阅读说明：本技术 一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法与应用 (Preparation method and application of chlamydospore licking block of nematophagous fungus ) 是由 王波波 杨明彩 吴倩倩 蔡葵蒸 王孝伟 周世良 王奕彤 杨明娟 徐斌 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法,其特征在于：所述的制备方法采用的舔块组分,以重量份计,包括：尿素5~10份,糖蜜15~20份,食盐10~25份,钠型膨润土5~10份,羧甲基纤维素0~2份,磷酸二氢钙0~5份,复合维生素1-1.5份,麸皮20~30份,花生油1~2份,<I>D.flagrans</I>厚垣孢子粉1-2份；所述舔块含0.5~2×104/g个D.flagrans厚垣孢子。将舔块用于饲喂牛羊,对胃肠线虫的杀虫率达到83%以上。(The invention provides a preparation method of a chlamydospore licking block of nematophagous fungi, which is characterized by comprising the following steps: the licking block component adopted by the preparation method comprises the following components in parts by weight: 5-10 parts of urea, 15-20 parts of molasses, 10-25 parts of salt, 5-10 parts of sodium bentonite, 0-2 parts of carboxymethyl cellulose, 0-5 parts of monocalcium phosphate, 1-1.5 parts of compound vitamin, 20-30 parts of bran and 1-2 parts of peanut oil, D.flagrans 1-2 parts of chlamydospore powder, wherein the licking block contains 0.5-2 × 104/g of D.flagrans chlamydospores, and the licking block is used for feeding cattle and sheep and has the insecticidal rate of more than 83% on gastrointestinal nematodes.)

一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及家养反刍动物饲用舔块制备技术领域，具体涉及一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法与应用。

背景技术

家养反刍动物的消化道线虫是全世界普遍发生的主要寄生虫病，对畜牧业生产造成严重的经济损失。该病对牛羊的主要危害为慢性营养消耗、生产性能下降、生长停滞，严重者随病情发展最终导致恶病质而死亡。长期以来，这类疫病主要依赖于化学药物进行预防和治疗性驱虫。然而随着驱虫药的广泛使用，目前动物体内寄生虫对常用三大类驱虫药（苯并咪唑类、阿维菌素/伊维菌素、左旋咪唑）的抗药性频繁发生且在一些国家或地区流行严重并呈蔓延之势。为了阻止寄生虫抗药性的继续传播，研究者推荐轮牧、清除牧场粪便、利用天然含有丹宁的植物、应用隐含抗原的疫苗以及利用线虫的天敌进行生物防治；其中利用食线虫真菌捕杀环境中的感染性幼虫（L3）以控制感染源头，这不仅节约人力、物力和应用成本，而且是目前最直接有效且具有应用前景的防治策略之一。

食线虫真菌Arthrobotrys (Duddingtonia) flagrans（同物异名Trichotheciumflagrans）在反刍动物寄生虫的生物控制方面受到人们广泛的研究和重视，绝大多数文献中该菌习惯被称为Duddingtoniaflagrans。D. flagrans在培养期间能够产生大量双层壁的厚垣孢子，能够抵抗动物消化道内的消化酶而不被灭活。因此该菌的孢子可添加于动物的饲料中，经过消化道后随粪便虫卵排出体外，可以大量捕杀粪便中孵化出的寄生线虫幼虫，减少L3的数量，达到生物防控的目的。

然而，由于国内在以前缺乏优良的候选菌种D. flagrans，这严重制约了动物寄生线虫生物防治的研究进展，而引进外来菌种有基因重组和物种入侵的风险。为此，我们自2011年以来，在全国20个省（自治区/直辖市）、48个县87个位点对食线虫真菌进行了较为广泛的分离、鉴定工作，在国内首次分离获得了D. flagrans13株，并对当地分离株的形态学、分子遗传学、捕食机理、体外杀虫试验、体内通过动物消化道试验以及其它生物学特性进行了全面研究，结果表明，我国分离的D. flagrans菌株在形态学、培养特性方面不同于国外菌种，证明是适应我国地理特征的新分离株，具有作为研制生防制剂候选菌种的巨大潜力。

要达到家畜寄生线虫的生物防治目的，不仅要保持D. flagrans孢子具有稳定的活性传递到动物的粪便中能够有效地捕杀L3，而且需要投放至饲料中便于饲用、保存和运输。一种好的剂型是生防制剂商业化的关键，国内已有采用D. flagrans分离株厚垣孢子的真空冷冻干燥剂型，但制备冻干制剂需要大型的设备、耗电量较大，产品的成本高，而且要将微量的冻干制剂有效的饲喂给动物是非常困难的；在这个过程中厚垣孢子存活率大大降低，萌发率非常低，不足以有效捕杀L3。

另外，专利CN201610578955.4公开了一种捕食线虫性真菌粉状制剂及其应用；将捕食线虫性真菌分离株接种在于培养基（优选玉米-小麦联合谷粒培养基）上，温度25-28℃，相对湿度80%以上，进行厚垣孢子批量培养，15-25 d终止培养并收获含孢子的培养物。将收获含孢子的培养物连同谷粒，置容器中摊薄，于35℃风干，时间为3-5 d；或真空干燥，温度35-40℃，真空度为0.082-0.085MPa；或者自然风干，最后收获干燥物备用配置和粉碎。将干燥后培养物与麸皮按照质量比为1:5‒1:10混合，混合物经粉碎机粉碎并搅拌均匀获得捕食线虫性真菌粉状制剂。得到的分装制剂为真菌的培养物。改培养物并不能长期保存贮藏。经过几个月储存的菌粉，杀虫率明显下降，无法有效捕杀L3，也就无法达到生物防控胃肠道寄生线虫之目的。

综上所述，现有技术存在以下缺陷：现有技术的食线虫真菌厚垣孢子制剂较难被动物有效采食；现有技术的食线虫真菌厚垣孢子制剂不耐储存，经普通室内条件存储后，杀虫率明显降低。

发明内容

O.11210，保藏日期为2015年8月31日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其简称为CGMCC；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。SDH035分离株在NCBI（GenBank）获取的序列登录号为KP2575930。

厚垣孢子生产：将保存于2%玉米粉琼脂（CMA）斜面培养基上的SDH 035菌株进行复苏，用接种环挑取部分菌丝或孢子接种于0.4% CMA上，30 °C恒温培养箱中培养5-7 d，从菌落生长边缘处取4块长度为4mm×4 mm的含有菌丝的琼脂方块，接种于50 mL 的马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基中， 180 r/min、30 °C振摇培养6d，将此液体培养的种子按10%的接种量用PD肉汤与上述相同的方法扩大培养1次，吸取菌液按谷粒培养基（玉米+小麦=2:1）的5~10%种子量接种到已灭菌的谷粒培养基中， 25 °C恒温培养箱中避光培养21 d，然后取生长有菌丝体的谷粒，加入适量0.01%吐温-80溶液洗脱厚垣孢子，菌液用4层纱布过滤以除去菌丝，最后用血细胞计数板计数，计算每毫升厚垣孢子数。

一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法，包括以下步骤：

一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法，其特征在于：所述的制备方法采用的舔块组分，以重量份计，包括：尿素5~10份，糖蜜15~20份，食盐10~25份，钠型膨润土5~10份，羧甲基纤维素0~2份，磷酸二氢钙0~5份，复合维生素1-1.5份，麸皮20~30份，花生油1~2份，D. flagrans厚垣孢子粉1-2份；所述舔块含0.5~2×10⁴/g 个D. flagrans厚垣孢子。制备的舔块：孢子萌发率达到27.32-38.65%以上。

所述的制备方法：采用的菌种为鞭式节丛孢Arthrobotrysflagrans分离株SDH035，保藏号为CGMCC NO.11210。

所述的制备方法：包括D. flagrans厚垣孢子粉的制备：将捕食线虫真菌鞭式节丛孢D. flagransSDH035分离株在玉米-小麦联合谷物培养基上进行批量培养，培养温度为25～30℃，相对湿度80～100%，培养时间为15～25 d，然后将含有孢子的谷粒干燥至谷粒中水分含量在15%以下。

制得的孢子粉中孢子含量为1~2×10⁶个/g。

所述的制备方法：包括舔块的制备：先称取30%质量的麸皮粉，然后将孢子粉加入其中，并将两者充分混匀；然后，将含有孢子粉的麸皮粉与剩余麸皮粉以及配方中的其余组分充分混合。

进一步的，所述的舔块组分，以重量份计，包括：尿素25份，糖蜜75份，NaCl 105份，钠型膨润土25份，羧甲基纤维素15份，磷酸二氢钙10份，复合维生素5份，麸皮粉225份，孢子粉5份和食用花生油10份。

一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的应用，其特征在于：将舔块用于饲喂牛羊，对胃肠线虫的杀虫率达到83%以上。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明制备的食线虫真菌厚垣孢子舔块，舔块中孢子的萌发率高，舔块中的孢子萌发率达到27.32-38.65%以上。

（2）本发明用于牛羊胃肠线虫病生物防治的效果显著；本发明制备的食线虫真菌厚垣孢子舔块用于饲喂绵羊，杀虫率达到83%以上。

（3）本发明制备的食线虫真菌厚垣孢子舔块耐储存，并且不依赖保护剂；在不添加保护剂得情况下，在日常室内条件下，本发明舔块存放7个月时仍保持90%以上的杀虫率。

（4）动物寄生线虫对驱虫药的抗药性基因在全世界的养殖业当中广泛地扩散，已对畜牧业生产造成了巨大的威胁。人们推荐利用食线虫真菌进行生物防治等。应用食线虫真菌D.flagrans厚垣孢子舔块可通过饲喂家养动物来减少环境中寄生虫的自由生活阶段如卵、1~3期幼虫。该制剂相对开发疫苗来说，技术难度小、成本低、有效期长，且直接针对源头感染进行控制，因而是最有应用前景的化学替代或补充方法，也是一种符合自然生态平衡的控制方法。制剂方法简单，操作流程少，不需用复杂的设备，降低了成本，更利于大规模生产、保存和运输。另外，舔块在补充动物日常所需营养的同时可以有效防控动物寄生线虫，这种防控策略属于用舔块中含有的食线虫真菌D. flagrans捕杀粪便中的三期幼虫，从而从源头上减少动物的线虫感染。本发明中的产品具有易贮藏、运输、生产工艺简单且易于规模化生产、便于生产实践应用及成本低的特点。

附图说明

附图1 一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的外形图；

附图2 实施例4中厚垣孢子舔块的孢子萌发率的测定结果图；

附图3实施例6中厚垣孢子舔块在6种不同条件下保存1~7个月体外杀虫效果测定结果。

具体实施方式

实施例1 一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法

步骤1、菌株的分离、纯化及鉴定

2013年9月，从来源于宁夏吴忠地区羊粪堆样品和黑龙江省伊春市绵羊粪便样品中，采用改良的平板撒布法分离，分离时在平皿中加入绵羊线虫第三期幼虫作诱饵，25℃温度下孵化，每天或隔天在倒置显微镜下检查一次，持续3周，待有分生孢子长出后，挑取单个的分生孢子置于另一个0.2%麸皮单个的捕食结构或被捕食的线虫，转接入含有0.2%麸皮琼脂培养基中，25℃培养直至获得纯培养物。通过玻片***法获得该菌株分生孢子的形态和数据测量，并提取菌株DNA，用引物ITS1和ITS4进行扩增rDNA中5.8S、ITS-1和ITS-2序列。其结果从5份绵羊粪堆样品中分离纯化获得SDH035菌种一株，形态学和分子学鉴定表明所获分离株与A.flagrans相一致。该菌的形态特征为：在2%玉米粉琼脂中菌落为白色，菌丝较为稀疏，菌丝透明、分隔、分枝，当培养2～3 d可产生分生孢子，至第7 d时就可产生大量的厚垣孢子，而分生孢子相对很少；分生孢子梗透明、直立、分隔，长117.5～387.5（平均为241.59）μm，基部宽5～7.5μm，端部宽2.5～5μm；分生孢子呈卵圆形、长卵圆形和椭圆形，以1个分隔为主，偶有2个分隔或3～4个分隔，0个分隔的也时常可见；分生孢子长20～55.5（平均为35.89）μm、宽10～17（平均为12.87）μm。该菌于28℃培养在玉米与小麦粒联合培养基时，3 d可产生大量的圆形或椭圆形的厚垣孢子（产量可达6×10⁴个/g），厚垣孢子直径14～30 (平均25.0) μm。

步骤2、孢子粉的制备

将捕食线虫真菌鞭式节丛孢D. flagransSDH035分离株在玉米-小麦联合谷物培养基上进行批量培养，培养温度为25～30℃，相对湿度80～100%，15～25 d终止培养，然后将含有孢子的谷粒置于38℃通风干燥48h或置于室温条件下自然干燥直至谷粒中水分含量保持在15%以下。随机称取60g上述干燥后的谷粒培养物，进行检测孢子数量，经检测，孢子含量达到10⁶个/g。

最后，将干燥后的谷粒培养物置于粉碎机中将其粉碎包装，置于塑料袋中于干燥阴凉条件下保存；即得孢子粉，孢子含量为10⁶个/g。

上述孢子数量的检测方法如下：

将检测的谷粒培养物，采用0.02%灭菌吐温-80将谷粒培养物中的厚垣孢子反复洗脱2-3次，经4-6层纱布过滤后，获得厚垣孢子悬液，经血细胞计数板计数，进而算出每克干燥谷粒中孢子的含量。

步骤3、舔块的制备

舔块采用的配方为：尿素25 g，糖蜜75 g，NaCl 125 g，钠型膨润土25 g，羧甲基纤维素5 g，磷酸二氢钙10 g，复合维生素5 g，麸皮粉225 g和孢子粉5 g。

所述复合维生素的组分配比为：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素H，质量比为1: 1: 2: 2: 1:1: 1: 2: 2。

先称取30%质量的麸皮粉，然后将孢子粉加入其中，并将两者充分混匀。然后，将上述含有孢子粉的麸皮粉与剩余麸皮粉以及配方中的其余组分充分混合，使得每克物料最终含有1×10⁴个/g D. flagrans厚垣孢子，

置于制砖机中经18~30 Mpa的压力压制而成，经室温干燥后获得舔块成品。制成的成品难溶于水，厚垣孢子含量为1×10⁴个/g。

实施例2 一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法

与实施例1的制备方法相同，只改变舔块采用的配方为：尿素25 g，糖蜜75 g，NaCl 115g，钠型膨润土25 g，羧甲基纤维素10 g，磷酸二氢钙10 g，复合维生素5 g，麸皮粉225 g，孢子粉5 g和食用花生油5 g。

所述复合维生素的组分配比为：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素H，质量比为1: 1: 2: 2: 1:1: 1: 2: 2。

制成的成品难溶于水，厚垣孢子含量为1×10⁴个/g。

实施例3 一种食线虫真菌厚垣孢子舔块的制备方法

与实施例1的制备方法相同，只改变舔块采用的配方为：尿素25 g，糖蜜75 g，NaCl 105g，钠型膨润土25 g，羧甲基纤维素15 g，磷酸二氢钙10 g，复合维生素5 g，麸皮粉225 g，孢子粉5 g和食用花生油10 g。

所述复合维生素的组分配比为：维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素H，质量比为12: 7: 9: 10: 6:6: 6: 6: 10。

制成的成品难溶于水，厚垣孢子含量为1×10⁴个/g（舔块的外形图如图1所示）。

实施例4 厚垣孢子舔块的孢子萌发率测定实验

将上述实施例1-3所制舔块块分别捣碎后，经80目过筛，用灭菌蒸馏水将其稀释到约600个/mL厚垣孢子，吸取0.5 mL涂布于9个水琼脂平板，28℃培养24 h时终止培养。将整个平皿中的琼脂块切成条状，取出后用棉蓝染液染色，光镜下观察并计数整个平皿的厚垣孢子萌发数和不萌发数，从而得到总数。其中，孢子萌发的判定标准为由萌发管长出的菌丝长度大于孢子的半径时可作为孢子萌发。

与此同时，取等量的干燥孢子粉进行孢子萌发率的测定，从而作为对照组，方法同上，孢子萌发率测定公式如下：

此外，根据如下公式来预测样本容量：

其中p为某一事件预计的频率，，L为允许误差

当厚垣孢子的萌发率为8%–30%，样本容量n为736–2100时，才有95%的可靠性达到允许误差为2%的精确度。为了减少误差，因此每个试验所计厚垣孢子总数大于2000个。最后，将统计的数据用GraphPad Prism 6.0作图。

舔块中厚垣孢子萌发率的测定结果如图2所示。

由图2可知，不同配方对舔块中厚垣孢子萌发率的影响不一致，其结果表明对照组中孢子萌发率为35.04%，而实施例1、实施例2及实施例3中孢子萌发率分别为27.32%、32.74%和38.65%。因此，实施例3为优选实施例，更适合于舔块中孢子的萌发。

实施例5 厚垣孢子舔块对绵羊粪便中感染性幼虫的杀虫效果测定实验

8只小尾寒羊（3–4月龄），采用丙硫咪唑（15 mg/kg 体重）和左旋咪唑（7.5 mg/kg 体重）进行联合驱虫，以驱除试验动物体内已感染的混合性寄生蠕虫（包括绦虫）。驱虫7 d后，用饱和盐水漂浮法检查试验动物粪便中虫卵并证明无其它杂的线虫感染后，在倒置显微镜下检查保存的H. contortusL3活力，检查合格后将L3用蒸馏水稀释，取整数体积（50 μL）置于载玻片上于显微镜下计数，连续取3次，取平均数。

根据计数结果推算原幼虫液每毫升所含的L3数量用以接种绵羊。人工接种L3 21d后，用改良的麦克马斯特法检查粪便中的EPG，若EPG达500以上均可作为试验使用。经绵羊粪便虫卵计数，每克粪便具有相似的虫卵数（1870±912）个。

上述8只感染有相似虫卵的绵羊，在正式试验前，先投放不含真菌孢子的的舔块8块（500g/块）。舔块的配方与实施例3相同，只是不添加孢子粉。

让试验绵羊试吃5 d，5 d后收集未吃完的舔块并对其称重，计算出平均每天每只试验绵羊对舔块的消耗量，其结果表明8只试验绵羊5 d内消耗舔块的量为2240 g，每只试验绵羊平均每天消耗舔块56 g。饲喂试验表明，试验动物对该舔块表现出良好的采食性。

饲喂结束后，将8只试验绵羊随机分为2组（即试验组和对照组，每组各4只绵羊），分开饲养；

对试验组4只绵羊投放实施例3制作的含有D. flagrans的舔块，连续投放7 d，投放后第2 d开始收集试验绵羊粪便，每天收集一次，将每只羊的粪便分为3份，每份称取10 g，置于4.5 cm的培养皿中用镊子搅碎并用牙签轻轻搅拌均匀，加入适量蒸馏水和高压灭菌后的锯末以调节湿度与通气，然后置于已加入10 mL蒸馏水的直径为7.5 cm的大平皿中，其中试验组平皿设置12个平行。

另外，对照组绵羊投放不含真菌的相同数量的舔块，让其自由采食，于投放第2 d开始采用与试验组相同的方法进行粪便培养、分离幼虫和计数，同样也设12个平行。按Cai等（2017）所描述的方法进行幼虫计数，分别计算各组中所获L3的平均数，杀虫率计算公式如下：

采用SPSS（Version 23.0）软件计算照组和试验组中L3的平均数，通过方差分析在5%的概率水平判断差异的显著性。

上述舔块在实验室进行体内效力试验结果见表1；

由表1可见，在试验期间1~7 d，试验组粪便中L3平均数显著低于对照组（p＜0.05）。在停止饲喂舔块后1~3 d两组粪便中L3平均数仍然存在显著差异。在停止饲喂舔块第4d，杀虫率下降至57.85%，差异显著（p＜0.05）。上述结果表明，本发明食线虫真菌厚垣孢子舔块饲喂给试验动物后，对粪便中L3的杀虫率显著，本发明食线虫真菌厚垣孢子舔块用于牛羊胃肠线虫病生物防治的效果显著。

实施例6 舔块的耐储性测定实验

不同保存条件下舔块的耐储性测定实验：

（一）选择下列六种不同贮存条件：采用实施例3的方法制备舔块，将舔块样品分别置于室内、户外、-20 ℃、4 ℃、户外遮阳和模拟仓库的条件下贮存1~7个月。对照组：舔块的配方与实施例3相同，只是不添加孢子粉。

（二）不同保存条件下杀虫效果的检测：

舔块样品分别置于室内、户外、-20 ℃、4 ℃、户外遮阳和模拟仓库的条件下，每隔一个月取样一次，检测杀虫率。按照实施例5中所用的方法进行粪便培养，贝尔曼法分离三期幼虫，幼虫计数，计算杀虫率。

（三）数据处理：实验数据均采用SPSS software（22.0）进行方差分析，其中两两比较选择 Duncan (D)法。

（四）保存期测定结果

试验舔块在上述6种不同条件下保存1~7个月体外杀虫效果测定结果见附图3所示，由附图3可知，所有的试验组（含有真菌的舔块）粪便中L3 的数量显著地低于对照组（p＜0.05）。舔块在室内条件下保存1~7个月，对粪便中L3的体外杀虫率为98.51%~99.75%；舔块在户外条件下保存1~7个月，对粪便中L3的体外杀虫率为37.43%~99.79%；舔块在户外遮阳条件下保存1~7个月，对粪便中L3的体外杀虫率为89.48%~99.27%；舔块在模拟仓库条件下保存1~7个月，对粪便中L3的体外杀虫率为86.43%~99.45%；舔块在4 ℃条件下保存1~7个月，对粪便中L3的体外杀虫率为96.06%~99.87%；舔块在-20 ℃条件下保存1~7个月，对粪便中L3的体外杀虫率为94.53%~99.47%。

综上，舔块制剂在室内、仓库、4 ℃、-20 ℃条件下保存，存放7个月时仍保持90%以上的杀虫率，这正好可以满足一般日常使用时的保存条件，既不需要大型的仪器设备，节省了电力，降低了成本，亦便于今后推广时保存和运输。

除特殊说明外，本发明所述的比例均为重量比，所述的百分含量均为质量百分含量。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。