阅读说明：本技术 抗ccr4抗体及其在治疗癌症中的应用 (anti-CCR 4 antibodies and their use in treating cancer ) 是由 彭菲 顾超 于 2020-06-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种特异性结合CCR4的抗体及其在治疗癌症中的应用。所述抗体能够以较高的亲和力结合CCR4阳性细胞,阻断CCL17、CCL22与肿瘤细胞表面的CCR4结合,促进效应细胞对肿瘤细胞的ADCC作用,为癌症的治疗和/或预防提供新的可能。(The present invention relates to an antibody that specifically binds to CCR4 and its use in the treatment of cancer. The antibody can be combined with CCR4 positive cells with higher affinity, block the combination of CCL17 and CCL22 with CCR4 on the surface of tumor cells, promote the ADCC effect of effector cells on the tumor cells, and provide new possibility for the treatment and/or prevention of cancers.)

抗CCR4抗体及其在治疗癌症中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的涉及抗CCR4抗体及其在治疗多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤中的应用。

背景技术

趋化因子受体是表达在一些特定的细胞表面的七次跨膜受体，其编码蛋白属于G蛋白偶联受体家族，根据其配体的不同可分为四类： CXC型、XC型、CC型、CX₃C型。CC型趋化因子受体4(CCR4)又称为 CD194，主要表达在T细胞(尤其是Th2细胞及Treg细胞)上，在树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、血小板、肥大细胞及某些肿瘤细胞上也发现有表达。CCR4有三个天然特异性配体：胸腺活化调节趋化因子(TRAC/CCL17)、巨噬细胞衍化趋化因子(MDC/CCL22)、趋化素样因子1(CKLF1)。

随着CCR4及其三个配体的发现，越来越多的研究表明CCR4及其配体CCL17、CCL22、CKLF1的结合与T细胞白血病、淋巴瘤细胞肿瘤以及实体瘤的生物学行为、转移密切相关。Lee等检测研究胃癌细胞系，发现它们均表达了CCR4，而在正常胃组织上皮中并未发现CCR4的表达，且CCR4阳性表达与胃癌大体分型、侵袭深度、***转移、病理分期、复发、总体生存期均具有显著相关性。并且还在小鼠乳腺癌模型中证明CCR4过表达可促肿瘤增大，敲除CCR4基因可诱导肿瘤变小。体外的小鼠胃癌腹膜转移模型发现，CCR4表达阳性的胃癌细胞进入腹腔后，可刺激大网膜乳斑的巨噬细胞分泌CCL22，二者结合从而趋化诱导胃癌腹膜转移。也有研究显示，趋化因子受体CCR4与乳腺癌HER2表达、***转移相关。此外，Biragyn等报道靶向干扰CCR4﹢Tregs细胞可降低乳腺癌细胞的转移潜能，甚至阻滞乳腺癌肺转移。通过阻断CCR4与CCL17和CCL22的结合，减少肿瘤附近的Treg细胞，从而维持机体自身抗肿瘤免疫能力，因此CCR4成为抗肿瘤药物的潜在理想靶标。

现有技术中已有一些公开的CCR4抗体，如CN107250160A、 CN104436191A、CN103328513B、US20170290911等，但对新的抗CCR4 抗体仍然存在很大的需求。

发明内容

基于上述发现，本发明的首要目的在于提供一种新的、亲和力较高且能阻断CCR4与配体结合的CCR4抗体。

本发明提供以下技术方案：

一种人源化抗CCR4抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区序列为SEQ ID NO:2。

本发明所述CCR4抗体重轻链可变区各有3个互补决定区(CDR)。所述CCR4抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。

本发明所述CCR4抗体的重链和轻链进一步包含恒定区，所述抗体轻链恒定区包含人源κ、λ链序列,进一步优选为κ链。所述抗体重链恒定区包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或 IgM，进一步优选为IgG1。

在一些实施方案中，所述CCR4抗体能够拮抗CCR4活性，其中拮抗作用阻断CCR4与配体CCL17、CCL22间的结合，阻断CCR4的活性。

在一些实施方案中，可以将本发明CCR4抗体拮抗剂用于治疗癌症，包括但不限于：皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤ALCL)、成人T细胞白血病/ 淋巴瘤(ATLL)、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、***癌、结肠癌、***、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌或胃癌。

本发明提供一种治疗癌症的方法，其特征在于：使用本发明所述的抗CCR4抗体，所述癌症选皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤ALCL)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、***癌、结肠癌、***、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、胃癌或急性淋巴细胞性白血病等。

本发明所述的CCR4抗体可应用于制备治疗和/或预防癌症的药物中，所述癌症选自皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤ALCL)、成人T细胞白血病/ 淋巴瘤(ATLL)、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、***癌、结肠癌、***、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌或胃癌等。

本文所用术语“抗体”包括具有免疫球蛋白样结合功能的任何部分。该术语包括完整的抗体分子和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链，骆驼科抗体包括例如纳米抗体，噬菌体展示结合构建体等等。天然发牛的抗体是糖蛋白，其包含至少两条通过二硫键互联的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区 (在此缩写为VH)和重链恒定区组成.重链恒定区由三个结构域： CH1,CH2和CH3组成.只有两种类型的轻链：λ和κ。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区还可以细分为高变区，称作互补决定区 (CDR)，其与更加保守的区，称为构架区(FR)的区域一起交替散布。如存自然中所发现的，每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排布：FR1,CDR1,FR2，CDR2，FR3， CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗休可以是单克隆或多克隆抗休。

本文所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指抗体分子的制品，其全部共有单一分子组分。因而单克隆抗体显示对特定表位单一的结合特性和亲和性。

本文所用术语“多克降抗体”指具有异质抗体群的抗体组合物。多克降抗体通常源自经免疫动物或源白选定人的收集的血清。

本文所用术语“超变区”或“CDR区”或“互补决定区”，是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。CDR区序列可以由Kabat、 Chothia方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的CDR，包括但不限于Kabat定义、Chothia定义中的任一者来定义。具体地，本发明提供的CDR序列根据Kabat定义。

本文所用术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，可以使用CDR移植及其变体；包括“重塑”、“高度加成”、“贴面”、表面重建等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。

本文所用术语“阻断结合”是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子间结合(例如人CCR4和配体CCL17或CCL22)能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。

本文所用术语“ADCC”是指抗体的Fc区与Fc受体结合的生物活性。抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。

有益效果

本发明的有益效果主要体现在：所述抗体能够以更高的亲和力结合CCR4蛋白，阻断配体CCL17、CCL22与肿瘤细胞表面CCR4的结合，促进效应细胞对肿瘤细胞的ADCC作用，为癌症的治疗和/或预防提供新的可能。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1为针对CCRF-CEM细胞的Hu-11F6-IgG1的ADCC活性。

图2为NSG小鼠CCRF-CEM肿瘤模型。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1.抗CCR4抗体制备及纯化

使用高水平且稳定表达CCR4的CHO细胞(该细胞在其细胞膜上表达CCR4)免疫C57BL/6小鼠。将10⁷个CCR4⁺CHO细胞注入雌性 C57BL/6小鼠腹腔。每两周免疫1次，共免疫5-8次；最后一次免疫 CCR4⁺CHO细胞4天后处死小鼠，取小鼠脾脏，进行细胞融合。按脾细胞：SP2/0细胞＝1:1的比例混合细胞，1500rpm离心7min后弃上清。用20mL电转缓冲液重悬细胞，1500rpm离心7min。弃上清，重复一次。分别用适量电转缓冲液重悬细胞，保证细胞浓度2×10⁷个细胞/mL左右。把细胞悬液加入9mL电转融合槽中融合。融合后将细胞悬液转入到含有20％FBS的15mL RPMI 1640完全培养基中，室温放置20min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20％FBS的RPMI 1640培养基重悬融合细胞。按100μl/孔将细胞悬液加到若干块96孔细胞培养板中，保证每孔细胞量约为4×10⁴个细胞/孔，置于37℃细胞培养箱中培养。5天后补加100μL/孔RPMI 1640完全培养基(含20％FBS， 1×HAT，1×BIOMYC-3)。融合一周后，取细胞上清，收获的上清首先通过直接ELISA结合方法以及配体结合阻断试验获2个筛选实验中均表现为阳性的杂交瘤细胞株。利用有限稀释法将阳性细胞株进行亚克隆，培养一周后利用ELISA检测亚克隆上清与CCR4分子的结合活性以及阻断CCR4与配体的结合活性，最终获得双阳性细胞株，记为 11F6.

实施例2.抗体人源化

将经亚克隆操作的阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，取适量细胞按 RNeasy PlusMini Kit(Qiagen，74134)试剂盒说明书提取总RNA，利用TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix(TRANS，AT311-02)反转录试剂盒合成cDNA第一条链。根据小鼠抗体亚型可变区设计特异性引物(5’端含有用于与真核表达载体发生同源重组的同源臂序列)，以cDNA为模板进行抗体可变区基因的 PCR扩增，从而分别获得小鼠抗体轻链与重链可变区的基因片段。抗体的人源化改造，首先利用目前有效的公共数据库(即NCBI的Blast for IgG以及MRC的V-base),将该抗体的VH结构域和VK结构域的氨基酸序列与所有已知的人种系VH结构域和VK结构域的氨基酸序列进行比对。通过观察构架区内氨基酸的比对结果，确定了高度同源的人种系VH结构域和VK结构域。在此框架结构的基础上，应用计算机模型分析鼠抗CCR4抗体11F6的可变区立体空间结构，分析出支持CDR构型所需保留的鼠抗体对应框架氨基酸残基。用反复的方法转换或突变小鼠构架，使之与相对应的人种系构架相匹配。将合成 VH结构域和VK结构域克隆至特化的哺乳动物表达载体中，该表达载体使相应的结构域能够在完整的人IgG1或κ抗体骨架中表达。将Ⅰ gG1构建体与κ构建体共转染至293F细胞中，进行人源化抗体的小批量制备。将瞬时转染的上清液通过蛋白A或G树脂，获得纯化的 CCR4抗体。最终，将人源化改造后的抗体命名为Hu-11F6-IgG1，且抗体Hu-11F6-IgG1的VH链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，VL链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其中重链高变区VH-CDR1、VH-CDR2、 VH-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5 所示；轻链高变区VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

实施例3.Hu-11F6-IgG1特异性的与肿瘤细胞表面的CCR4结合

选择CCR4阳性细胞系人乳腺癌细胞系MCF-7，对抗CCR4抗体与肿瘤细胞表面表达的CCR4蛋白的结合活性进行了检测，采取了基于细胞的ELISA方法。将MCF-7细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔接种1×10⁵个细胞，37℃培养过夜。将待测CCR4抗体Hu-11F6-IgG1以及对照抗体503(通过CN103328513B专利说明书的第3页23行获得对照抗体序列，并按照其实施例2中的方法获得对照抗体503)用含10％FBS的DMEM培养基进行3倍梯度稀释，浓度从1.83ng/mL到 4μg/m L，然后以每孔50μL的体积分别加入对应的孔中，将细胞培养板于4℃孵育1h。移除一抗，用含1‰Tween 20、pH 7.4的PBS 洗5遍。HRP标记的羊抗人IgG抗体作为二抗进行反应。每孔加入 50μL，于4℃孵育40min。移除二抗，用含1‰Tween 20、pH 7.4的PBS洗5遍。加入显色液，避光孵育15-25min，加入终止液，终止显色反应。使用酶标仪读取492/630nm波长下的吸光值。处理数据，最终确定各样品EC50值，结果见下表。

表一抗CCR4抗体与肿瘤细胞表面的CCR4结合能力测定

名称	EC50(ng/ml)
		Hu-11F6-IgG1	43.2±11.5
对照抗体-503	109.4±23.7

实施例4.抗CCR4抗体阻断活性的检测

采用FACS检测实施例2中制备的抗CCR4抗体阻断CCL17或CCL22 配体结合到细胞表面CCR4受体的能力。将非霍奇金淋巴瘤细胞L-428 重悬后，加入96孔板中，每孔1×10⁵个细胞。将稀释好的抗CCR4 抗体Hu-11F6-IgG1以及对照抗体-503分别加入对应的孔中，每孔100μL，抗体浓度范围为0.128ng/mL到10μg/mL。抗体与细胞4℃结合1h。移除一抗后，用含有0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS洗涤三次,每个样品中加入150ng/mL FITC标记的CCL17或CCL22配体蛋白， 4℃孵育40min，同样用含有0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS洗涤三次。最后进行流式检测。结果如表二所示，表明抗CCR4抗体Hu-11F6-IgG1 阻断配体CCL17或CCL22与CCR4受体结合，因此抗CCR4抗体 Hu-11F6-IgG1具有CCR4阻断活性。

表二

抗体	CCL17 IC<sub>50</sub>(ng/mL)	CCL22 IC<sub>50</sub>(ng/mL)
			Hu-11F6-IgG1	7.8	25.3
对照抗体-503	7.4	36.2

实施例5.ADCC测定

体外ADCC试验是为了明确Hu-11F6-IgG1是否通过Fc与FcγR 相互作用介导的细胞毒作用，利用NK细胞杀伤肿瘤细胞。体外分离人外周血单核细胞作为效应细胞(Ec)，人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM作为靶细胞(Tc)。将靶细胞CCRF-CEM分装至96孔板，每孔2x10⁴个细胞；然后，将每个孔中加入10μL按一定浓度梯度稀释的抗CCR4抗体Hu-11F6-IgG1。在37℃孵育15分钟后，向每个孔中加入4×10⁵个PBMC，以得到20：1的E/T比率。在37℃下孵育4小时后，将96孔板用离心机400g离心5min，分别取各孔的上清液120μl，加入到新的96孔板中，使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(Roche)进行细胞毒性测定。结果如图1所示，抗CCR4抗体 Hu-11F6-IgG1对CCRF-CEM细胞诱导有效的ADCC活性。

实施例6.NSG小鼠CCRF-CEM肿瘤模型

培养足够的处于对数生长期的CCRF-CEM肿瘤细胞，悬浮于1640 培养基中，细胞浓度为5×10⁷个细胞/ml。将每只NSG小鼠通过尾静脉注射200μlCCRF-CEM肿瘤细胞，即每只小鼠注射1×10⁷个肿瘤细胞。随机将NSG小鼠分为3组，每组6只,分为注射IgG的阴性对照组，注射Hu-11F6-IgG1的实验组和注射503的实验组。抗体注射浓度为30mg/kg。小鼠每三天注射一次抗体,共进行10次抗体处理；同时测量肿瘤长、短径，并计算肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为体积＝(长径×短径×短径)/2。结果如图2所示，对小鼠进行抗CCR4抗体处理后，小鼠肿瘤生长速度明显变缓，表明抗CCR4抗体Hu-11F6-IgG1 能够抑制肿瘤生长。

序列表

<110> 北京岳昊科技发展有限公司

<120> 抗CCR4抗体及其在治疗癌症中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asn

20 25 30

Ala Pro Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asp Glu Ser Asn Lys Ile Leu Asn Ser Thr Trp Phe Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

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Arg Arg Ala Ser Leu Pro Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

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Val Ser Ser

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<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Pro Thr Val Leu Lys Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Thr Lys Tyr Cys Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly

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Asn Ser Thr Pro Asp Gly Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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