阅读说明：本技术 新型冠状病毒n蛋白的配对单克隆抗体及其应用 (Paired monoclonal antibody of novel coronavirus N protein and application thereof ) 是由 陈实平 王保君 蒋毅 冯长访 董红燕 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种新的配对单克隆抗体。通过采用纯化的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组N蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,从众多的单克隆细胞株中筛选出与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组N蛋白反应能力强的配对细胞株,利用该细胞株制备大量腹水。之后对单克隆抗体进行纯化,然后对纯化后的其中一株单克隆抗体进行HRP酶标记,与制备的另一株单克隆抗体建立了新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的检测试剂盒,主要用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的检测。为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原检测试剂盒的研发奠定了坚实的基础。(The present invention relates to a novel paired monoclonal antibody. A monoclonal antibody is prepared by immunizing a mouse with purified recombinant N protein of the novel coronavirus (SARS-CoV-2), a paired cell strain having a strong reactivity with the recombinant N protein of the novel coronavirus (SARS-CoV-2) is selected from a plurality of monoclonal cell strains, and a large amount of ascites is prepared using the paired cell strain. Then, the monoclonal antibodies are purified, one of the purified monoclonal antibodies is labeled with HRP enzyme, and a detection kit of a novel coronavirus (SARS-CoV-2) antigen is established with the other prepared monoclonal antibody, and is mainly used for detecting the novel coronavirus (SARS-CoV-2) antigen. Lays a solid foundation for the research and development of a novel coronavirus (SARS-CoV-2) antigen detection kit.)

新型冠状病毒N蛋白的配对单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学或临床诊断技术领域，具体涉及一种针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白的配对单克隆抗体、其编码序列以及其在诊断中的应用领域。

背景技术

人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。但许多症状是可以处理的，因此需根据患者临床情况进行治疗。此外，对感染者的辅助护理可能非常有效。

目前的实验室检测方法是荧光定量PCR法，是直接检测病毒核酸的方法之一。荧光定量PCR法可通过各种检测标本，如血液淋巴细胞、血清、粪便、呼吸道分泌物或组织，检测出新型冠状病毒(SARS-CoV-2 )的遗传物质。核酸检测试剂盒可用于发现早期感染者，为新型冠状病毒的实验室检测提供有力的工具。但由于PCR技术需要特殊设备，加上试剂操作复杂，检测技术要求高，检测时间长，在一定程度上限制了它在基层的推广和普及。另外，现行PCR检测方法的敏感性也没有得到确认，这就意味着即使是阴性结果也不能完全排除患者体内存有新型冠状病毒(SARS-CoV-2 )。目前急需新型冠状病毒(SARS-CoV-2 )的早期快速诊断方法，用抗体来检测病原体的抗原。

发明内容

发明目的：克服现有技术的缺点，提供两株针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2 )N蛋白的配对单克隆抗体，同时提供编码这两株抗体的序列以及在诊断试剂盒研发中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2 )N蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有SEQ IDNO:5（GYTFTDYW）所示的重链互决定区CDR1、SEQ ID NO:6（IDPYDGEV）所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:7（ATSY）所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:13（QSLLDSDGKTY）所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:14（LVS）所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:15（WQGTHFPQT）所示的轻链互补决定区CDR3；优选地，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:8（QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYWMNWVKQRPEQGLEWIGRIDPYDGEVEF

NQKFKDKAILTVDRSSTTAYMQVSSLTSDDSAVYYCATSYWGQGTLVTVSA）所示的氨基酸序列的重链；和/或，优选地，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:16（DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD

SGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK）所示的氨基酸序列的轻链。

第二方面，本发明提供了一种编码针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白的单克隆抗体的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1（ggctacacgttcaccgattactgg）所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:2（attgatccttacgatggtgaagtt）所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:3（gcaacttcttac）所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:9（cagagcctcttagatagtgatggaaagacatat）所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:10（ctggtgtct）所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ IDNO:11（tggcaaggtacacattttcctcagacg）所示的轻链互补决定区CDR3；优选地，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:4（caggtccaactgcagcagcctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgtaaggcttctggctacacgttcaccgattactggatgaactgggttaagcagaggcctgagcaaggccttgagtggattggaaggattgatccttacgatggtgaagttgaattcaatcaaaagttcaaggacaaggccatattgactgtagacagatcctccaccacagcctacatgcaagtcagcagcctgacatctgatgactctgcggtctattactgtgcaacttcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca）所示的核苷酸序列的重链；和/或，优选地，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:12（gatgttgtgatgacccagactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgc tggcaaggtacacattttcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa）所示的核苷酸序列的轻链。

第三方面，本发明提供了另一种针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2 )N蛋白的配对单克隆抗体，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:21（GYTFTDYW）所示的重链互决定区CDR1、SEQID NO:22（SDPYDGEA）所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:23（GTSY）所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:29(QSLLDSDGKTY)所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:30（LVSK）所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:31(WQGTHFPQT)所示的轻链互补决定区CDR3；优选地，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:24(QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYWMNWFKQRPEQGLEWIGRSDPYDGEAEYNQKFRDKAILTVDKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCGTSYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列的重链；和/或，优选地，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:32（DVVMTQTPLTLSITIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLVYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK）所示的氨基酸序列的轻链。

第四方面，本发明提供了一种编码针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白的配对单克隆抗体的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:17（ggctacacgttcaccgattactgg）所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:18（agtgatccttacgatggtgaagct）所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:19（ggaacttcttat）所示的重链互补决定区CDR3，以及SEQ ID NO:25（cagagcctcttagatagtgatggaaagacatat）所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:26（ctggtgtct）所示的轻链互补决定区CDR2、SEQID NO:27（tggcaaggtacacattttcctcagacg）所示的轻链互补决定区CDR3；优选地，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:20（caggtccaactgcagcagcctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacacgttcaccgattactggatgaactggtttaagcagaggcctgaacaaggccttgagtggattggaaggagtgatccttacgatggtgaagctgagtacaatcaaaaattcagggacaaggccattttgactgtggacaaatcctccaccactgcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaagactctgcggtctattactgtggaacttcttattggggccaggggactctggtcactgtctctgct）所示的核苷酸序列的重链；和/或，优选地，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:28（gatgttgtgatgacccagactccactcactttgtcgattaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctagtctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgc tggcaaggtacacattttcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa）所示的核苷酸序列的轻链。

一种用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的单克隆抗体或上述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体。

有益效果：本发明通过采用纯化的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，从众多的单克隆细胞株中筛选出与新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白反应能力强的配对细胞株，利用该细胞株制备大量腹水。之后对单克隆抗体进行纯化，然后对纯化后的其中一株单克隆抗体进行HRP酶标记，与制备的另一株单克隆抗体建立了新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的检测试剂盒，主要用于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的检测。减少了现有技术中检测不准确缺点，同时不用PCR扩增，缩短检测时间；上述方案提高了检测准确性和效率，为新型冠状病毒临床诊断试剂盒的研发奠定了坚实的基础。

附图说明

图1 为实施例5的检测结果图。

具体实施方式

本发明通过采用纯化的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，从众多的单克隆细胞株中筛选出与新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白反应能力强的配对细胞株，利用该细胞株制备大量腹水。之后对单克隆抗体进行纯化，然后对纯化后的其中一株单克隆抗体进行HRP酶标记，与制备的另一株单克隆抗体建立了新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的检测试剂盒，主要用于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的检测。

下面结合附图1，并通过具体实例进一步描述本发明所涉及的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白单克隆抗体制备技术，但本发明所涉及的范围并不局限于以下实例。

实施例1：

N蛋白单克隆抗体的制备：

（1）将1mg/mL的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白与等体积的弗氏佐剂等体积混合，免疫小鼠，两周一次，共免疫3次，刺激小鼠的B淋巴细胞分泌特异性的抗体；（2）取脾与骨髓瘤细胞进行融合。

实施例2：

筛选针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白的杂交瘤细胞系：

（1）将20μg 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白溶解至20mL的100mM NaHCO₃（PH9.6）中，加入到酶联板中，每孔100μL，4^oC放置包被过夜；（2）用0.05% PBS+Tween-20洗1遍，加入0.1%的酪蛋白溶液，每孔300μL，室温封闭2小时；（3）加入杂交瘤细胞细胞培养液，每孔100μL，室温作用1小时；（4）用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体，室温反应1小时；（5）用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，加入TMB底物液显色15分钟，在酶标仪上450nm波长读取吸光值；（6）当样品孔的吸光值大于对照孔的吸光值3倍以上时判定为阳性克隆孔；（7）将阳性克隆孔的细胞提取RNA并测序；（13）经过测序对比，最终获得两株不同的配对单克隆抗体，编码此两株单克隆抗体的的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.28所示。

实施例3：

单克隆抗体腹水的制备和纯化：

（1）先腹腔注射0.5ml 液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×10⁶个上述两株杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水；（2）收取腹水过滤除脂；（3）加入等体积的0.85%NaCl混匀；（4）搅拌下滴加等体积的饱和硫酸銨（50%），4℃沉淀过夜；（5）10000 rpm 4℃离心 15 分钟，弃上清，沉淀加倍腹水体积的0.85% NaCl溶解；（6）搅拌下滴加饱和硫酸銨使其饱和度达33%（视不同种类腹水而定），4℃沉淀1小时以上；（7）10000 rpm 4℃离心 15 分钟，弃上清，沉淀加原腹水体积的0.85% NaCl溶解；（8）装透析袋，对PBS透析除盐，换透析液3-4次；（9）3000 rpm 离心15 分钟，吸取上清液即为单克隆抗体纯品。

实施例4：

单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：

（1）称取5mg辣根过氧化物酶，加入1mL双蒸水，加入0.5mL新鲜配制浓度为100mg/mL的高碘酸钠溶液；（2）室温放置30分钟；（3）加入25μL乙二醇，室温放置30分钟；（4）加入上述纯化的单克隆抗体一种1mg，并调PH至9.0，4 ^oC放置过夜；（5）加入20μL浓度为5mg/mL的硼氢化钠，混匀后4 ^oC放置2小时；（6）用50mMNa₂CO₃－NaHCO₃透析4小时以上，换液3次以上，每次大于500ml；（7）移入50mMPBSPH缓冲液进行透析；（8）酶联免疫法检测酶标记抗体的活性。

实施例5：

双抗体夹心法（化学发光法）检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白：

（1）取上述纯化的单克隆抗体其中的一种0.1mg，加入50mL 100mM的NaHCO₃（PH9.6）中，加入到酶联板中，每孔100μL，4^oC放置包被过夜；（2）用0.05% PBS+Tween-20洗1遍，加入0.1%的酪蛋白溶液，每孔300μL，室温封闭2小时；（3）去掉酪蛋白溶液，加入50μL不同浓度的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白0pg/mL、10pg/mL、25pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、1000 pg/mL,加入上述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体50μL（浓度为1:1000稀释），室温反应1小时；（7）用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，加入发光底物液，室温反应10分钟，在化学发光读数仪读取发光值；检测结果如图1。

公司名称：北京科卫临床诊断试剂有限公司

新型冠状病毒N蛋白的配对单克隆抗体及其应用

SEQ ID NO:1

ggctacacgttcaccgattactgg

SEQ ID NO:2

attgatccttacgatggtgaagtt

SEQ ID NO:3

gcaacttcttac

SEQ ID NO:4

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gcctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgtaaggcttct gg

ctacacgttcaccgattactgg atgaactgggttaagcagaggcctgagcaaggccttga

gtggattggaagg attgatccttacgatggtgaagtt gaattcaatcaaaagttcaagga

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ggtcactgtctctgca

SEQ ID NO:5

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SEQ ID NO:6

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SEQ ID NO:7

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SEQ ID NO:9

cagagcctcttagatagtgatggaaagacatat

SEQ ID NO:10

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SEQ ID NO:11

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SEQ ID NO:12

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tcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagt cagagcc

tcttagatagtgatggaaagacatat ttgaattggttgttacagaggccaggccagtctc

caaagcgcctaatctat ctggtgtct aaactggactctggagtccctgacaggttcactg

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SEQ ID NO:13

QSLLDSDGKTY

SEQ ID NO:14

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SEQ ID NO:15

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SEQ ID NO:25

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SEQ ID NO:29

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SEQ ID NO:32

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