污染和后处理步骤繁琐等问题。气相氨解采用氨气为活性介质，以耐高压的氨解锅为反应容器，在高温高压的反应条件下进行氨解反应。气相氨解的优势在于反应快速高效、操作简单，但是存在对设备要求高、需要使用有毒气体、存在安全隐患、污染环境、对引物的结构破坏性较大的缺点。微波氨解是近年来广泛应用的工艺，主要以微波作为加热手段，但是在实际操作过程中，微波加热很容易造成受热不均匀，持续加热会引起液体爆沸，造成损失和引起交叉污染。
CN109956987A公开了一种用于在DNA固相合成后进行氨解的方法，包括以下步骤：1)向包括用于合成DNA片段的固相载体的合成柱内加入氨解组合物；2)将所述合成柱置于装有氨解缓冲液的可密封容器内，并保持所述合成柱位于所述氨解缓冲液的液面上方；以及3)以微波处理所述可密封容器，使得所述固相载体处于所述氨解缓冲液的蒸汽气氛中；4)取出所述合成柱，以洗脱液处理所述固相载体并收集流出液。但是该方法仍然存在微波加热受热不均匀、容易造成损伤或引起交叉污染的问题。
因此，需要研发一种新的氨解方法，反应条件温和，不会破坏引物结构，解决现有技术存在的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种氨解液及氨解方法，所述氨解液配方温和，氨解缓冲液不仅提供氨解氛围，而且辅助氨解反应，氨解工艺不使用有毒气体、安全性高、环境友好、不破坏引物结构，同时后处理步骤简单，避免交叉污染。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一发明，本发明提供了一种氨解液，所述氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液。
本发明中，胺与两种醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，并去除A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf，其中，胺的作用为氨解液的活性成分，丁醇的作用为反应溶剂，氨基醇兼具有两种作用。
本发明同时在氨解液中加入微量碱性水溶液，发挥催化剂的作用，与胺、丁醇和氨基醇相互配合，有助于加快氨解反应速率，既起到氨解催化作用，又不影响寡核苷酸的产率和品质。
优选地，所述胺包括丙胺和/或丁胺。
优选地，所述丙胺包括正丙胺和/或异丙胺。
优选地，所述丁胺包括正丁胺、异丁胺、仲丁胺或叔丁胺中的任意一种或至少两种的组合，优选为正丁胺。
本发明中，采用的丙胺和/或丁胺作为氨解液的活性成分，与丁醇、氨基醇和碱性水溶液相互配合，发挥高效的氨解活性，在特定配比下实现高效的氨解反应。
优选地，所述丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇中的任意一种或至少两种的组合，优选为正丁醇。
优选地，所述氨基醇包括氨基丁醇和/或氨基戊醇。
优选地，所述氨基戊醇包括5-氨基-1-戊醇和/或4-氨基-1-戊醇，优选为5-氨基-1-戊醇。
优选地，所述碱性水溶液包括LiOH水溶液、NaOH水溶液、KOH水溶液、Be(OH)2水溶液、Mg(OH)2水溶液或Ca(OH)2水溶液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述碱性水溶液的浓度为1~10 M，例如可以是1 M、2 M、3 M、4 M、5 M、6M、7 M、8 M、9 M或10 M，优选为5 M。
本发明中，将碱性水溶液的浓度限定在1~10 M的范围内，有助于高效进行氨解反应，碱性水溶液的浓度不能过低或过高，浓度过低不能发挥促进氨解反应的作用，浓度过高会影响寡核苷酸的产率和纯度，洗脱得到的寡核苷酸在质谱检测时容易产生盐峰，干燥后寡核苷酸可能外观发白。
优选地，所述胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液的体积比为(5~10):(1~5):1:(0.01~0.1)，例如可以是5:1:1:0.01、5:2:1:0.05、5:5:1:0.1、6:1:1:0.01、6:2:1:0.05、6:5:1:0.1、7:1:1:0.01、7:2:1:0.05、7:5:1:0.1、8:1:1:0.01、8:2:1:0.05、8:5:1:0.1、9:1:1:0.01、9:2:1:0.05、9:5:1:0.1、10:1:1:0.01、10:2:1:0.05或10:5:1:0.1，优选为(6~8):(2~3):1:(0.04~0.06)。
本发明中，胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液在特定配比下相互配合，胺、丁醇和氨基醇作为氨解液的主要功效成分，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，并去除A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf，微量的碱性水溶液发挥氨解催化作用，不仅提高了寡核苷酸产率，而且避免了寡核苷酸外观发白现象，获得的寡核苷酸纯度高。
优选地，所述正丁胺、正丁醇、5-氨基-1-戊醇和NaOH/KOH水溶液的体积比为(5~10):(1~5):1:(0.01~0.1)，优选为(6~8):(2~3):1:(0.04~0.06)。
本发明中，碱性水溶液在氨解液中的比例同样不能过低或过高，比例过低不能发挥促进氨解反应的作用，比例过高会影响寡核苷酸的产率和纯度。
第二方面，本发明提供了一种氨解缓冲液，所述氨解缓冲液包括氨水和/或有机胺。
本发明中，氨解缓冲液在加热条件下气化为蒸汽，提供适宜的氨解环境，有助于提高氨解效率；当采用氨水作为氨解缓冲液时，气化后的氨气既可以提供适宜的氨解环境，又可以辅助液相氨解进行气相氨解反应，显著提高了氨解效率和寡核苷酸产率，缩短了反应时间。
优选地，所述有机胺包括二乙胺、乙二胺或吡啶中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，当采用有机胺作为氨解缓冲液时，气化后的有机胺既可以提供适宜的氨解环境，又可以辅助液相氨解进行气相氨解反应，显著提高了氨解效率和寡核苷酸产率，缩短了反应时间。
第三方面，本发明提供了一种氨解方法，所述方法包括以下步骤：
（1）向装有固相载体的固相合成柱中加入第一方面所述的氨解液；
（2）将所述固相合成柱置于装有第二方面所述的氨解缓冲液的密封容器内，并保持所述固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（3）加热所述密封容器，使固相载体处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，随后冷却；
（4）从所述密封容器中取出固相合成柱，用洗脱液处理固相合成柱中的固相载体，并收集流出液。
本发明中，采用第一方面所述的氨解液浸没固相载体，在温和的加热条件下即可发生氨解反应，密封容器中的氨解缓冲液发生气化，促进氨解反应发生和持续进行，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，将碱基上的氨基保护基团去除，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。
优选地，步骤（1）所述固相载体包括控制孔径玻璃球。
根据本发明，控制孔径玻璃球（Controlled Pore Glass，CPG）的球体之间存在空隙，氨解液流动于其中进行氨解反应，将寡核苷酸从CPG上切割下来。
优选地，步骤（1）所述固相载体上连接有合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸是人工合成的DNA短链，通常由20~60个碱基组成，可以作为引物、测序接头、探针等，本发明的氨解液可以将人工合成的DNA短链从固相载体上切割下来，将A、C、G碱基上的氨基保护基团Ac、Bz、dmf切除。
优选地，步骤（1）所述氨解液浸没固相载体。
优选地，步骤（2）所述密封容器包括金属密封盒。
本发明中，采用金属密封盒作为氨解盒，提供一个稍高于大气压的氛围，金属是热的良导体，有利于将加热装置提供的加热温度快速传递到氨解盒内部，高效引发氨解缓冲液气化和氨解反应的发生；同时，密封的氨解盒有效避免了氨解液和氨解缓冲液的挥发损失，有助于高效完成氨解反应。
优选地，步骤（3）所述加热的温度一方面使氨解缓冲液达到气化的温度，在密封容器中形成氨解缓冲液的蒸汽气氛，从而使固相合成柱处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，促进氨解液发挥氨解作用，将合成的寡核苷酸从固相载体上剪切下来，所述加热的温度优选为45~100℃，例如可以是45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，进一步优选为90~95℃。
优选地，步骤（3）所述加热的时间与合成规格、氨解液配方、加热温度、密封容器体积和期望氨解反应的完成程度有关，根据具体实施情况调整，所述加热的时间优选为30~60min，例如可以是30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min或60 min。
优选地，步骤（3）所述冷却为冰浴5~15 min，优选为冰浴冷却10 min。
优选地，步骤（4）所述洗脱液包括水和/或Tris-HCl。
优选地，所述Tris-HCl的浓度为10~30 mM，例如可以是10 mM、11 mM、12 mM、13mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM、20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26mM、27 mM、28 mM、29 mM或30 mM，优选为25 mM。
优选地，所述Tris-HCl的pH为7~8，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，优选为7.2。
优选地，在步骤（4）所述用洗脱液处理固相合成柱中的固相载体之前，还包括干燥和洗涤所述固相合成柱的步骤。
优选地，所述干燥为在50~60℃下处理1~5 min，去除固相合成柱表面凝结的氨解缓冲液滴，所述干燥的温度例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃，优选为55℃，所述干燥的时间例如可以是1 min、2 min、3 min、4 min或5min，优选为3 min。
优选地，所述洗涤采用的洗涤液包括100%乙腈和/或80~95%乙腈，用于去除未反应的试剂和反应副产物。
优选地，所述洗涤包括：将干燥后的固相合成柱依次采用100%乙腈和80~95%乙腈洗涤。
优选地，在洗涤所述固相合成柱之后还包括离心的步骤。
作为优选技术方案，本发明提供了一种氨解方法，所述方法包括以下步骤：
（1）向装有连接了合成的寡核苷酸的控制孔径玻璃球的固相合成柱中加入第一方面所述的氨解液，浸没控制孔径玻璃球；
（2）将所述固相合成柱置于装有氨解缓冲液的金属密封容器内，并保持所述固相合成柱不接触氨解缓冲液，所述氨解缓冲液包括氨水和/或有机胺；
（3）将所述金属密封容器在45~100℃下加热30~60 min，使连接了合成的寡核苷酸的控制孔径玻璃球处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，随后冰浴冷却5~15 min；
（4）从所述密封容器中取出固相合成柱，50~60℃下干燥1~5 min，并依次用100%乙腈和80~95%乙腈洗涤，离心后用水和/或10~25 mM pH 7~8的Tris-HCl处理固相合成柱中的固相载体，并收集流出液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明的氨解液配方简洁，丁胺、丁醇和氨基戊醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，并去除A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf，氨解液进一步添加有碱性水溶液，加快了氨解反应速率；
（2）本发明的氨解反应在密封的金属氨解盒中进行，内部的氨解缓冲液在加热的条件下气化，为氨解反应提供适宜的氨解环境，氨水作为氨解缓冲液不仅提供了适宜的氨解环境，而且具有气相氨解的效果，可以辅助液相氨解反应；
（3）本发明的氨解工艺条件温和、成本低廉、环境友好、安全性高，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为23个碱基长度的寡核苷酸的HPLC谱图；
图2为23个碱基长度的寡核苷酸的ESI质谱图；
图3为60个碱基长度的寡核苷酸的HPLC谱图；
图4为60个碱基长度的寡核苷酸的ESI质谱图；
图5为86个碱基长度的寡核苷酸的HPLC谱图；
图6为86个碱基长度的寡核苷酸的ESI质谱图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例对长度分别为23个碱基、60个碱基和86个碱基的引物进行氨解反应，序列分别为：
SEQ ID NO: 1（23 nt），目标分子量为7030.6：
CATTCGTAGCTCGGATCGTGTAC；
SEQ ID NO: 2（60 nt），目标分子量为18270.8：
GCATGGCGACCTTATCAGTCTACGTCCTTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
SEQ ID NO: 3（86 nt），目标分子量为26543.2：
GCCTGCTTGAGCAGGCTGAAGTTGGTGGCACGCGTTTAATTAACCATATCATCTAGTGTTGCATATGAGACAAGGACTTTTCCCAT。
步骤如下：
引物合成
使用50 nmol合成柱，活化剂为含有0.25 M 5-乙硫基四氮唑（ETT）的乙腈溶液，脱保护试剂为含有3%三氯乙酸的二氯甲烷溶液，盖帽试剂为10%乙酸酐/乙腈和N-甲基咪唑/吡啶/乙腈（比例为14:10:76），氧化剂为含有0.05 M碘的四氢呋喃/吡啶/水（比例为70:20:10），合成反应在Dr. Oligo 192合成仪上进行。
液相氨解
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为正丁胺:正丁醇:5-氨基-1-戊醇:NaOH水溶液（5 M）的体积比为6:3:1:0.05；
（2）将20 mL氨水倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，90℃加热60 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入100 μL，随后用100 μL 90%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm下离心1 min；
（8）加入100 μL 25 mM、pH7.2的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析。
长度分别为23个碱基、60个碱基和86个碱基的引物的HPLC谱图和ESI质谱图分别如图1、图2、图3、图4、图5和图6所示，可以看出，液相氨解处理的不同长度的引物的HPLC纯度、质谱均能够达到行业标准，证明本发明的氨解方法对不同长度的寡核苷酸均具有较好的氨解效果。
实施例2
本实施例采用实施例1的氨解方法，对96条长度为40~60碱基的引物进行氨解，分析质谱合格率和产量。
步骤如下：
引物合成
使用5 nmol合成柱，活化剂为含有0.25 M 5-乙硫基四氮唑（ETT）的乙腈溶液，脱保护试剂为含有3%三氯乙酸的二氯甲烷溶液，盖帽试剂为10%乙酸酐/乙腈和N-甲基咪唑/吡啶/乙腈（比例为14:10:76），氧化剂为含有0.05 M碘的四氢呋喃/吡啶/水（比例为70:20:10），合成反应在Dr. Oligo 768合成仪上进行。
液相氨解
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为正丁胺:正丁醇:5-氨基-1-戊醇:NaOH水溶液（5 M）的体积比为7:2:1:0.05；
（2）将20 mL氨水倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，90℃加热60 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 90%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（8）加入200 μL 25 mM、pH7.2的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
气相氨解
（1）将下机后的合成板直接放入气相氨解锅中，90℃、80~100 MPsi条件下反应40 min；
（2）小心将合成板从氨解锅中取出，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（3）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 90%乙腈/水洗涤一次；
（4）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（5）加入200 μL 25 mM、pH7.2的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
液相氨解和气相氨解的引物产量和纯度如表1所示，可以看出，与气相氨解相比，采用本发明的液相氨解方法获得的96条引物的平均产量更高；以75%的质谱纯度为合格标准，液相氨解的质谱合格率也比气相氨解的合格率稍高。说明本发明的液相氨解方法与常规的气相氨解相比，寡核苷酸的引物和纯度均得到提升。
表1 96条引物的平均产量和纯度
表2为液相氨解和气相氨解的NGS纯度与交叉污染对比，可以看出，液相氨解制备的寡核苷酸纯度高、板内和板间交叉污染率低。
表2
实施例3
本实施例采用50 nmol合成柱合成96条长度为40~60碱基的引物，合成步骤参见实施例2，进行氨解后分析质谱合格率和产量，步骤如下：
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为异丁胺:正丁醇:5-氨基-1-戊醇:KOH水溶液（6 M）的体积比为6:2:1:0.04；
（2）将20 mL氨水倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，95℃加热40 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 90%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（8）加入200 μL 25 mM、pH7.2的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
实施例4
本实施例采用50 nmol合成柱合成的96条长度为40~60碱基的引物，合成步骤参见实施例2，进行氨解后分析质谱合格率和产量，步骤如下：
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为正丙胺:异丁醇:4-氨基-1-戊醇:LiOH（4 M）的体积比为6:2:1:0.06；
（2）将20 mL二乙胺倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，85℃加热50 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 90%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（8）加入200 μL 20 mM、pH7.2的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
实施例5
本实施例采用50 nmol合成柱合成的96条长度为40~60碱基的引物，合成步骤参见实施例2，进行氨解后分析质谱合格率和产量，步骤如下：
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为仲丁胺:异丁醇:4-氨基-1-戊醇:Be(OH)2水溶液（2 M）的体积比为8:3:1:0.05；
（2）将20 mL二乙胺倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，100℃加热30 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 80%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（8）加入200 μL纯水洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
实施例6
本实施例采用50 nmol合成柱合成的96条长度为40~60碱基的引物，合成步骤参见实施例2，进行氨解后分析质谱合格率和产量，步骤如下：
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为叔丁胺:仲丁醇:氨基丁醇:Mg(OH)2水溶液（1 M）的体积比为5:1:1:0.1；
（2）将20 mL乙二胺倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，60℃加热35 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 95%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（8）加入200 μL纯水洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
实施例7
本实施例利用不同体积比的氨解液配方进行氨解反应，对比质谱和产量，分析氨解组分对氨解效果的影响。具体实验步骤如下：
（1）向固相合成柱中加入20 μL氨解液，浸没连接有合成的引物的CPG，氨解液的配方为异丙胺:叔丁醇:氨基丁醇:Ca(OH)2（10 M）的体积比为10:5:1:0.01；
（2）将20 mL吡啶倒入规格为170 mm×130 mm×95 mm的金属氨解盒中；
（3）小心将包含多个固相合成柱的合成板放入氨解盒中，静置1 min，将金属盒盖紧，用螺丝固定密封，保证固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（4）小心将金属氨解盒放入烘箱，45℃加热35 min，反应结束后，将金属氨解盒取出，放入冰水浴中冷却10 min；
（5）取出金属氨解盒，松开螺丝，取出合成板，放入烘箱中55℃干燥3 min，取出放凉至室温；
（6）用100%乙腈洗涤两次，每次加入200 μL，随后用200 μL 95%乙腈/水洗涤一次；
（7）取出合成板，3000 rpm离心1 min；
（8）加入200 μL纯水洗脱液洗脱，收集流出液进行质谱分析和酶标仪定量。
对比例1
与实施例2相比，氨解液的配方为二亚乙基三胺:1 M LiOH水溶液:乙醇的体积比为1:3:6，其他条件与实施例2相同。对比质谱及产量，分析氨解组分对氨解效果的影响。具体实验步骤为实施例2所示步骤。
实施例2~7和对比例1的引物产量和纯度如表3所示，说明使用本氨解配方，对低产量引物（采用5 nmol合成）和高产量引物（采用50 nmol合成），其产率和纯度都能有所保证，适用范围广；对比例1使用的氨解液功效成分二亚乙基三胺和乙醇的氨解活性较弱，因此需要添加高配比的碱性水容易以保证氨解反应发生，但是会造成引物品质差的问题，引物发白严重，杂质较多，且后处理步骤繁琐，影响引物的结构和功能。
表3 不同氨解条件下96条引物的平均产量和纯度
综上所述，本发明的氨解液配方简洁、成本低廉、环境友好、安全性高，氨解工艺条件温和，不会造成对寡核苷酸结构的破坏，氨解反应在密封容器中发生，避免了氨解液和/或氨解缓冲液的挥发，有助于氨解反应持续进行，氨解效率高，操作简便，氨解缓冲液不仅提供了适宜的氨解环境，而且具有辅助氨解的效果，进一步提高了氨解效率，在核酸的固相合成领域具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州金唯智生物科技有限公司
<120> 一种氨解液及氨解方法
<130> 20200713
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