阅读说明：本技术 一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法 (Purification method of glucagon-like peptide-1 analogue ) 是由 翟鹏 张媛媛 赵新宇 曾伶俐 金耀光 陈旭 吴博 于 2020-08-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法,所述方法包括使用聚合物反相填料纯化GLP-1类似物。所述方法具有单位体积填料载量高的特点,能够减少样品损失,提高纯化产率,降低生产成本。(The invention discloses a purification method of glucagon-like peptide-1 analog, which comprises purifying GLP-1 analog by using polymer reversed phase packing. The method has the characteristic of high filler loading capacity per unit volume, can reduce sample loss, improves the purification yield and reduces the production cost.)

一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种肽纯化方法，特别是一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。近年来中国糖尿病患病率增长迅速，已经成为世界上糖尿病患者人数最多的国家，患病人数超过一亿。

胰高血糖素样肽1（GLP-1）通过葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。

胰高血糖素样肽1（GLP-1）在人体内具有生物活性的主要形式是GLP-1 (7-37)，但其易被二肽基肽酶IV（DPP-IV）水解，半衰期不到5分钟。因此成药的GLP-1受体激动剂必须延长半衰期。目前市场上代表性较为成熟的GLP1类药物为诺和诺德公司研制的利拉鲁肽（Liraglutide）和司美鲁肽（Semaglutide），其分子结构为GLP-1类似物分子上增加脂肪酸侧链后形成的衍生物。通过遮蔽（或突变）DPP-IV酶切位点和白蛋白结合增长体内存留时间的作用，分别实现了一天一次给药方式。

目前，诺和诺德采用酵母重组表达方式生产，国内仿制品多采用化学合成或大肠杆菌重组表达实现。化学合成法多采用小粒径（10μm以下）C8或C18硅胶反相色谱纯化；重组表达生产的GLP-1类似物，多采用阴离子（如CN110498849A，CN04592381A）阳离子（如CN110128552A，CN110724187A）交换层析进行捕获纯化。

小粒径硅胶C8/C18反相色谱，对样品要求较高，不适用于含有较多杂质的重组蛋白样品的捕获纯化；同时，该类填料多以乙腈等有害有机溶剂作为洗脱相，环保压力大。此外，由于此类色谱填料对碱耐受能力极差，不利于填料的在位清洗和重复使用。重组表达生产的GLP-1类似物，如采用阴离子交换层析进行捕获纯化，受宿主细胞DNA，内毒素等杂质影响较大；而阳离子交换捕获纯化的方法，需要将待捕获的样品的pH值调至蛋白等电点以下，在对于GLP-1类样品，由于宿主蛋白和核酸的存在，在跨越等电点的过程中经常发生GLP-1类样品的共沉淀，且难于复溶，造成样品大量损失。

发明内容

为了减少样品损失，提高纯化产率，本发明提供了一种纯化GLP-1类似物的方法，其使用聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物作为反相填料，可实现接近或超过90%的产率，同时可使GLP-1类似物的载量达30g / L升色谱填料以上。

具体来说，本发明提出了如下技术方案：

一种式(I)所示的GLP-1类似物的纯化方法，所述方法包括使用聚合物反相填料纯化GLP-1类似物；优选地，所述聚合物反相填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，

X₇X₈X₉X₁₀TFTSDVSSYLEX₂₂QAAX₂₆X₂₇FIAWLVX₃₄GX₃₆G (I)

其中：

X₇为H或缺失；

X₈为A、Aib、G、S、V或缺失；

X₉为E或缺失；

X₁₀为G或缺失；

X₂₂为G或E；

X₂₆为R、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

X₂₇为E、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

X₃₄为R、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

X₃₆为R、G、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

优选地，缺失X₇、X₈、X₉或X₁₀中的一个或多个；更优选地，缺失X₇X₈；

优选地，反相填料选自NM100、DIAION HP20SS和/或Super100。

本发明的方法较之现有常用工艺有以下特点：

1.纯化过程单位体积填料载量高，可达30克GLP-1/升色谱填料以上。

2.纯化步骤简单，使用等度洗脱，可实现接近或超过90%以上的产率，产物纯度可达90%左右。

3.填料粒径较大，可承受样品中较高含量杂质，同时背压小，无需使用昂贵的高压色谱仪。

4.填料耐强酸强碱，可用氢氧化钠反复清洗，有效去除残留杂质，增加填料使用循环数。

5.纯化中仅使用较少量的，环境友好的醇类有机溶剂（如乙醇，异丙醇等）。

6.填料价格较低，生产成本低。

附图说明

图1为GLP-1融合蛋白示意图。

图2示出了不同pH值下，GLP1类似物（A. GLP1(7-37, 34R); B.GLP1(9-37, 34R)）在聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱NM100上的载量测定。

图3示出了不同pH值下，GLP1类似物（GLP1(7-37, 8G, 22E, 36G) ）在聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱DIAION HP20SS色谱上的载量测定。

图4示出了最适pH值下，GLP1类似物（GLP1(9-37, 34R)）在其他品牌聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱上的载量测定。

图5示出了pH 9.0时，酰化GLP1类似物在聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱DIAION上的HP20SS上载量测定。

具体实施方式

下面将结合附图对本公开的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，基于本公开中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本公开保护的范围。

需要注意的是，本文所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。

本文所用的术语“GLP-1类似物”意欲指定GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)酰胺及其类似物和衍生物。这样的GLP-1肽包括但不限于天然胰高血糖素样肽-1，例如WO 87/06941中公开的这些包含GLP-1 (7-37)及其功能性衍生物的肽碎片；WO 90/11296中公开的这些包含GLP-1 (7-36)及其功能性衍生物的肽碎片；WO 91/11457中公开的活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37这些类似物；WO 98/08871中公开的这些GLP-1衍生物，其中亲脂性取代基连接在至少一个氨基酸残基上；EP 0699686-A2中公开的这些GLP-1的N-末端截短的片段；和EP 0708179-A2公开的这些包括N-末端咪唑基团的GLP-1类似物和衍生物。

如上所述，本公开的目的在于提供一种纯化GLP-1类似物的方法，以解决样品损失大、影响因素多等的技术问题，提高工艺稳定性和效率。

本发明的式(I)所示的GLP-1类似物的纯化方法包括使用聚合物反相填料纯化GLP-1类似物；优选地，所述聚合物反相填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，

X₇X₈X₉X₁₀TFTSDVSSYLEX₂₂QAAX₂₆X₂₇FIAWLVX₃₄GX₃₆G (I)

其中：

X₇为H或缺失；

X₈为A、Aib、G、S、V或缺失；

X₉为E或缺失；

X₁₀为G或缺失；

X₂₂为G或E；

X₂₆为R、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

X₂₇为E、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

X₃₄为R、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K；

X₃₆为R、G、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。

在本发明的优选实施方案中，缺失X₇、X₈、X₉或X₁₀中的一个或多个。

在本发明的一个具体实施方案中，缺失X₇X₈。

在本发明的一个具体实施方案中，缺失X₇X₈X₉X₁₀。

在本发明的优选实施方案中，反相填料选自苏州纳微科技股份公司NM100、三菱化学株式会社DIAION HP20SS和/或苏州强耀生物科技有限公司Super100。

在本发明的优选实施方案中，X₈为A、Aib、G、S、V或缺失。

在本发明的一个具体实施方案中，X₈为A。

在本发明的一个具体实施方案中，X₈为Aib。Aib即为2-氨基异丁酸。

在本发明的一个具体实施方案中，X₈为G。

在本发明的一个具体实施方案中，X₈为S。

在本发明的一个具体实施方案中，X₈为V。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₂为G。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₂为E。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₆为R。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₆为K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₆为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₇为E。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₇为K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₂₇为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₄为R。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₄为K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₄为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₆为R。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₆为G。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₆为K。

在本发明的一个具体实施方案中，X₃₆为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。

在本发明的一个具体实施方案中，缺失X₇X₈。

在本发明的一个具体实施方案中，缺失X₇X₈X₉X₁₀。

在本发明的优选实施方案中，所述脂肪酸选自C12-C22脂肪酸，更优选地，所述脂肪酸为棕榈酸或硬脂酸。

在本发明的优选实施方案中，所述脂肪酸衍生物选自：

，或

其中，*表示该末端为与多肽链上赖氨酸侧链连接的位点。

式(I)所示的GLP-1类似物选自：

（1）GLP1(7-37, 34R)，其氨基酸序列为：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG；

（2）GLP1(9-37, 34R)，其氨基酸序列为：

EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG；

（3）GLP1(7-37, 8G, 22E, 36G)，其氨基酸序列为：

HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG；

（4）利拉鲁肽（Liraglutide），其结构为：

（5）司美鲁肽（Semaglutide），其结构为：

。

在本发明的优选实施方案中，流动相的pH值在8.5-9.5范围内；更优选为pH 8.5-9.0。

在本发明的优选实施方案中，使用酸或碱调节pH值。所述酸选自有机酸或无机酸，优选地，所述酸为盐酸或醋酸。所述碱选自有机碱或无机碱，优选的，所述碱为氢氧化钠。

在本发明的优选实施方案中，使用醇类为流动相；优选地，使用异丙醇、乙醇、丁醇或丙醇作为流动相。

在本发明的一个具体实施方案中，使用异丙醇作为流动相；优选地，所述流动相为：5-50mM Tris，1-10%w/w异丙醇，pH 8.5-9.5；更优选地，所述流动相为：20mM Tris，5%w/w（质量分数）异丙醇，pH 8.5-9.0。

本发明所述的GLP-1类似物化学合成方法和基因工程方法既可以用化学合成法生产，也可以用基因工程方法生产，优选使用基因工程方法。其中的化学方法优选是固相合成法。当然还可以采用本领域公知的其它常规方法来合成。

本发明的优选实施方案中，使用苏州纳微科技有限公司生产的NM100，日本三菱化学控股株式会社生产的DIAION HP20SS，苏州强耀生物科技有限公司生产的Super100等聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相填料进行纯化。

本发明的实验结果表明，聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相填料受上样样品pH影响明显，仅在pH8.5-9.5范围内，可实现理想载量(30g/L左右)。

下面通过具体实施例来说明本发明的技术方案。

实施例1 GLP1类似物融合蛋白的制备

编码GLP1类似物融合蛋白(见图1)的质粒转化至BL21(DE3)衍生的大肠杆菌宿主工程菌中进行表达，表达产生不可溶性包涵体。经菌体破碎后，回收包涵体；溶解复性后以蛋白酶酶切去除表达标签，加入1/20质量分数的异丙醇后，调节pH值至指定值。离心，澄清，获得GLP1 (9-37, 34R)，GLP1(7-37, 34R)或GLP1 (7-37, 8G, 22E, 36G)样品。

利拉鲁肽样品，由GLP1(7-37, 34R)样品经化学酰化反应，连接脂肪酸侧链制备；司美鲁肽样品，由GLP1 (9-37, 34R)样品经化学反应，添加N-端非天然氨基酸和脂肪酸侧链制备。

实施例2 pH值对层析填料载量的影响

（1）使用NM100层析填料色谱柱

使用8mL装填NM100层析填料色谱柱，以流动相A1（20mM Tris，5%w/w异丙醇，pH 8.5；测试pH 8.0及以上样品）或A2（0.1% w/w甲酸，5% w/w异丙醇；测试pH 3.0和pH2.5样品时）平衡，将实施例1制备的GLP1(7-37, 34R)或GLP1(9-37, 34R)样品在不同pH值的样品连续上样至30克的蛋白/每升色谱填料左右，检测在不同体积流穿样品中目的蛋白浓度，样品上样量通过如下公式计算：

结果如见图2所示，其中，图2A为GLP1(7-37, 34R)的载量测定，图2B为GLP1(9-37,34R)的载量测定。以流穿比例低于20%作为标准，在使用pH8.5和9.0样品时，对于上述两种GLP1类似物，聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱填料均可实现30g/L左右的上样载量。

（2）使用DIAION HP20SS层析填料色谱柱

相似的，使用8mL装填DIAION HP20SS层析填料色谱柱，以流动相A1（20mM Tris，5%w/w异丙醇，pH 8.5；测试pH 8.0及以上样品）或A2（0.1% w/w甲酸，5% w/w异丙醇；测试pH 3.0样品时）平衡，将实施例1制备的GLP1 (7-37, 8G, 22E, 36G)样品在不同pH值的样品连续上样至30克的蛋白/每升色谱填料左右，检测在不同体积流穿样品中目的蛋白浓度，样品上样量通过前述相同公式计算。

结果如见图3所示。以流穿比例低于20%作为标准，在样品pH为7.5-9.0时，对于此GLP1类似物，聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱填料可实现30g/L左右的上样载量。

实施例3 上样量对层析填料效果的影响

（1）GLP1 (9-37, 34R)样品

依实施例1中描述方法，制备的GLP1 (9-37, 34R)样品，酶切后加入1/20质量的异丙醇，如pH在8.5-9.5范围之外，以盐酸或氢氧化钠调节pH至此区间中。

使用27mL装填NM100层析填料色谱柱，以流动相A1（20mM Tris，5%w/w异丙醇pH8.5），将GLP1(9-37, 34R）样品按不同上样比例上样，以流动相B(20mM Tris，30%w/w异丙醇，pH 8.5)洗脱目的多肽，比较流穿比例、回收率、洗脱峰体积和洗脱峰纯度（以反相高压液相色谱法测定）等参数，结果见表1。

表1 不同上样量下聚苯乙烯聚合物反向色谱纯化GLP1 (9-37, 34R)效果比较

（2）GLP1(7-37, 34R)样品

依实施例1中描述方法，制备的GLP1(7-37, 34R)样品，酶切后加入1/20质量的异丙醇，如pH在8.5-9.5之外，以盐酸或氢氧化钠调节pH至此区间中。

使用27mL装填NM100层析填料色谱柱，以流动相A1（20mM Tris，5%w/w异丙醇，pH8.5），将GLP1(7-37, 34R)样品按不同上样比例上样，以流动相B(20mM Tris，30%w/w异丙醇，pH 8.5)洗脱目的多肽，比较流穿比例，回收率，洗脱峰体积和洗脱峰纯度等参数，结果见表2。

表2 不同上样量下聚苯乙烯聚合物反向色谱纯化GLP1 (7-37, 34R)效果比较

以上实例说明，以上两种GLP1类似物，均可在NM100聚合物反相填料柱上实现接近40克/升载量，洗脱回收率、洗脱峰体积和洗脱峰纯度在不同上样量测试中，基本保持一致。

实施例4：其他聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反向色谱填料效果

采用与实施例1中相同方法制备GLP1(9-37, 34R)样品，酶切后加入1/20质量的异丙醇，如pH在8.5-9.5范围之外，以盐酸或氢氧化钠调节pH至此区间中。使用27mL色谱柱分别装填DIAION HP20SS或Super100层析填料。测试时，以流动相A1（20mM Tris，5%w/w异丙醇，pH 8.5）平衡后，将GLP1(9-37, 34R）样品按约40克目标蛋白/升色谱填料比例上样，以流动相B(20mM Tris，30%w/w异丙醇，pH 8.5)洗脱结合的目的多肽，采用实施例2中描述的方法，绘制流穿曲线（图4）；同时，比较最终流穿比例、回收率、洗脱峰体积和洗脱峰纯度等参数（表3）。

表3：不同品牌填料的纯化效果比较

填料	上样量(g/L)	流穿比例	洗脱回收率	洗脱峰体积（CV）	洗脱峰纯度
						HP20SS	41.6	2.2%	93.7%	1.6	90.6%
Super100	38.4	2.5%	100.7%	2.0	89.7%

以上实例说明，GLP1类似物在其他聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相填料DIAIONHP20SS和Super100柱上均实现40克/升以上载量，洗脱回收率，洗脱峰体积和洗脱峰纯度与NM100相比，基本保持一致。

实施例4：酰化修饰的GLP-1类似物使用聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反向色谱填料纯化效果

使用8mL装填DIAION HP20SS层析填料色谱柱，以流动相A1（20mM Tris，5%w/w异丙醇，pH 8.5；测试pH 8.0及以上样品）平衡，将实施例1制备的利拉鲁肽和司美鲁肽样品（预先调节pH至9.0）连续上样至30克的蛋白/每升色谱填料以上，检测在不同体积流穿样品中目的蛋白浓度，样品上样量通过前述相同公式计算。结果如见图5所示。以流穿比例低于20%作为标准，在样品pH为9.0时，对于这两种GLP1类似物，聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱填料DIAION HP20SS可实现约30g/L的上样载量。

上样后，以流动相A1充分冲洗色谱柱去除非特异性结合蛋白后，以流动相B (20mMTris，30%w/w异丙醇，pH 8.5)洗脱目的多肽，计算洗脱峰产率和总回收率（目的蛋白在流穿中的比例+洗脱峰中的比例）。结果如表4所示，结果显示，酰化GLP1类似物，在聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相填料色谱纯化中，并未出现柱上聚集等造成蛋白损失的情况，总回收率超过90%。

表4：酰化GLP-1载量回收率测定