一种针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc

文档序号：1094444 发布日期：2020-09-25 浏览：30次 >En<

阅读说明：本技术 一种针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc (Recombinant caninized antibody scFv-Fc for H3N2 canine influenza virus ) 是由刘永杰赵丹韩德敏董雨豪赵艳兵于 2020-02-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc,其包括,提取感染细胞的总RNA、反转录得cDNA；扩增VH、VL和Fc基因；然后进行PCR融合,提取重组质粒T-scFv和/或T-CE-Fc；以所述T-scFv和/或T-CE-Fc扩增出scFv和/或Fc,将所述scFv和/或所述Fc目的片段连接至克隆载体中,挑选阳性菌株；以所述scFv为模板,用CE-scFv-F和/或CE-scFv-R为引物,扩增,将产物与载体进行同源重组连接,完成后转化Rosetta感受态细胞,抗性平板筛选后,挑选阳性菌株命名ET-32a-scFv-Fc。本发明可用于类似生物制剂的制备。本发明针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体,为防控该病毒引起的犬群感染,以及应对其对人类健康和公共卫生构成的潜在威胁奠定物质基础。(The invention discloses a recombinant caninized antibody scFv-Fc aiming at H3N2 canine influenza virus, which comprises the steps of extracting total RNA of infected cells and obtaining cDNA through reverse transcription; amplifying VH, VL and Fc genes; then carrying out PCR fusion, and extracting recombinant plasmid T-scFv and/or T-CE-Fc; amplifying scFv and/or Fc by the T-scFv and/or T-CE-Fc, connecting the scFv and/or the Fc target fragment into a cloning vector, and selecting a positive strain; and (2) amplifying by using the scFv as a template and using the CE-scFv-F and/or CE-scFv-R as a primer, performing homologous recombination and connection on a product and a carrier, transforming Rosetta competent cells after completion, and selecting a positive strain to be named as ET-32a-scFv-Fc after screening a resistant plate. The invention can be used for preparing similar biological agents. The invention aims at the recombinant caninized antibody of H3N2 subtype CIV, and lays a material foundation for preventing and controlling the infection of the canine groups caused by the virus and coping with the potential threats to human health and public health.)

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc。

背景技术

犬流感病毒(CIV)是一种RNA病毒，可引起患犬咳嗽、流涕和发热等呼吸道症状，是一种能在犬中引起流行的高度接触性呼吸道传染病病毒。2004年，马源H3N8亚型流感病毒首次被美国报道在犬群中水平传播，改变了犬对流感病毒具有抵抗力的观点。随后，2007年韩国出现H3N2亚型流感病毒引起的犬呼吸道疾病。2015年，美国芝加哥爆发H3N2亚型CIV，随后传至美国其他洲甚至加拿大。目前，中国主要的犬流感病毒亚型为H3N2。

CIV威胁着犬类的生存和健康，同时带给人类健康潜在的风险。一是，犬流感病毒在适应犬等哺乳动物体内的唾液酸受体后，可能会获得感染人的能力，而犬作为人类的伴侣动物，很有可能作为中间宿主将流感病毒传播给人类；二是，研究表明多种亚型、多种来源的流感病毒能够感染犬，当犬体内存在两种以上的流感病毒亚型时，很有可能在犬体内进行重配，从而重组出新的流感病毒，给流感预防和控制造成巨大的压力。2013～2015年间，研究人员就发现了3种猪流感病毒与CIV基因重配形成的新型流感病毒。有学者甚至认为，犬可能成为下一个引起大流行的新型流感病毒“混合器”。因此控制CIV的传播和流行非常必要，在公共卫生上具有重要意义。

抗体的被动免疫是一种理想的应对病毒急性感染的治疗策略，不仅可及时有效阻断病原入侵，而且可有效捕获病原，快速中和清除病原。目前研究较多的治疗性抗体主要是单克隆抗体(简称单抗)，而大多数单抗是鼠源的，其异源性限制了在犬体内的应用。邱冬等制备了CIV单链抗体(scFv)，证实其具有较好的中和活性。然而，scFv的最大缺陷是与靶抗原属单价结合，不易在体内长时间停留。延长scFv半衰期的有效办法是与IgG分子的Fc区融合。目前为止，还没有针对犬流感病毒制备重组犬源化抗体进行治疗的报道。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。本发明的目的是提供一种针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc，该重组犬源化抗体能够与H3N2亚型CIV发生特异性结合，具有一定的中和活性，为将该抗体应用于犬流感的防治奠定基础。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种制备针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc的方法，其包括，提取感染细胞的总RNA、反转录得cDNA；以所述cDNA为模板，以VH-F和/或VH-R、VL-F和/或VL-R、Fc-F和/或Fc-R中的一种或几种为引物，扩增VH、VL和Fc基因；以所述扩增的VH、VL、Fc基为模板，以CIV-VH-F和/或CIV-VH-R、CIV-VL-F和/或CIV-VL-R、CIV-Fc-F和/或CIV-Fc-R中的一种或几种为引物，再次扩增VH、VL和Fc基因，然后进行PCR融合，胶回收并连接至克隆载体中，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性菌，提取重组质粒T-scFv和/或T-CE-Fc；以所述T-scFv和/或T-CE-Fc扩增出scFv和/或Fc，将所述scFv和/或所述Fc目的片段连接至克隆载体中，完成后转化Rosetta感受态细胞，经筛选，挑选阳性菌株命名为pET-32a-scFv和/或pET-32a-Fc；以所述scFv为模板，用CE-scFv-F和/或CE-scFv-R为引物，扩增，将产物与载体进行同源重组连接，完成后转化Rosetta感受态细胞，抗性平板筛选后，挑选阳性菌株命名ET-32a-scFv-Fc。

作为本发明所述的制备针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc的方法的优选方案，其中：所述将所述scFv和/或所述Fc目的片段与载体进行同源重组连接，其连接顺序包括VL-(Gly4Ser)4-VH、VH-(Gly4Ser)4-VL中的一种或几种。

作为本发明所述的制备针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc的方法的优选方案，其中：所述将所述scFv和/或所述Fc目的片段与载体进行同源重组连接，其连接顺序为VH-(Gly4Ser)4-VL-Fc。

作为本发明所述的制备针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc的方法的优选方案，其中：所述连接至克隆载体中，其为胶回收后连接至载体pClone007、pMD-19T中任一种中。

作为本发明所述的制备针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc的方法的优选方案，其中：所述扩增，其退火温度为55℃～60℃。

作为本发明所述的制备针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc的方法的优选方案，其中：所述PCR扩增最终体系为25μL，其中，模板cDNA2.0μL，Prime STAR HS 12.5μL，上、下游引物各1.0μL(10μM/μL)，ddH₂O8.5μL。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种权利要求1～6任一所述的方法中用于制备针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc的引物，其包括，所述VH-F的序列如SEQID NO.1所示；所述VH-R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述VL-F的序列如SEQ ID NO.3所示；所述VL-R的序列如SEQ ID NO.4所示；所述Fc-F的序列如SEQ ID NO:5所示；所述Fc-R的序列如SEQ ID NO.6所示；所述CIV-VH-F的序列如SEQ ID NO.7所示；所述CIV-VH-R的序列如SEQ ID NO.8所示；所述CIV-VL-F的序列如SEQ ID NO.9所示；所述CIV-VL-R的序列如SEQID NO.10所示；所述CIV-Fc-F的序列如SEQ ID NO.11所示；所述CIV-Fc-R的序列如SEQ IDNO.12所示；所述CE-scFv-F的序列如SEQ ID NO.13所示；所述CE-scFv-R的序列如SEQ IDNO.14所示；所述VH的序列如SEQ ID NO.15所示；所述VL的序列如SEQ ID NO.16所示；所述Fc的序列如SEQ ID NO.17所示；所述scFv-Fc的序列如SEQ ID NO:18所示；所述scFv的序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.29。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于制备针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc的应用，其为在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体制备方法，可用于类似生物制剂的制备。本发明针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体，为防控该病毒引起的犬群感染，以及应对其对人类健康和公共卫生构成的潜在威胁奠定物质基础。在本发明中，运用的生产技术成熟，操作简单，制备周期短。通过该技术生产的重组犬源抗体具有较高的特异性和纯度、稳定的重复性以及低廉的生产成本等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为VH(A)、VL(B)、scFv及scFv-Fc(C)的PCR鉴定，A图M为DNAMarker，1：VH；B图M为DNA Marker；1：VL；C图M为DNA Marker；1：scFv-Fc；2：Fc；3：scFv。

图2为scFv的表达、纯化与Western Blot鉴定，其中A图M：蛋白Marker，1：全菌，2：超声后的上清，3：超声后的沉淀(包涵体)；B图M：蛋白Marker，1～4均为纯化蛋白；C图.1～3分别为原菌、上清、包涵体。

图3为Fc的表达与Western Blot鉴定，A图M：蛋白Marker，1：原菌，2：超声后的上清，3：超声后的沉淀(包涵体)，4：空载菌对照；B图M：蛋白Marker；1：Fc蛋白与HRP标记抗犬二抗作用Western Blot结果。

图4为scFv-Fc的表达、纯化与Western Blot鉴定，A图M：蛋白Marker；1：原菌，2：超声后的沉淀(包涵体)，3：空载菌对照；B图M：蛋白Marker；1、2、3均为纯化洗脱流出液；C图1、2、3分别为原菌、包涵体、已知阳性蛋白与His一抗，HRP标记抗鼠IgG二抗作用的WesternBlot结果；D图1、2、3分别为原菌、包涵体、已知阳性蛋白与HRP标记抗犬二抗作用WesternBlot结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明通过分离CIV感染发病犬的外周淋巴细胞，提起RNA，反转录获得cDNA，PCR获得VH、VL、Fc片段，重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得以柔性肽连接VH和VL的单链抗体(scFv)基因片段，并与pET-32a原核表达载体连接，同时构建重组抗体scFv-Fc的原核表达载体，通过大肠杆菌表达、纯化后检测抗体的特异性、ELISA和血凝抑制(HI)效价，并分析其中和活性。

步骤包括：

1.抽取产生临床症状的H3N2亚型CIV感染犬的外周血，分离出外周淋巴细胞。通过提取RNA，反转录，获得原始基因组。PCR扩增获得抗体重链和轻链可变区基因，以及重链恒定区Fc基因。所述重链可变区和轻链可变区由柔性肽连接成为scFv基因。所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS GGGGS；所述重链恒定区Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。

由Fc特异性引物扩增出的Fc片段并不是只有一种，经过测序筛选到2株符合Fc序列特征的片段，与表达载体连接并且表达，2个Fc蛋白均能表达，但是经抗犬二抗检测之后，只有其中1株能与抗犬二抗结合，因此另外一株就不能再进行后续实验。

scFv、Fc的序列经过了大量的选取，由于部分序列中间存在终止密码子或不符合NCBI中所查到的相关序列特征，又或者是序列符合相关特征，但仅包括有限的结构域等特点，选取了本专利中所示的优选序列SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.29进行后续试验。

2.将原核表达载体pET-32a经EcoRⅠ和HandIII，HandIII和XhoⅠ双酶切，获得线性载体后，分别与上述scFv基因、Fc基因使用同源重组方法进行连接，构建pET-32a-scFv、pET-32a-Fc表达载体；

3.转化Rosetta(DE3)感受态细胞，测序正确的阳性菌，经分析选出相对最优的pET-32a-scFv，提取质粒，特异性扩增出scFv基因，经EcoRⅠ与HindⅢ双酶切pET-32a-Fc质粒后，利用同源重组方法将scFv基因连接至pET-32a-Fc质粒上，构建pET-32a-scFv-Fc表达载体。所述scFv-Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

4.将选定的阳性菌pET-32a-scFv和测序正确的pET-32a-scFv-Fc使用IPTG诱导表达，再经His标记Ni柱纯化得到scFv和scFv-Fc抗体；

5.将scFv和scFv-Fc抗体进行蛋白的复性，并进行特性分析，包括Western Blot检测、血凝抑制效价的测定，以及ELISA效价和细胞微量中和活性的测定。

实施例1：pET-32a-scFv-Fc表达载体的构建

1毒株、质粒及细胞系和试剂

H3N2亚型犬流感病毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)(简称06)，由实验室分离和保存，其GenBank序列号从JN247615到JN247623。毒株及其序列参照网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore。Rosetta(DE3)购自上海唯地生物技术有限公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞、pClone007 Blunt Simple Vector Kit克隆载体试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司(后称擎科)。pET-32a(+)原核表达载体由实验室保存。犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)购自美国ATCC并由实验室保存。

动物外周血淋巴细胞分离液试剂盒、TMB单组分显色液，购自北京索莱宝科学技术有限公司；RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自Omega公司；cDNA反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司、高保真酶Prime STAR HS、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ与Hind Ш，以及DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；His-Tag鼠单克隆抗体购自艾比玛特(Abmart)生物医药(上海)有限公司、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗犬IgG抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；硝酸纤维素膜(NC)，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；His(组氨酸)蛋白纯化镍柱、超灵敏化学发光检测试剂盒，购自上海雅酶生物科技有限公司；DMEM完全培养基、胎牛血清(FBS)，购自Gibco公司；T-25细胞瓶、96孔细胞培养板，均购自Corning公司。

2CIV感染实验动物并获得外周血分离淋巴细胞，提取RNA、反转录获得模板

7周龄比格犬，南京市仪征安立卯生物科技有限公司提供。采用纯化的CIV感染MDCK细胞，将增殖获得的细胞毒感染健康比格犬，待其出现临床症状时，由前臂静脉抽取抗凝血备用。采用外周血淋巴细胞分离试剂盒分离淋巴细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并以其为模板，按厂家说明书进行反转录：4×gDNA wiper Mix 4μL，模板RNA 1μL，Rnase free ddH₂O 11μL，混匀后，42℃2min；结束后在反应液中加入5×HiScript qRTSuper Mix 4μL，缓慢混匀，50℃15min，85℃5s，获得产物cDNA于-80℃保存。

3克隆及鉴定可变区基因

3.1引物的设计与合成及相关基因片段的扩增

根据登录号AF354264.1和XM532962.3分别设计引物。其中用于克隆抗体重链可变区(VH)基因的上下游引物为VH-F和VH-R。用于克隆抗体轻链可变区(VL)基因的上下游引物为VL-F和VL-R。用于克隆抗体重链Fc基因的上下游引物为Fc-F和Fc-R。以反转录合成的cDNA为模板，分别扩增VH、VL和Fc基因。PCR扩增最终体系为25μL：模板cDNA 2.0μL，PrimeSTAR HS12.5μL，上、下游引物各1.0μL(10μM/μL)，ddH₂O 8.5μL。PCR扩增条件：98℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃终延伸10min。1％琼脂糖凝胶对产物进行电泳，回收目的片段。利用Pclone007simple Blunt Vector Kit将回收产物与克隆载体pClone007连接，转化至DH5α感受态细胞。经过含氨苄青霉素的平板筛选后，挑取单菌落，PCR鉴定片段是否***成功。其结果见图1。

设计并合成用于VH(CIV-VH-F、CIV-VH-R)、VL(CIV-VL-F、CIV-VL-R)和Fc(CIV-Fc-F、CIV-Fc-R)片段融合的引物。以VH-(Gly4Ser)4-VL链的连接顺序，在VH下游及VL上游引入Linker片段(斜体部分为Linker序列)。根据pET-32a(+)的序列，***限制性内切酶EcoRⅠ与HindⅢ作为scFv全长基因5′端和3′端的酶切位点(下划线部分为酶切位点及其同源臂)，以HindⅢ和XhoⅠ作为Fc基因上下游的酶切位点。引物序列信息见表1，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以回收的VH、VL和Fc片段为模板，用CIV-VH-F、CIV-VH-R为引物扩增VH，用CIV-VL-F、CIV-VL-R为引物扩增VL，。用1％的琼脂糖凝胶分别对产物进行电泳，取胶回收产物各1μL作为模板，进行融合PCR。最终体系为25μL：Prime STAR HS 12.5μL，CIV-VH-F、CIV-VL-R各1μL(10μM/μL)，胶回收产物各1μL，ddH₂O 6.5μL。PCR扩增条件：98℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃终延伸10min。同时，以CIV-Fc-F和CIV-Fc-R为上下游引物，反应条件同上，扩增。用1％琼脂糖凝胶将PCR产物(融合产物以及扩增的Fc)电泳后，胶回收并连接至克隆载体pClone007中，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性菌，提取重组质粒，将测序正确的阳性质粒命名为T-scFv，T-CE-Fc。其结果见图1。在NCBI上对序列进行BLAST，结果显示，所获得的序列符合犬重、轻链的序列特征，即序列相似性达95％及以上。

4构建pET-32a-scFv、pET-32a-Fc和pET-32a-scFv-Fc重组表达载体

用CIV-VH-F和CIV-VL-R从测序后的T-scFv中扩增出scFv，用CIV-Fc-F和CIV-Fc-R从测序后的T-CE-FC中扩增出Fc。PCR扩增最终体系为25μL：模板cDNA 2.0μL，Prime STARHS 12.5μL，上、下游引物各1.0μL(10μM/μL)，ddH₂O 8.5μL。PCR扩增条件：98℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃终延伸10min将。pET-32a(+)进行EcoRⅠ与HindⅢ，以及HindⅢ和XhoⅠ的双酶切，酶切体系为：Q.Cut Buffer 5μL，载体≤1μg，快切酶各1μL，ddH₂O加至50μL，按最适温度水浴30min。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物和PCR产物并切胶回收，分别将scFv和Fc目的片段与载体pET-32a(+)进行同源重组连接，反应体系为：5×CE Buffer 4μL，载体0.02×载体大小(bp)，片段0.04×片段大小(bp)，Exnase II 2μL，ddH₂O加至20μL。完成后转化Rosetta(DE3)感受态细胞，经含氨苄青霉素的抗性平板筛选后，挑选阳性菌落进行PCR鉴定，提取阳性质粒(按OMEGA质粒提取试剂盒操作流程操作)测序并分析。将阳性菌株命名为pET-32a-scFv和pET-32a-Fc。参照文献[滕志霞.基于序列和PPI网络的蛋白质功能预测方法研究[D].哈尔滨工业大学,2016]，对获得的11个scFv序列进行分析，其中4个序列不含终止子，且它们之间的核苷酸序列相似性为77.86％。4个序列的相关特性见表2。综合结构域、同源性以及SWISS-MODEL软件的比对结果，scFv-8与数据库中已注释的5yd5.1.A(scFv 4B08)的氨基酸序列相似性达到53.01％，且覆盖90％以上，其结果值得信赖，是较为理想的候选抗体序列，其余为失败结果。

获得的11个scFv序列分析表

基于筛选出的目标scFv，重新设计引物，用CE-scFv-F和CE-scFv-R从目标pET-32a-scFv载体中扩增scFv片段，以VH-(Gly4Ser)4-VL-Fc连接顺序，构建pET-32a-scFv-Fc重组表达载体。pET-32a-Fc用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测并回收产物，将目的片段与载体pET-32a-Fc进行同源重组连接，并转化Rosetta(DE3)感受态细胞，经抗性平板筛选后，挑选阳性菌落进行PCR鉴定并测序。将阳性菌株命名为pET-32a-scFv-Fc。其结果见图1。

(二)针对scFv、Fc和scFv-Fc蛋白的表达、鉴定和相关效价测定1诱导表达scFv、Fc和scFv-Fc蛋白

按1:100的比例将阳性菌pET-32a-scFv、pET-32a-Fc和pET-32a-scFv-Fc分别接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃180rpm培养2～3h后(OD₆₀₀约为0.4～0.6)，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至其终浓度为1mM，16℃诱导表达12-16h。同时设立pET-32a(+)空载菌表达作阴性对照组。培养物离心后，用上清Binding Buffer将菌体重悬，进行超声破碎，4℃12000rpm离心20min，分别取菌体总蛋白、上清、包涵体(超声后的沉淀)进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，其结果见图2A、3A、4A。图2中B图第4泳道蛋白纯度经Image-Pro Plus6.0软件分析纯度高达92％。图4中B图第1、2、3泳道蛋白纯度经Image-Pro Plus6.0软件分析纯度分别高达93％、92％和92％。

2scFv、Fc和scFv-Fc蛋白的纯化及Western Blot鉴定

重组菌培养物离心后用上清Binding Buffer重悬后进行超声破碎，用His蛋白纯化镍柱将目的蛋白纯化，收集洗脱流出液并进行PBS透析，取透析后的纯化蛋白进行SDS-PAGE检测，其结果见图2B、4B。对scFv和scFv-Fc蛋白进行His标签Western Blot鉴定：用His-Tag鼠单抗1:5000稀释后为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG 1:5000稀释后为二抗，其结果见图2C、4C。对纯化的Fc蛋白和scFv-Fc蛋白进行犬抗体特异性Western Blot鉴定:则直接以1:5000稀释的HRP标记的山羊抗犬IgG作为一抗孵育洗涤后直接进行曝光检测，其结果见图3B、4D。

①SDS-PAGE：SDS-PAGE(12.5％)快速制胶试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司，按其说明书配制。样品添加SDS蛋白上样缓冲液沸水煮10min。80V电压跑浓缩胶，120V电压跑分离胶。电泳2h。考马斯亮兰37℃摇晃染色1.5h，脱色液脱色。获得scFv的分子量约为50kD，Fc的分子量约为55kD和重组抗体scFv-Fc的分子量约为89kD。

②Western blot鉴定：SDS-PAGE结束后，切下包含蛋白位置上下3条蛋白marker大小的凝胶。根据凝胶的大小剪两张商品化转印用滤纸和一张NC膜(硝酸纤维素膜)。将NC膜浸没于转膜离子缓冲液(Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200mL，去离子水定容1L)中5min左右。按滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序从下到上呈汉堡方式叠加摆放正确，按照0.8mA/cm²通电转印1.5h。NC膜于封闭液(含有5％脱脂奶的TBST缓冲液，TBST缓冲液：NaCl 8.8g，1MTris-HCl(pH 8.0)20mL，Tween-20 0.5mL，去离子水定容1L)，37℃孵育2h。对scFv和scFv-Fc蛋白进行His标签Western Blot鉴定：用His-Tag鼠单抗1:5000稀释后为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG 1:5000稀释后为二抗。对纯化的Fc蛋白和scFv-Fc蛋白进行Western Blot鉴定，则直接以1:5000稀释的HRP标记的山羊抗犬IgG作为一抗孵育洗涤后直接进行曝光检测。洗涤均用TBST，3次，每次5min。曝光均用超灵敏ECL发光液为底物溶液显色5-30min后进行。

3血凝抑制活性检测

取纯化后的scFv以及scFv-Fc蛋白，调整其初始浓度为1mg/mL，与等体积4单位的06犬流感病毒反应半小时后，加入1％的鸡血红细胞检测其血凝抑制效价。scFv蛋白的血凝抑制效价为1:2⁷(0.0078mg/mL)，scFv-Fc蛋白的血凝抑制效价为1:2⁶(0.0156mg/mL)。说明scFv和scFv-Fc均有血凝抑制活性，可以与CIV发生特异性结合反应，且Fc片段对scFv的HI效价没有显著的影响。

具体操作：首先进行血凝试验，以确定H3N2犬流感病毒06株血凝效价。首先在一次性血凝板的第一排的1-12孔加入50μL PBS，其次在第一孔加入50μL病毒尿囊液，混匀后吸50μL到第2孔，依次倍比稀释直到第11孔，混匀后弃去50μL。最后1孔(12)为红细胞对照。接着每孔加入50μL 1％红细胞轻轻摇动混匀。手动震荡，37℃静置30min后观察结果。以50％的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作为该病毒液的红细胞凝集效价，测得06毒株的HA效价为2^-6。

然后进行抗体蛋白的血凝抑制效价测定。即：在血凝版的1-12孔加入50μL PBS。第一孔加入待捡已稀释的抗体50μL，混匀后吸50μL至第2孔，倍比稀释至第10孔，混匀后弃50μL。在1-11孔，每孔加稀释好的50μL 4个血凝单位的病毒悬液，37℃静置30min，让病毒与抗体充分反应。在1-12孔中每孔加入50μL 1％红细胞，震荡混匀后，37℃静置30min后观察结果。能将病毒凝集红细胞的作用100％抑制的抗体的最高稀释倍数即为该抗体的红细胞凝集抑制效价。

4ELISA检测

用10μg/mL的纯化犬流感病毒06株包被酶标板，4℃过夜，用5％脱脂奶37℃封闭2h。先将scFv和scFv-Fc的初始浓度调整为1mg/mL，纯化的scFv进行2倍比稀释后，100μl/孔加入96孔反应板中，设立阴性对照及小鼠阳性血清对照，37℃静止孵育1.5h后洗涤，然后加入His-Tag鼠源单抗，37℃静止孵育1.5h后洗涤，加HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，静止孵育1h后洗涤，其结果见表3。最后加入TMB单组分显色液显色，2M硫酸终止液终止显色，用酶标仪读取每孔的OD₄₅₀值。针对scFv-Fc蛋白，则设立犬阳性血清对照及空白对照，直接用1:5000稀释的HRP标记山羊抗犬IgG作为二抗，其他操作相同。其结果见表4。

5微量中和试验

将scFv和scFv-Fc蛋白的起始浓度调整为1mg/mL，在1.5EP管中预先进行2倍比稀释，按照100μl/孔，每个稀释度做4个重复计算所需用量，并分别加入96孔板中。将06病毒稀释至200TCID₅₀，100μL/孔加入不同稀释度(按照第1孔10倍稀释抗体，以排除复性不完全，所得抗体中还残留尿素的影响，第2孔及以后按照2倍稀释操作，即，稀释度为：1：10，1：20，1：40，1:80…，)的单链抗体，37℃静止孵育1h后，吸出每孔内液体，对应地加至长满MDCK细胞的96孔板中，同时设置阳性对照(已知阳性抗体)、阴性对照(只加病毒)及空白对照(只加培养液)。培养48～72h。只加培养液的空白对照组细胞单层呈菱形，生长良好；1:10稀释的scFv能100％保护MDCK细胞不产生细胞病变，1:20稀释的scFv和scFv-Fc可以保护50％的MDCK细胞不产生细胞病变；只加病毒的阴性对照组胞出现明显的脱落、拉丝、死亡等细胞病变。实验重复3次，确定scFv和scFv-Fc的中和效价为1:20(0.05mg/mL)

表1相关引物序列

表2 scFv各序列的相关特征

IgV_H：免疫球蛋白(Ig)的重链(H)可变域(V)；IgC_CH1_IgAEGM：α，ε，γ和μ重链的第一个免疫球蛋白恒定域；L1：IgV_H上的高变区1；L2：IgV_H上的高变区2；L3：IgV_H上的高变区3。NCBI最高相似性(％)：相应基因序列在NCBI数据库中的最高相似性。

表3 scFv蛋白活性的间接ELISA检测

表4 scFv-Fc蛋白活性的间接ELISA检测

本发明为了解决异源免疫反应的发生，直接从感染病毒的犬体内分离单链抗体基因(scFv)和恒定区基因(Fc)，将二者融合得到的是全犬源化的抗体，在应用的过程中不会有任何排斥反应的发生。通过从经典的单克隆抗体制备途径得到设计灵感，经典的单克隆抗体制备途径是用抗原免疫小鼠，收获小鼠脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞系融合获得杂交瘤细胞。经过目标抗原或者特定表位的蛋白筛选之后得到目标单克隆抗体。将动物免疫抗原后，脾细胞或者血液中会含有大量针对该特定抗原的抗体，此为多抗。我们猜想如果直接从感染流感病毒的犬的血液中扩增抗体的基因片段(包括scFv和Fc两个基因)，构建到表达载体上再经过特定抗原筛选也应该能筛选到想要的抗体。这样操作的优势是免除了制备单克隆抗体的繁琐性和高额的培养细胞的代价。用该方案制备抗体更加经济，快速。但是该方案也存在缺点，本发明研制抗体过程中遇到难题是扩增出的scFv抗体片段经测序后，显示scFv抗体基因有的甚至不符合抗体特征(具体问题包括：1.基因内部含有终止子；2.基因序列不符合scFv特征；3.即使符合scFv抗体基因序列特征，所获得的基因中包含的结构域的多少及同源性也有很大差别)。本实验已使用载体对用的抗性平板进行了筛选，加上转化的过程还存在转化率的原因，并不能获得较大数量的阳性菌株。为了解决该问题，我们在获得scFv基因后，多做几次连接转化，在挑菌过程中尽可能多挑扩大样本量后，成功率大大提高。

本发明较经典方法具有更加简单，快速，经济的优点。另一方面本专利所获得抗体在基因水平上全部是本动物源的，避免了对动物产生异源免疫损伤的风险。为制备H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc，采集CIV感染犬外周血淋巴细胞提取总RNA，利用PCR技术扩增IgG重链(VH)、轻链(VL)和Fc片段。利用重叠延伸PCR将VH和VL通过弹性肽链linker连接成单链抗体(scFv)片段，并转化大肠杆菌，挑取阳性菌测序。经分析筛选后，将目标scFv与Fc片段链接，构建scFv-Fc重组犬源抗体片段。经诱导表达，获得分子量为89kD的重组抗体scFv-Fc。抗体活性测定结果表明，1mg/mL scFv-Fc的血凝抑制(HI)效价为1:2⁶，ELISA效价1:2⁵，中和抗体效价为1:20。本研究成功制备了针对H3N2亚型CIV的重组犬源scFv-Fc，为该病毒感染的治疗提供了物质基础。

本发明提供了一种针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc，该重组犬源化抗体能够与H3N2亚型CIV特异性结合，具有一定的中和活性，为将该抗体应用于犬流感的防治奠定基础。用所述制备的重组抗体可以在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中应用，或者在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中得到应用。

本发明提供了一种针对H3N2亚型CIV的重组犬源化抗体scFv-Fc的制备技术，并成功获得了具有一定中和活性的重组犬源化抗体。与传统鼠单克隆抗体相比，犬源化抗体不会激发机体的异源免疫排斥反应，具有较强的优越性。由于抗体恒定区基因来源于本源动物，因而更能有效地与本动物免疫系统协同发挥作用，表现出高亲和性、无异源性等诸多优点。

1.融合犬IgG分子的Fc片段后，增加了抗体蛋白的大小，延长了其在动物体内的半衰期，增强了抗体的治疗效果；2.融合了犬源化的Fc片段，在不影响抗体治疗效果的前提下，与传统的鼠源单克隆抗体和鼠源单链抗体相比，犬源化抗体不会激发机体的异源免疫排斥反应，具有较强的优越性；3.重组犬源化抗体，由于抗体恒定区基因来源于本源动物，因而更能有效地与本动物免疫系统协同发挥作用，表现出高亲和性、无异源性等诸多优点；4.所获重组犬源化抗体具有中和活性，效价为1∶20，可有效阻止病毒的吸附，从而有效预防流感病毒的感染。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc

<141> 2020-02-18

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gggaaggggc ttcagcgggt 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggagacggtg accagggt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agcagagtgg aggctgacga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gctgaggctg taggtactgt c 21

<210> 5

<211> 31

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

accgtctcct cagcctccac cacggccccc t 31

<210> 6

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tttacccgga gaatg 15

<210> 7

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gctgatatcg gatccgaatt cgggaagggg cttcagcggg t 41

<210> 8

<211> 65

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc agaaccacac ccaccggagg gcactgtcac 60

catgc 65

<210> 9

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc agcagagtgg aggctgacga 50

<210> 10

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ctcgagtgcg gccgcaagct tgctgaggct gtaggtactg tc 42

<210> 11

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tcgagctccg tcgacaagct taccgtctcc tcagcctcca c 41

<210> 12

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gtggtggtgg tggtgctcga gtttacccgg agaatgggag ag 42

<210> 13

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gctgatatcg gatccgaatt cgggaagggg cttcagcggg t 41

<210> 14

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gtggaggctg aggagacggt aagcttgctg aggctgtagg tactgtc 47

<210> 15

<211> 152

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Pro Asp Ser Val Ile Arg Thr Gln Gln Arg Gln Thr Thr Met Glu Ser

1 5 10 15

Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly Val Gln Gly

20 25 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

35 40 45

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

50 55 60

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

65 70 75 80

Ala Ala Ile Ala Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ala Val

85 90 95

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr

100 105 110

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

115 120 125

Ala Ser Pro Thr Thr Val Pro Thr Ile Asp Trp Phe Tyr Tyr Trp Gly

130 135 140

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

145 150

<210> 16

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Met Leu Trp Ile Pro Gly Ser Thr Gly Glu Ala Val Met Thr Gln Thr

1 5 10 15

Pro Leu Ser Leu Ala Val Thr Pro Gly Glu Leu Ala Thr Ile Ser Cys

20 25 30

Arg Ala Asn Gln Ser Leu Leu Arg Ser Asp Gly Lys Ser Tyr Leu Asn

35 40 45

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Thr Pro Arg Pro Leu Ile Tyr Glu

50 55 60

Ala Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Ser Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp

85 90 95

Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu His Phe Pro Pro Thr Phe

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120

<210> 17

<211> 339

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

1 5 10 15

Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu

20 25 30

Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

35 40 45

Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser

50 55 60

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp

65 70 75 80

Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr

85 90 95

Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg

100 105 110

Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala

130 135 140

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp

145 150 155 160

Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr

165 170 175

Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val

180 185 190

Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln

195 200 205

Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg

210 215 220

Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val

225 230 235 240

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr

245 250 255

Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln

260 265 270

Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro

275 280 285

Gln Leu Asp Glu Gly Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val

290 295 300

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met

305 310 315 320

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser His Ser

325 330 335

Pro Gly Lys

<210> 18

<211> 614

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Pro Asp Ser Val Ile Arg Thr Gln Gln Arg Gln Thr Thr Met Glu Ser

1 5 10 15

Val Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly Val Gln Gly

20 25 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

35 40 45

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

50 55 60

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

65 70 75 80

Ala Ala Ile Ala Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ala Val

85 90 95

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr

100 105 110

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

115 120 125

Ala Ser Pro Thr Thr Val Pro Thr Ile Asp Trp Phe Tyr Tyr Trp Gly

130 135 140

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Leu Trp Ile

165 170 175

Pro Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Ile Gln Thr Pro Pro Ser Leu

180 185 190

Ser Val Ser Pro Arg Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

195 200 205

Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln

210 215 220

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg

225 230 235 240

Phe Thr Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

245 250 255

Val Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Thr Gly Val Tyr

260 265 270

Tyr Cys Gly Gln Gly Thr Gln Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

275 280 285

Lys Val Glu Ile Lys Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro

290 295 300

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr

305 310 315 320

Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

325 330 335

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

340 345 350

Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr

355 360 365

Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala

370 375 380

His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu

385 390 395 400

Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro

405 410 415

Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

420 425 430

Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

435 440 445

Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp

450 455 460

Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe

465 470 475 480

Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp

485 490 495

Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu

500 505 510

Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His

515 520 525

Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys

530 535 540

Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp

545 550 555 560

Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys

565 570 575

Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Gly Gly Ser Tyr Phe Leu

580 585 590

Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr

595 600 605

Phe Ile Cys Ala Val Met

610

<210> 19

<211> 840

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

gggaaggggc ttcagcgggt cgcagctatt agctatgatg gaagtagcac atactacact 60

gacgctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaggaacac agtgtatctg 120

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgaa ggatctaatc 180

gatagtagca gctggtactc cgaggattac tatggtatgg actactgggg ccatggcacc 240

tcactcttcg tgtcctcagc ctccaccacg gccccctcgg ttttcccact ggcccccagc 300

tgcgggtcca cttccggctc cacggtggcc ctggcctgcc tggtgtcagg ctacttcccc 360

gagcctgtaa ctgtgtcctg gaattccggc tccttgacca gcggtgtgca caccttcccg 420

tccgtcctgc agtcctcagg gctctactcc ctcagcagca tggtgacagt gccctccggt 480

gggtgtggtt ctggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg tggatccagc 540

agagtggagg ctgacgatac tggactttat tactgcgggc aaggtataca gcttccgttc 600

acttttggcc aagggaccaa actggagatc aaacggaatg atgcccagcc agccgtctat 660

ttgttccaac catctccaga ccagttacac acaggaagtg cctctgttgt gtgtttgctg 720

aatagcttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaag tggatggtgt catccaagac 780

acaggcatcc aggaaagtgt cacagagcag gacaaggaca gtacctacag cctcagcagc 840

<210> 20

<211> 816

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ggagggcact gtcaccatgc tgctgaggga gtagagccct gaggactgca ggacggacgg 60

gaaggtgtgc acaccgctgg tcaaggagcc ggaattccag gacacagtta caggctcggg 120

gaggtagcct gacaccaggc aggccagggc caccgtggag ccggaagtgg acccgcagct 180

gggggccagt gggaaaaccg agggggccgt ggtggaggct gaggagacgg tgaccagggt 240

tccctggccc cagtagtcaa attctccagc tgctagtata cgatccttcg gacagtaata 300

cacggctgtg tcctcggatc tcaggctgtt catctgcaga tacagtgtgt tcctggcatt 360

gtctctggag atggtgaacc ggcccttcac agcatctgcg tagtatgtgc tacttccacc 420

actgttaatg tatgcgaccc gctgaagccc cttcccggtg ggtgtggttc tggtggtggt 480

ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt ggatccagca agtggaggct gacgatattg 540

gagtctatta ctgcgggcaa ggtatacatc ttcctccgac gttcggagca ggaaccaagg 600

tggagctcaa acggaatgat gcccagccag ccgtctattt gttccaacca tctccagacc 660

agttacacac aggaagtgcc tctgttgtgt gtttgctgaa tagcttctac cccaaagaca 720

tcaatgtcaa gtggaaagtg gatggtgtca tccaagacac aggcatccag gaaagtgtca 780

cagagcagga caaggacagt acctacagcc tcagca 816

<210> 21

<211> 828

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggagggcact gtcaccatgc tgctgaggga gtagagccct gaggactgca ggatggacgg 60

gaaggtgtgc acaccgctgg tcaaggagcc ggaattccag gacacagtta caggctcggg 120

gatgtagcct gacaccaggc aggccagggc caccgtggag ccggattggg acccacagct 180

gggggccagt gggaaaaccg agggggccgt ggtggaggct gaggagacgg tgaccagggt 240

tccctggccc cagtagtcaa taagcggatt actagaaagc caaggggaaa aatcctttgc 300

acagtaatac atagccttgt cctcggctct caggctgttc atctgcagat acagcgtgtt 360

cttggcattg tctctggaga cggtgaatcg gcccttcaca gcgtctgcgt agtatgtgct 420

acttccatca ctgctaatcc gtgcgacccg ctgaagcccc ttcccggtgg gtgtggttct 480

ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gatccgctgc tgaggctgta 540

ggtactgtcc ttgtcctgct ctgtgacact ttcctggatg cctgtgtctt ggatgacacc 600

atccactttc cacttgacat tgatgtcttt ggggtagaag ctattcagca aacacacaac 660

agaggcactt cctgtgtgta actggtctgg agatggttgg aacaaataga cggctggctg 720

ggcatcattc cgtcttatct ccatcttggt cccctggctg aaagtataag gaacttgtgt 780

accttgcccg cagtaataaa ctccagtatc gtcagcctcc actctgct 828

<210> 22

<211> 807

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

ggagggcact gtcaccatgc tgctgaggga gtagagccct gaggactgca ggacggacgg 60

gaaggtgtgc acaccgctgg tcaaggagcc ggaattccag gacacagtta caggctcggg 120

gaagtagcct gacaccaggc aggccagggc caccgtggag ccggaagtgg acccgcagct 180

gggggccagt gggaaaaccg agggggccgt ggtggaggct gaggagacgg tgaccagggt 240

tccctggccc cagtagtcaa aagagcttga taggtgcgca cagtaataca cggccgtgtc 300

ctcggctctc aggctgttca tctgaagata cagcgtgttc ttggcgttgt ctctggagat 360

ggtgaatcgg cccttcacag cgtctgcata gcctatggta cttccaccac tattaatgta 420

tgcgacccgc tgaagcccct tcccggtggg tgtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 480

ggcggctccg gtggtggtgg atccgctgct gaggctgtag gtactgtcct tgtcctgctc 540

tgtgacactt tcctggatgc ctgtgtcttg gatgacacca tccactttcc acttgacatt 600

gatgtctttg gggtagaagc tattcagcaa acacacaaca gaggcacttc ctgtgtgtaa 660

ctggtctgga gatggttgga acaaatagac ggctggctgg gcatcattcc gtttgagctc 720

caccttggtt cctgctccga acgtcggagg aagctgtgta ccttgcccgc agtaataaat 780

tccagtatcg tcagcctcca ctctgct 807

<210> 23

<211> 819

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23