阅读说明：本技术 一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用 (Bovine and goat milk casein monoclonal antibody, detection kit and application ) 是由 于在江 李月 冯小宇 孙海霞 陈曼利 朱琳 于 2020-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用,所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列,重链可变区具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该单克隆抗体为经杂交瘤技术制备并筛选出的可与牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白结合而不与骆驼奶酪蛋白结合,且与牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白结合的亲和性最高的单克隆抗体,利用该单克隆抗体可同时检测驼奶中掺杂微量的牛奶和羊奶,检测操作简便,且灵敏度高。(The invention provides a bovine and goat milk casein monoclonal antibody, a detection kit and application thereof, wherein the light chain variable region of the bovine and goat milk casein monoclonal antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the heavy chain variable region has an amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The monoclonal antibody is prepared and screened by a hybridoma technology, can be combined with cow milk casein and goat milk casein but not with camel cheese protein, has the highest affinity when being combined with the cow milk casein and the goat milk casein, can be used for simultaneously detecting trace amounts of cow milk and goat milk doped in the camel milk, and has the advantages of simple and convenient detection operation and high sensitivity.)

一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用。

背景技术

骆驼奶的营养价值非常高，骆驼奶不含过敏原，不会引发呕吐腹泻等过敏反应，骆驼奶富含的维c是牛奶的三倍，铁含量是牛奶十倍，每100克驼奶含903毫克钙，含钙量很高。骆驼奶还含有大量人体所需的不饱和脂肪酸、铁和维生素B，有研究表明骆驼乳含有“胰岛素样”小分子物质，对于2型糖尿病有一定的治疗作用。正是因为驼乳有这些优点，所以有一些不法商家在驼乳中添加牛奶或羊奶、甚至用牛奶、羊奶冒充骆驼奶。

目前，检测驼奶中牛、羊奶掺杂的方法主要有非免疫学方法和免疫学方法。非免疫学方法包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳等技术，这些方法通常需要专业人员进行操作，操作复杂，检测时间长。免疫学方法中，有通过牛奶酪蛋白单克隆抗体或羊奶酪蛋白单克隆抗体检测驼奶中牛奶或羊奶的掺杂，但上述现有的技术通常一次只能检测出羊奶的掺杂，或只能检测出牛奶的掺杂，若需要检测驼奶中牛奶、羊奶掺杂则需要使用两种检测试纸产品，操作繁琐。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用，该单克隆抗体可同时识别牛奶和羊奶，利用该单克隆抗体制备的检测试剂盒，在驼奶中掺杂牛奶或羊奶或二者都掺杂时均可显示阳性，可一次性快速检测出驼奶中牛奶、羊奶的掺杂。

为了解决上述问题，本发明的一个方面提供了一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体，所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有如SEQ ID NO：2 所示的氨基酸序列。该单克隆抗体为经杂交瘤技术制备并筛选出的可与牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白结合而不与骆驼奶酪蛋白结合，且与牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白结合的亲和性最高的单克隆抗体，利用该单克隆抗体可同时检测驼奶中掺杂微量的牛奶和羊奶，检测操作简便，且灵敏度高。

所述SEQ ID NO：1的序列结构如下（109个）：

DIELPQSPAILSASLGERVTMTRSPGTRLRASYLHWYQQKPGSSPKLWIHCPTDMPTRLPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCDKDYGTASAFGAGLSSRSNN。

所述SEQ ID NO：2的序列结构如下（120个）：

QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSHNVRNWIRQFPGNKLEWMGHVGYCRGPTYSLSLKSRISITRDTSQNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSTMITTRRVGYWGQGTTVTVSS。

优选地，所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体为IgG抗体。

本发明的另一方面提供一种核苷酸序列，编码上述的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。

优选地，编码所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQID NO：3所示，编码所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

所述SEQ ID NO：3的序列结构如下（327个）：

gacattgagctcccccagtctccagcaatcttgtctgcctctctaggggaacgggtcaccatgacccgctctcccggcacacgtttacgtgccagttacttgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggattcattgcccaaccgacatgcctactcgactcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgcgacaaggattatggtaccgcatccgcgttcggagcgggactaagctcgagatcaaacaat。

所述SEQ ID NO：4的序列结构如下（360个）：

caggtccaactgcaggagtcaggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtcataatgtccggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggccacgtaggctactgtcgtggccctacctacagcctatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatcccagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagatctactatgattaccacaagaagggtcggctactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca。

本发明的再一方面提供一种载体，所述载体包含上述的核苷酸序列。

本发明的再一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的核苷酸序列。

本发明的再一方面提供一种牛、羊奶酪蛋白检测试剂盒，包括上述的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体。

本发明的再一方面提供一种检测驼奶中牛奶或羊奶掺杂的试剂盒，包括：试纸条和微孔板条；

所述试纸条包括背板和所述背板上依次排列设置的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素上设有检测线和质控线，所述检测线上包被有牛奶酪蛋白与羊奶酪蛋白的混合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG，所述检测线靠近所述样品垫的一侧设置，所述质控线靠近所述吸水垫的一侧设置；

所述微孔板条中装填有胶体金标记的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体，所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体为上述的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体。

该检测试剂盒利用了竞争抑制免疫层析的原理。其原理为：样本液中的牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白在流动过程中与胶体金标记的特异性牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体相结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线（T）上牛奶酪蛋白或羊奶酪蛋白的结合。如果样本液中牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白含量大于检测限时，检测线不显色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。

优选地，所述牛奶酪蛋白与羊奶酪蛋白的混合物中牛奶酪蛋白与羊奶酪蛋白的质量比为1:1。

本发明的再一方面提供上述的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体在检测驼奶中牛奶或羊奶掺杂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体为牛奶酪蛋白免疫、羊奶酪蛋白包被，经杂交瘤技术制备并筛选出的可与牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白结合而不与骆驼奶酪蛋白结合，且与牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白结合的亲和性最高的单克隆抗体，利用该单克隆抗体可同时检测驼奶中掺杂的微量的牛奶和羊奶，检测操作简便，且灵敏度高。本发明的检测驼奶中牛奶或羊奶掺杂的试剂盒利用了竞争抑制免疫层析的原理，样本液中的牛奶酪蛋白、羊奶酪蛋白在流动过程中与胶体金标记的特异性牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体相结合，抑制了抗体与硝酸纤维素膜检测线上牛奶酪蛋白或羊奶酪蛋白的结合，从而在样本液中牛奶酪蛋白或羊奶酪蛋白含量大于检测限时，使检测线不显色，检测结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性；该试剂盒可通过一次操作快速检测驼奶中牛奶、羊奶的掺杂，操作简便，检测灵敏度高。

附图说明

图1为NabaiFC-Entry1真核表达载体质粒图：其中Kozak为增强子 ，MusFC为小鼠IgG的Fc片段；PolyA为 mRNA3’端调控序列，AmpR为氨苄抗性基因，CMV为启动子；

图2为NabaiFC-Entry1-VH重组质粒图；

图3为NabaiFC-Entry1-VH重组质粒图；

图4是本发明实施例3中制备得到的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的鉴定图；

图5是本发明实施例4中试纸条的结构示意图；

图6是本发明实施例5中采用试剂盒测定纯驼奶、驼奶含0.2%牛奶、驼奶含0.2%羊奶、驼奶粉、驼奶粉含0.2%牛奶粉、驼奶粉含0.2%羊奶粉样品的测定结果。

其中：1-背板；2-样品垫；3-硝酸纤维素膜；4-吸水垫；5-检测线；6-质控线。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的制备

1. 牛、羊奶酪蛋白抗原制备

低温高速离心（12000rpm,15min,4℃）去除牛奶中的脂肪和杂质沉淀；所获得上清在0.01M PBS（pH=7.2）缓冲液中透析过夜，即为牛奶酪蛋白。采用相同方法提取羊奶酪蛋白。

2. 牛、羊奶酪蛋白抗原免疫小鼠

将纯化的牛奶酪蛋白作为免疫原分别对5-6周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫。首次免疫使用100μL弗氏完全佐剂与100μL含60μg牛、羊奶酪蛋白的磷酸盐缓冲液( 0.01M PBSpH7.4 )乳化，计量为10μg/只，以后每次加强免疫使用弗氏不完全佐剂与牛奶酪蛋白的磷酸盐缓冲液( 0.01M PBS pH7.4 )乳化，剂量同初次免疫一致。初次免疫两周后，每间隔14天加强免疫一次，共免疫3次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用牛奶酪蛋白0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液腹腔注射，剂量同初次免疫。

3. 牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的筛选

尾部取血同时检测血清对羊奶酪蛋白包被板的效价，结果如表1所示，取对羊奶酪蛋白包被板的效价最高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按10:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。

分别采用牛、羊奶酪蛋白包被酶标板进行筛选，有限稀释法筛选杂交瘤细胞，分别得到针对识别牛奶酪蛋白和羊奶酪蛋白的单克隆抗体共３株。如下表2。

取Balb/C小鼠，于一周前采用弗氏不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只。将细胞浓度为1.2万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只。接种杂交瘤细胞7-10天后，收集腹水，反复收集数次，每次收集完成的腹水都采用 5000rpm/min离心收集上清。存于-20℃冰箱保存。

表1

表2

4. 牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的纯化及测定

采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化N抗原单克隆腹水抗体。具体方法：取腹水1 mL并记录腹水名称。加入3 mL乙酸-乙酸钠溶液（0.06M，pH 4.0），混匀5min，加入10μL正辛酸搅拌15min，脱脂棉过滤后，12000rpm离心15min。取上清，计入等体积的饱和硫酸铵（即硫酸铵终浓度为50%），4℃静置3h，12000rpm离心15min。弃上清，加1.8 mL PBS(0.01M，pH7.2)溶解沉淀，加入1/2体积饱和硫酸铵4℃静置3h，12000rpm离心15min。弃上清，加0.45 mL PBS(0.01M，pH7.2)溶解沉淀。在0.01M PBS(pH7.4)中透析，换液三次后收取，测浓度，调整浓度到1.00mg/ mL分装，-20℃保存备用。纯化后单克隆抗体效价如表3（间接法），表4（阻断法）。

表3

表4

注：抗体浓度均为1mg/mL稀释用驼奶稀释10000倍，加样50µL，羊奶、牛奶的添加量为千分之5，加样50µL。

实施例2 牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的测序

根据纯化后单抗测定效价，选择5B10-1G3作为候选株单抗，对5B10-1G3杂交瘤细胞提取mRNA，mRNA的提取采用QIAGEN公司的RNaeasy Mini KiT提取试剂盒进行，按照试剂盒说明书操作，提完的核酸冻存于-80℃备用。逆转录PCR扩增用ThermoFisher公司的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒进行。

具体步骤如下：在0.2 mL微量离心管中，加入总RNA 1 µg，补充适量的DEPC H₂O使总体积达11 µL。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 µL，轻轻混匀、离心；70℃加热10min，立即将微量离心管***冰浴中至少1min；取0.2 mL PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2 µL；上游引物（10 pM） 2 µL；下游引物（10 pM） 2 µL；dNTP(2mM) 4 µL；10x PCR buffer5 µL；Taq 酶（2 u/µL） 1 µL。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；加入SuperscriptⅡ1 µL，在42℃水浴中孵育50 min；于70℃加热15 min以终止反应；将管***冰中，加入RNase H 1微升，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体轻链可变区基因测序引物为：

VLF：5’-GACATTCAGCTGACCCAGTC-3’

VLR：5’-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCC-3’

牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体5B10-1G3的轻链可变区基因序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述SEQ ID NO：3的序列结构如下：

gacattgagctcccccagtctccagcaatcttgtctgcctctctaggggaacgggtcaccatgacccgctctcccggcacacgtttacgtgccagttacttgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggattcattgcccaaccgacatgcctactcgactcccagctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgcgacaaggattatggtaccgcatccgcgttcggagcgggactaagctcgagatcaaacaat。

所述SEQ ID NO：1的序列结构如下：

DIELPQSPAILSASLGERVTMTRSPGTRLRASYLHWYQQKPGSSPKLWIHCPTDMPTRLPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCDKDYGTASAFGAGLSSRSNN。

牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体重链可变区基因测序引物为：

VLF：5’-AGGTGAGCTGCAGCAGTCTGG-3’

VLR：5’-GTGCCGTGGTCCCTTGGCCCCAG -3’

牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体5B10-1G3的重链可变区基因序列如SEQ ID NO：4所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述SEQ ID NO：4的序列结构如下：

caggtccaactgcaggagtcaggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtcataatgtccggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggccacgtaggctactgtcgtggccctacctacagcctatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatcccagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagatctactatgattaccacaagaagggtcggctactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca。

所述SEQ ID NO：2的序列结构如下：

QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSHNVRNWIRQFPGNKLEWMGHVGYCRGPTYSLSLKSRISITRDTSQNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSTMITTRRVGYWGQGTTVTVSS。

实施例3 牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的体外表达

本发明还提供依据上述获得的单克隆抗体的重链、轻链可变区的基因体外表达制备上述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的方法。

构建NabaiFC-Entry1的真核表达载体，将牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体5B10-1G3重链可变区基因设计引物两端分别引入SaLI/HindIII两个酶切位点，克隆到MCS2，形成NabaiFC-Entry1-VH重组质粒；将牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体5B10-1G3轻链可变区基因设计引物两端分别引入SmaLI/HindIII两个酶切位点，克隆到MCS1-MCS2，形成NabaiFC-Entry1-VL重组质粒；将构建的两个NabaiFC-Entry1-VH、NabaiFC-Entry1-VL重组质粒，共转染CHO细胞，并进行诱导表达，即可得到所述牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体。如图1为NabaiFC-Entry1真核表达载体质粒图：其中其中Kozak为增强子，MusFC为小鼠IgG的Fc片段；PolyA为mRNA3’端调控序列，AmpR为氨苄抗性基因，CMV为启动子；图2为NabaiFC-Entry1-VH重组质粒图；图3为NabaiFC-Entry1-VH重组质粒图。

转染细胞、诱导表达的具体操作为：管1加入OPTI-MEM 600µL + 20µg 质粒混匀，管2加入OPTI-MEM 600µL + 60µL PEI(聚乙烯亚胺 MW:40000) 混匀，将管2中混合液加到管1 混匀，静止20分钟（加到平皿前再混匀一下）均匀加到直径150mm的平皿中。将平皿前后左右晃动几下，使加入的质粒均匀分布在皿中，放入37℃ 5%CO₂培养箱培养，6小时后换掉含有转染试剂的培养基，培养24小时，收集上清或细胞。其中，PEI浓度：2µg/µL；OPTI-MEM :GBICO 31985-070；质粒：PEI=1：3。弃掉转染上清，用无菌的 1×PBS将细胞吹起来放到1.5mL EP管(每皿细胞分装到5个EP管)，800g离心5分钟弃上清，每管加入200µL 1×的细胞裂解液(冰上操作)，然后在涡旋震荡器上重悬沉淀，冰上静止20分钟，800g离心5分钟，收集上清（含有蛋白），检测蛋白浓度，分装保存在-80℃。

图4为制备得到的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的鉴定图。

实施例4 检测驼奶中牛奶或羊奶掺杂的试剂盒的制备

该检测驼奶中牛奶或羊奶掺杂的试剂盒，包括：试纸条和微孔板条；

试纸条包括背板1和背板1上依次排列设置的样品垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4；硝酸纤维素膜3上设有检测线5和质控线6，检测线5上包被有牛奶酪蛋白与羊奶酪蛋白的混合物，质控线6上包被有羊抗鼠IgG，检测线5靠近样品垫2的一侧设置，质控线6靠近吸水垫4的一侧设置；

微孔板条中装填有胶体金标记的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体，牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体为上述的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体。

该检测驼奶中牛奶或羊奶掺杂的试剂盒的制备方法包括以下步骤：

（1）取等量制备的牛、羊奶酪蛋白抗原，用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释为2.4mg/mL，用于T线划膜；取羊抗鼠IgG，用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释为0.5mg/mL，用于C线的划膜；制备的胶体金标记的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体5B10-1G3用0.01mol/L pH7.2的PBS，5%BSA，3%Tween-20稀释为60µL /孔冻干备用。

（2）在25mm×300mm硝酸纤维素膜上，用喷膜机横向线状以1.0μL/cm喷涂牛、羊奶酪蛋白抗原，形成检测线。间隔6mm，以1.0μL/cm横向线状喷涂羊抗鼠IgG，形成质控线。

（3）在PVC背板上分别将洁净的无纺布制成的样品垫、包被有检测线和质控线的NC膜、吸水纸，按试纸条组件结构图装配，用切条机裁成宽为4.05mm的条状，得到如图5所示的试纸条成品。

实施例5 驼奶中牛奶或羊奶掺杂的检测

称取1g（精确到0.01g）驼奶粉，倒入离心管中加入8 mL纯净水混匀后作为待测样本备用。待测样本必须为均匀液体，不能有结块、发酵变质的沉淀块，否则会影响检测结果。取装有胶体金标记的牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体的微孔试剂和上述试纸条，并做好标记。用微量移液器吸取200µL待测样本溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，孵育5分钟，***试纸条10分钟后即可判读结果，不超过20分钟。

结果判定

阴性(－)：C线和T线均显色，T线显色远比C线强，表示样本中不含牛、羊乳或远低于检出限。

阳性(＋)：C线显色；T线显色与C线相同、T线显色比C线弱或者T线不显色，均表示样本中牛、羊乳浓度等于或高于检出限。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。

如图6为采用上述试纸条分别测定纯驼奶、驼奶含0.2%牛奶、驼奶含0.2%羊奶、驼奶粉、驼奶粉含0.2%牛奶粉、驼奶粉含0.2%羊奶粉样品的测定结果，可以看出，该试纸条可同时检测驼奶中羊奶与牛奶的掺杂，且产品灵敏度可以达到0.2%。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 北京金智准科技有限公司

<120> 一种牛、羊奶酪蛋白单克隆抗体、检测试剂盒及应用

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Glu Leu Pro Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Arg Ser Pro Gly Thr Arg Leu Arg Ala Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile His Cys Pro Thr Asp Met Pro Thr Arg Leu Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Asp Lys Asp Tyr Gly Thr Ala

85 90 95

Ser Ala Phe Gly Ala Gly Leu Ser Ser Arg Ser Asn Asn

100 105

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser His

20 25 30

Asn Val Arg Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly His Val Gly Tyr Cys Arg Gly Pro Thr Tyr Ser Leu Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Thr Arg Arg Val Gly Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacattgagc tcccccagtc tccagcaatc ttgtctgcct ctctagggga acgggtcacc 60

atgacccgct ctcccggcac acgtttacgt gccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggattcat tgcccaaccg acatgcctac tcgactccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgcgac aaggattatg gtaccgcatc cgcgttcgga 300

gcgggactaa gctcgagatc aaacaat 327

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggtccaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtcataatg tccggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacgtaggct actgtcgtgg ccctacctac 180

agcctatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catcccagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagatctact 300

atgattacca caagaagggt cggctactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360