阅读说明：本技术 杀有害生物基因及使用方法 (Pesticidal genes and methods of use ) 是由 K·B·罗伯斯 R·E·塞耶 J·帕克斯 于 2018-12-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了具有杀有害生物活性的组合物及其使用方法。组合物包括：分离的和重组的具有杀有害生物活性的多肽序列,重组的和合成的编码所述杀有害生物多肽的核酸分子,包含所述核酸分子的DNA构建体,包含所述核酸分子的载体,包含所述载体的宿主细胞,以及针对所述杀有害生物多肽的抗体。本文提供的编码所述多肽的核苷酸序列可以在用于在感兴趣的生物体中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。本文提供的组合物和方法可用于生产具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。还提供了包含编码本发明的杀有害生物蛋白的核苷酸序列的转基因植物和种子。提供了用于制备本文公开的多肽的方法,以及使用这些多肽防治有害生物的方法。还包括用于检测样品中的本发明的多肽的方法和试剂盒。(The present invention provides compositions having pesticidal activity and methods of use thereof. The composition comprises: an isolated and recombinant polypeptide sequence having pesticidal activity, a recombinant and synthetic nucleic acid molecule encoding the pesticidal polypeptide, a DNA construct comprising the nucleic acid molecule, a vector comprising the nucleic acid molecule, a host cell comprising the vector, and an antibody directed against the pesticidal polypeptide. The nucleotide sequences provided herein that encode the polypeptides may be used in DNA constructs or expression cassettes for transformation and expression in an organism of interest. The compositions and methods provided herein can be used to produce organisms with enhanced pest resistance or tolerance. Also provided are transgenic plants and seeds comprising a nucleotide sequence encoding a pesticidal protein of the invention. Methods for making the polypeptides disclosed herein, as well as methods of using these polypeptides to control pests, are provided. Also included are methods and kits for detecting a polypeptide of the invention in a sample.)

杀有害生物基因及使用方法

技术领域

本发明涉及用于防治有害生物、特别是植物有害生物的方法和组合物。

背景技术

有害生物、植物病害和杂草对作物可以产生严重威胁。由于有害生物和病害造成的损失据估计占全球农业产量的37％，其中13％是因昆虫、细菌和其他生物体引起的。

毒素是在微生物致病性和/或逃避宿主免疫应答中具有重要地位的毒力决定因子。来自***芽孢杆菌(Bacillus)，特别是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的毒素已经被用作杀昆虫蛋白。目前策略使用表达这些毒素的基因来产生转基因作物。表达杀昆虫蛋白毒素的转基因作物用来对抗由昆虫引起的作物损害。

尽管芽孢杆菌毒素的使用已经成功地防治了昆虫，但在世界上已经广泛使用此类毒素的许多地方在一些靶有害生物中已经发生了对Bt毒素的抗性。解决此问题的一种方式是交互行播Bt作物与常规的非Bt作物(庇护区)。避免或延缓发生昆虫抗性的替代方法是在转基因植物中叠加具有针对昆虫的不同作用模式的杀昆虫基因。目前使用表达杀昆虫蛋白毒素的转基因作物的策略是将越来越多的注意力集中于发现已经源自细菌苏云金芽孢杆菌的那些毒素以外的新毒素。这些毒素可以证明可用作源自苏云金芽孢杆菌的那些毒素的替代物而用于部署在抗昆虫和抗有害生物的转基因植物中。因此，需要新的毒素蛋白。

发明内容

本发明提供了具有杀有害生物活性的组合物及其使用方法。组合物包括：分离的具有杀有害生物活性的重组多肽序列，重组的和合成的编码所述杀有害生物多肽的核酸分子，包含所述核酸分子的DNA构建体，包含所述核酸分子的载体，包含所述载体的宿主细胞，以及针对所述杀有害生物多肽的抗体。本文提供的编码所述多肽的核苷酸序列可以在用于在感兴趣的生物体中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用，所述生物体包括微生物和植物。

本文提供的组合物和方法可用于生产具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含所述生物体的组合物对于农业目的是合乎需要的。还提供了包含编码本发明的杀有害生物蛋白的核苷酸序列的转基因植物和种子。此类植物对昆虫和其他有害生物有抗性。

提供了用于制备本文公开的各种多肽的方法，以及使用这些多肽防治或杀死有害生物的方法。还包括检测样品中本发明的多肽的方法和试剂盒。

具体实施方式

本发明现在将参照附图在下文中更充分地进行描述，在附图中显示本发明的一些但不是全部的实施方案。事实上，这些发明可以以许多不同的形式实现，它们不应当被认为限于本文所提出的实施方案；而是，提供这些实施方案使得本发明将满足适用的法律要求。类似的编号自始至终指代类似的元件。

本文所示的发明的许多改动和其他实施方案将被这些发明所属领域的技术人员想到具有上述描述和相关附图中所提出的教导的益处。因此，要理解的是本发明不限于公开的具体实施方案，并且其改动和其他实施方案意在包括在附带的权利要求的范围内。尽管本文中采用了特定的术语，但是它们仅以一般性和描述性意义使用，不以限制为目的。

I.多核苷酸和多肽

提供了向生物体赋予杀有害生物活性的组合物和方法。被修饰的生物体表现出有害生物抗性或耐受性。提供了重组杀有害生物蛋白，或多肽以及保留杀有害生物活性的其片段和变体，并且包括下述SEQ ID NO中所示的那些：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309和/或310。杀有害生物蛋白是针对有害生物有生物活性的(例如，杀有害生物活性)，所述有害生物包括昆虫、真菌、线虫类，等等。编码杀有害生物多肽的核苷酸，包括例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312或其活性片段或变体，可以用来产生转基因生物体，诸如植物和微生物。杀有害生物蛋白针对有害生物是有生物活性的(例如，是杀有害生物的)，所述有害生物包括昆虫、真菌、线虫类，等等。在具体实施方案中，与本领域中的其他多肽相比，所述杀有害生物多肽及其活性变体和片段具有提高的杀有害生物活性。编码杀有害生物多肽的多核苷酸，包括例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312或其活性片段或变体，可以用来产生转基因生物体，诸如植物和微生物。转化的生物体的特征在于基因组包含至少一个稳定掺入的DNA构建体，所述DNA构建体包含本文公开的杀有害生物蛋白的编码序列。在一些实施方案中，编码序列可操作地连接到驱动所编码的杀有害生物多肽的表达的启动子。因此，提供了转化的微生物、植物细胞、植物组织、植物、种子和植物部分。各种多肽、其活性变体和片段以及编码它们的多核苷酸的汇总示于下面的表1中。如表1中所示，提供了各种形式的多肽。提供了全长杀有害生物多肽，以及原始全长序列的修饰版本(即，变体)。表1进一步注明了“CryBP1”序列。此类序列(SEQ ID NO:22、24、84和236)包含可以与一些毒素基因相关联的辅助多肽。在这种情况下，CryBP1序列可以单独使用或与本文提供的任一种杀有害生物多肽组合使用。表1进一步提供了断裂-Cry C-末端多肽(SEQ IDNO:82)。此类序列包含与Cry类的毒素基因的C-末端具有同源性的下游蛋白的序列，并且发现其通常在不是全长的且缺少了期望的C-末端区域的Cry基因后。

i.杀有害生物蛋白的类别

本文提供的杀有害生物蛋白以及编码它们的核苷酸序列在影响有害生物的方法中是有用的。即，本发明的组合物和方法在农业中能用于防治或杀死有害生物，包括许多作物的有害生物。本文提供的杀有害生物蛋白是来自细菌的毒素蛋白并且表现出针对某些有害生物的活性。杀有害生物蛋白来自包括Cry、Cyt、BIN、Mtx毒素的几类毒素。参见，例如，表1中的本文提供的各种SEQ ID NO的具体蛋白分类。另外，在本发明中自始至终参照Pfam数据库条目。Pfam数据库是蛋白家族的数据库，每个家族由多序列比对和特征隐马尔科夫模型(profile hidden Markov model)表示。Finn等人，(2014)Nucl.Acid Res.DatabaseIssue42:D222-D230。

苏云金芽孢杆菌(Bt)是一种***，其在其生长的孢子形成期期间产生作为晶体包涵体的杀昆虫蛋白。苏云金芽孢杆菌(Bt)的蛋白包涵体称为晶体蛋白或δ-内毒素(或Cry蛋白)，其对昆虫纲成员和其他无脊椎动物有毒性。同样，Cyt蛋白是来自Bt的伴孢包涵体蛋白，其表现出溶血(细胞溶解)活性或与已知的Cyt蛋白具有序列相似性。这些毒素对它们的靶生物体是高度特异的，对人、脊椎动物和植物是无害的。

Cry毒素的结构揭示了5个保守的氨基酸块，主要集中在结构域的中心或在结构域之间的连接点处。Cry毒素由三个结构域组成，每个结构域具有特定的功能。结构域I是7个α-螺旋的束，其中中央螺旋被6个外部螺旋完全围绕。该结构域参与膜中的通道形成。结构域II似乎为三个反平行β–片层的三棱柱，其类似于免疫球蛋白的抗原结合区。结构域III含有β夹心形式的反平行β–链。毒素蛋白的N-末端部分负责其毒性和特异性，并且含有5个保守的区域。C-末端部分通常是高度保守的，并且可能负责晶体形成。参见，例如，美国专利号8,878,007。

苏云金芽孢杆菌的菌株显示针对不同的昆虫目(鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱毛目(Phthiraptera)或食毛目(Mallophaga)和螨(Acari))和其他无脊椎动物(线形动物门(Nemathelminthes),扁形动物门(Platyhelminthes)和Sarocomastebrates)的宽范围的特异性。Cry蛋白基于对各种昆虫和无脊椎动物群的毒性分成多个组。一般来说，Cry I表明对鳞翅目有毒性，Cry II对鳞翅目和双翅目有毒性，CryIII对鞘翅目有毒性，Cry IV对双翅目有毒性，Cry V和Cry VI对线虫有毒性。新的Cry蛋白可以基于氨基酸同一性进行鉴定并指定Cry组。参见，例如，Bravo,A.(1997)J.of Bacteriol.179:2793-2801；Bravo等人(2013)Microb.Biotechnol.6:17-26,它们通过引用并入本文。

超过750种不同的cry基因序列已经被分成73个组(Cry1–Cry73)，该基因家族的新成员持续被发现(Crickmore等人(2014)www.btnomenclature.info/)。cry基因家族由几个在系统发育上不相关的蛋白家族组成，这些蛋白家族可以具有不同的作用模式：三结构域Cry毒素的家族，灭蚊Cry毒素的家族，二元样毒素的家族，和Cyt毒素家族(Bravo等人，2005)。一些Bt株产生额外的杀昆虫毒素，即VIP毒素。还参见，Cohen等人，(2011)J.Mol.Biol.413:4-814；Crickmore等人，(2014)苏云金芽孢杆菌毒素命名法，参见万维网lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/；Crickmore等人，(1988)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813；Gill等人，(1992)Ann.Rev.Entomol.37:807-636；Goldbert等人(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:2716-2712；Knowles等人(1992)Proc.R.Soc.Ser.B.248:1-7；Koni等人(1994)Microbiology 140:1869-1880；Lailak等人(2013)Biochem.Biophys.Res.Commun.435:216-221；Lopez-Diaz等人(2013)Environ.Microbiol.15:3030-3039；Perez等人(2007)Cell.Microbiol.9:2931-2937；Promdonkoy等人(2003)Biochem.J.374:255-259；Rigden(2009)FEBS Lett.583:1555-1560；Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806；Soberon等人(2013)Peptides 41:87-93；Thiery等人(1998)J.Am.Mosq.Control Assoc.14:472-476；Thomas等人(1983)FEBS Lett.154:362-368；Wirth等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10536-10540；Wirth等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:185-189；和Zhang等人(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70:2199-2204；每一篇文献的全部内容均通过引用并入本文。

Cyt是指来自苏云金芽孢杆菌的具有细胞溶解活性的伴孢晶体包涵体蛋白，或与已知的Cyt蛋白具有序列相似性的蛋白。(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。基因表示为cyt。这些蛋白在结构和活性上与Cry蛋白不同(Gill等人(1992)Annu.Rev.Entomol.37:615-636)。Cyt毒素首先在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中发现(Goldberg等人(1977)Mosq.News.37:355-358)。存在3个Cyt毒素家族，在目前的命名法中包括11种正模毒素(Crickmore等人(2014)苏云金芽孢杆菌毒素命名法参见万维网lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。大多数具有cyt基因的苏云金芽孢杆菌分离株显示针对双翅目昆虫(特别是蚊子和黑蝇)的活性，但有记载在苏云金芽孢杆菌菌株中还存在靶向鳞翅目或鞘翅目昆虫的cyt基因(Guerchicoff等人(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:2716-2721)。

通过X-射线结晶学解析的Cyt2A的结构显示了单一结构域，其中两个外层的α-螺旋围绕混合的β-片层。可进一步获得的Cyt毒素的晶体结构支持保守的α-β结构模型，所述α-β结构模型具有在含有7-8个β-链的β-片层核心侧翼的两个α-螺旋发夹。(Cohen等人(2011)J.Mol.Biol.413:80 4-814)诱变研究将β-片层残基鉴定为对毒性是至关重要的，而螺旋结构域中的突变不影响毒性(Adang等人；Diversity of Bacillus thuringiensisCrystal Toxins and Mechanism of Action.见:T.S.Dhadialla和S.S.Gill,编辑,Advances in Insect Physiology,Vol.47,Oxford:Academic Press,2014,39-87页.)Cyt毒素的代表性结构域是δ-内毒素，Bac_thur_毒素(Pfam PF01338)。

对于Cyt毒素的作用模式提出了多个模型，这仍是活跃研究的领域。已经显示一些Cyt蛋白(Cyt1A)对于结晶需要辅助蛋白的存在。Cyt1A和Cyt2A原毒素在N-和C-末端中的相同位点处被消化蛋白酶加工成稳定的毒素核心。Cyt毒素然后与不饱和的膜脂质相互作用，所述膜脂质诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。对于Cyt毒素，孔形成和去污剂样膜破坏已经被提议为非排他机制；一般公认两者的发生可能取决于毒素浓度，较低浓度有助于寡聚体孔，较高浓度导致膜破裂。(Butko(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:2415-2422)在孔形成模型中，Cyt毒素与细胞膜结合，诱导膜泡中形成阳离子选择性通道，引起细胞的胶体-渗透裂解(Knowles等人(1989)FEBS Lett.244:259-262；Knowles等人(1992)Proc.R.Soc.Ser.B.248:1-7和Promdonkoy等人(2003)Biochem.J.374:255-259)。在去污剂模型中，在脂质双层的表面上存在毒素的非特异性聚集，引起膜解组装和细胞死亡。(Butko(2003)，见前；Manceva等人(2005)Biochem.44:589-597)。

多个研究已经显示在Cyt毒素和其他苏云金芽孢杆菌毒素(特别是Cry、Bin和Mtx毒素)之间的协同活性。这种协同作用已经显示甚至克服了昆虫对其他毒素的抗性。(Wirth1997,Wirth 2005,Thiery 1998,Zhang2006)Cyt对Cry毒素的协同效应被认为涉及在溶液中或在膜平面上Cyt1A与Cry毒素的结构域II的结合以促进Cry毒素原-孔寡聚体(pre-poreoligomer)的形成。此寡聚体的形成独立于Cyt寡聚化、结合或***。(Lailak 2013,Perez2007,Lopez-Diaz 2013)

苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的一些菌株在营养生长期间产生许多与Cry蛋白不相关的杀有害生物蛋白(Estruch等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:5389–5394；Warren等人(1994)WO 94/21795)。这些营养期杀昆虫蛋白，或称为Vip,不形成伴孢晶体蛋白并且显然从细胞分泌。Vip目前被排除在Cry蛋白命名法外，因为它们是不形成晶体的蛋白。从一些苏云金芽孢杆菌Cry蛋白(最引人注意的是Cry3Aa)也在营养生长期期间以及在静止期和孢子形成期期间产生的意义上来说，术语VIP是用词不当。Vip基因在苏云金芽孢杆菌基因组中的位置已有报道，存在于也编码cry基因的大质粒上(Mesrati等人(2005)FEMS Microbiol.Lett.244(2):353-8)。Bt毒素命名法的网址可以参见万维网的lifesci.sussex.ac.uk，路径为“/home/Neil_Crickmore/Bt/”以及在：“btnomenclature.info/”。还参见Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3):775-806。这些文献通过引用并入本文。

Vip基因可以分为4类。一些Vip基因形成二元双组分蛋白复合物；“A”组分通常是“活性”部分，“B”组分通常是“结合”部分。(Pfam pfam.xfam.org/family/PF03495)。Vip1和Vip4蛋白通常含有二元毒素B蛋白结构域。Vip2蛋白通常含有二元毒素A蛋白结构域。

Vip1和Vip2蛋白是表现出对鞘翅目有毒性的二元毒素的两个组分。Vip1Aa1和Vip2Aa1对玉米根虫，特别是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)和长角叶甲(Diabrotica longicornis)活性高(Han等人(1999)Nat.Struct.Biol.6:932–936；WarrenGW(1997)“Vegetative insecticidal proteins:novel proteins for control of cornpests”见：Carozzi NB,Koziel M(编辑)Advances in insect control,the role oftransgenic plants；Taylor&Francis Ltd,London,109–21页)。结合膜的95kDa Vip1多聚体为52kDa vip2ADP-核糖化酶(ADP-ribosylase)提供了进入靶西方玉米根虫细胞的细胞质的通路(Warren(1997)见前)。在体内NAD-依赖性ADP-核糖基转移酶Vip2可能在Arg177处修饰单体肌动蛋白以阻断聚合作用，导致肌动蛋白细胞骨架的损失并最终由于肌动蛋白丝内的快速亚基交换导致细胞死亡(Carlier M.F.(1990)Adv.Biophys.26:51–73)。

像Cry毒素一样，活化的Vip3A毒素是能够在膜中产生稳定离子通道的孔形成蛋白(Lee等人(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:4648–4657)。Vip3蛋白对几种主要的鳞翅目害虫有活性(Rang等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71(10):6276-6281；Bhalla等人(2005)FEMS Microbiol.Lett.243:467–472；Estruch等人(1998)WO 9844137；Estruch等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93:5389–5394；Selvapandiyan等人(2001)Appl.EnvironMicrobiol.67:5855–5858；Yu等人(1997)Appl.Environ Microbiol.63:532–536)。Vip3A对小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和美洲棉铃虫(Helicoverpazea)有活性(Warren等人(1996)WO 96/10083；Estruch等人(1996)Proc Natl Acad SciUSA 93:5389–5394)。像Cry毒素一样，Vip3A蛋白在中肠上皮表面处识别与被Cry毒素识别的那些不同的特定膜蛋白之前必须被蛋白酶活化。

毒素蛋白的MTX家族的特征在于存在保守结构域，即ETX_MTX2(pfam 03318)。此家族成员与来自球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的灭蚊毒素Mtx2和Mtx3，以及与来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的ε毒素ETX存在序列同源性(Cole等人(2004)Nat.Struct.Mol.Biol.11:797-8；Thanabalu等人(1996)Gene 170:85-9)。MTX-样蛋白在结构上与三结构域Cry毒素截然不同，因为它们具有细长的和占优势的基于β-片层的结构。然而，类似于三结构域毒素，MTX-样蛋白被认为在靶细胞的膜中形成孔(Adang等人(2014)，见前)。不像三结构域Cry蛋白，MTX-样蛋白在长度上小得多，范围为267个氨基酸(Cry23)至340个氨基酸(Cry15A)。

MTX-样毒素的蛋白家族与三结构域Cry家族相比是相对小的类别(Crickmore等人(2014)见前；Adang等人(2014)见前)。MTX-样毒素家族成员包括Cry15、Cry23、Cry33、Cry38、Cry45、Cry46、Cry51、Cry60A、Cry60B和Cry64。该家族表现出一定范围的杀昆虫活性，包括针对鳞翅目和鞘翅目的昆虫害虫的活性。该家族的一些成员可以与其他蛋白形成二元伴侣关系，这对于杀昆虫活性可以是必需的或不是必需的。

Cry15是在苏云金芽孢杆菌血清变型汤普逊HD542中鉴定的34kDA蛋白；其天然与大约40kDa的不相关蛋白一起以晶体存在。编码Cry15及其伴侣蛋白的基因一起排列在操纵子中。单独Cry15显示对鳞翅目昆虫害虫具有活性，所述鳞翅目昆虫害虫包括烟草天蛾(Manduca sexta)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)和菜粉蝶(Pieris rapae)，其中40kDA蛋白的存在显示仅增加Cry15对苹果蠹蛾的活性(Brown K.和Whiteley H.(1992)J.Bacteriol.174:549-557；Naimov等人(2008)Appl.Environ.Microbiol.74:7145–7151)。需要进一步的研究来阐明Cry15的伴侣蛋白的功能。类似地，Cry23是29kDA蛋白，其显示与其伴侣蛋白Cry37一起对鞘翅目害虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和日本弧丽金龟(Popillia japonica)有活性(Donovan等人(2000)US专利号6,063,756)。

MTX-样家族的新成员不断地被鉴定到。ETX_MTX毒素基因最近在苏云金芽孢杆菌血清变型tolworthi菌株Na205-3的基因组中被鉴定到。发现该菌株对鳞翅目害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)有毒性，并且其还含有Cry1、Cry11、Vip1、Vip2和Vip3的同源物(Palma等人(2014)Genome Announc.2(2):e00187-14.2014年3月13日在线公开于doi:10.1128/genomeA.00187-14；PMCID:PMC3953196)。因为MTX-样蛋白具有相对于三结构域Cry蛋白的独特结构域结构，因此相信它们拥有独特的作用模式，由此使得它们成为昆虫防治和对抗昆虫抗性的有价值工具。

细菌细胞产生大量的毒素，对宿主和非宿主生物体具有多种多样的特异性。在大量的细菌家族中已经鉴定出了二元毒素的大家族，包括对昆虫害虫有活性的毒素。(Poopathi和Abidha(2010)J.Physiol.Path.1(3):22-38)。球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus，Ls),以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)(Ahmed等人(2007)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.57:1117-1125)，众所周知是一种昆虫生物防治菌株。Ls产生数种杀昆虫蛋白，包括强效的二元复合物BinA/BinB。该二元复合物在Ls细胞中形成伴孢晶体，对双翅目昆虫，特别是蚊子具有强力的和特异性的活性。在一些地区，已经报道了对现有的Ls灭蚊株的昆虫抗性。发现具有不同的靶标特异性或克服昆虫抗性的能力的新二元毒素有重大意义。

Ls二元杀昆虫蛋白复合物含有两种主要的多肽，42kDa多肽和51kDa多肽，分别称为BinA和BinB(Ahmed等人(2007)见前)。两种多肽协同作用从而赋予对其靶标的毒性。作用模式涉及在幼虫中肠中蛋白与受体的结合。在一些情况下，在幼虫肠中蛋白通过蛋白酶消化被修饰从而产生活化形式。BinB组分被认为参与结合，而BinA组分赋予毒性(Nielsen-LeRoux等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.67(11):5049–5054)。当单独地进行克隆和表达时，BinA组分对蚊幼虫有毒性，而BinB组分没有。然而，共同施用所述蛋白显著地增加毒性(Nielsen-LeRoux等人(2001)见前)。

已经记载了来自细菌来源的小量Bin蛋白同源物。Priest等人(1997)Appl.Environ.Microbiol.63(4):1195-1198描述了尝试通过杂交来鉴定新的Ls菌株，尽管他们鉴定的大多数基因编码与已知的BinA/BinB蛋白相同的蛋白。BinA蛋白含有确定的保守结构域，所述结构域称为Toxin 10超家族结构域。此毒素结构域最初通过其在BinA和BinB中的存在而定义。这两种蛋白均具有该结构域，尽管BinA和BinB之间的序列相似性在此区域中有限(<40％)。也具有杀昆虫活性的Cry49Aa蛋白也具有此结构域(下文所述)。

Ls的Cry48Aa/Cry49Aa二元毒素具有杀死致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫的能力。这些蛋白所在的蛋白结构类别与苏云金芽孢杆菌(Bt)的Cry蛋白复合物(其是一种众所周知的杀昆虫蛋白家族)具有一些相似性。Bt的Cry34/Cry35二元毒素也已知能杀死昆虫，包括西方玉米根虫(玉米的一种著名害虫)。Cry34是一种小的(14kDa)多肽，已经鉴定出了其几个变体，而Cry35(也由几个变体编码)是一种44kDa多肽。这些蛋白与BinA/BinB蛋白组具有一些序列同源性，并且被认为在进化上是相关的(Ellis等人(2002)Appl.Environ.Microbiol.68(3):1137-1145)。

磷酸肌醇磷脂酶C蛋白(PI-PLC；也称为磷脂酰肌醇磷脂酶C)是广义组的磷脂酶C蛋白的成员。这些蛋白质中的许多在作为正常细胞生理学的一部分的信号转导中起重要作用。几种重要的细菌毒素也含有与这些蛋白具有相似性的结构域(Titball,R.W.(1993)Microbiological Reviews.57(2):347-366)。重要的是，在Bt Cry蛋白质使昆虫细胞中毒期间，这些蛋白参与信号放大(Valaitis,A.P.(2008)Insect Biochemistry andMolecular Biology.38:611-618)。

PI-PLC毒素类别出现在芽孢杆菌分离株中，通常与其他所述毒素类别(如二元毒素)的同源物共同出现。这类序列与磷脂酰肌醇磷酸二酯酶(也称为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C-PI-PLC)具有同源性。Heinz等人(Heinz,等人,(1995)The EMBO Journal.14(16):3855-3863)解析了蜡样芽孢杆菌PI-PLC的晶体结构及其活性位点。

等人使用定向诱变、动力学和晶体结构分析研究了蜡样芽孢杆菌PI-PLC活性位点氨基酸残基在催化和底物结合中的作用(

等人(1997)Biochemistry.36(42):12802-13)。

这些PI-PLC毒素蛋白含有PLC样磷酸二酯酶、TIMβ/α-桶结构域(IPR017946)和/或磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性的X结构域(IPR000909)(也称为PI-PLC X-盒结构域)。我们还看到了具有这些结构域与其他典型的芽孢杆菌蛋白毒素结构域的组合的蛋白。该列表包括最常见的凝集素结构域(IPR000772)，该结构域是可以一个或多个拷贝存在的糖结合结构域，并且被认为与细胞膜结合，以及包括杀昆虫晶体毒素(IPR008872)(也称为Toxin 10或P42)，它是二元毒素的限定结构域。

之前，该PI-PLC类别的毒素在美国专利号8,318,900B2中定义为SEQ ID NO 30(DNA)和79(氨基酸)，在美国专利公开号20110263488A1中定义为SEQ ID NO 8(DNA)和9(氨基酸)，并且在美国专利号8,461,421B2中定义为SEQ ID NO 3(DNA)和63(氨基酸)。

本文提供了来自这些毒素类别的杀有害生物蛋白。这些杀有害生物蛋白根据其结构、与已知毒素的同源性和/或其杀有害生物特异性进行分类。

ii.杀有害生物蛋白的变体和片段和编码它们的多核苷酸

本发明的杀有害生物蛋白或多肽包括下列SEQ ID NO中所示的那些：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312及其片段和变体。“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”或“杀有害生物多肽”意指针对一种或多种有害生物(包括昆虫、真菌、线虫等等)有活性使得所述有害生物被杀死或受到防治的毒素或蛋白或多肽。

“分离的”或“纯化的”多肽或蛋白或其生物学活性部分基本上或实质上不含如在其天然存在的环境中发现的、通常伴随所述多肽或蛋白或者与所述多肽或蛋白相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多肽或蛋白当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。基本上不含细胞物质的蛋白包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当重组产生本发明的蛋白或其生物学活性部分时，最适地培养基代表少于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)的化学前体或非目的蛋白化学物质。

术语“片段”指本发明的多肽序列的一部分。“片段”或“生物学活性部分”包括包含足够数目的连续氨基酸残基以保留生物学活性(即具有杀有害生物活性)的多肽。杀有害生物蛋白的片段包括比全长序列更短的那些，其或者是由于使用替代的下游起始位点所致，或者是由于产生具有杀有害生物活性的较短蛋白的加工所致。加工可以在其中表达所述蛋白的生物体中发生，或者在摄入所述蛋白后在有害生物中发生。所述蛋白的片段的实例可以在表1中找到。杀有害生物蛋白的生物学活性部分可以是例如，下述任一个SEQ ID NO的长度为10、25、50、100、150、200、250或更多个氨基酸的多肽：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。这些生物学活性部分可以通过重组技术制备并且评估杀有害生物活性。如本文所使用的，片段包含下述SEQ ID NO的至少8个连续氨基酸：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

细菌基因(包括编码本文公开的杀有害生物蛋白的那些)在开放读码框的起始点附近经常具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能蛋白的生成。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌诸如芽孢杆菌属(Bacillus sp.)也将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白在第一个氨基酸处含有甲硫氨酸。在极少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，尽管在这种情况下TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不能事先确定这些密码子中的哪一个在细菌中天然使用。因此，应理解使用替代甲硫氨酸密码子之一也可以导致杀有害生物蛋白的生成。这些杀有害生物蛋白涵盖在本发明中，并且可以用于本文公开的方法中。应理解当在植物中表达时，有必要将替代起始密码子改变为ATG用于正确的翻译。

在各种实施方案中，本文提供的杀有害生物蛋白包括由全长核苷酸序列推导的氨基酸序列，以及由于使用替代的下游起始位点而比全长序列短的氨基酸序列。因此，本发明的核苷酸序列和/或包含本发明的核苷酸序列的载体、宿主细胞和植物(以及制备和使用本发明的核苷酸序列的方法)可以包含编码替代起始位点的核苷酸序列。

要认识到可以对本文提供的杀有害生物多肽作出修饰，产生变体蛋白。通过应用定向诱变技术可以引入由人设计的变化。备选地，也可以鉴定落入本发明范围内的与本文公开的序列在结构和/或功能上相关的天然、然而迄今未知的或迄今未鉴定的多核苷酸和/或多肽。保守氨基酸取代可以在不改变杀有害生物蛋白功能的非保守区域中进行。备选地，可以进行提高毒素活性的修饰。通过结构域III交换修饰Cry毒素在一些情况下已得到了针对某些昆虫物种具有提高的毒性的杂合毒素。因此，结构域III交换可以是提高Cry毒素的毒性或产生针对对于亲本Cry毒素未显示易感性的有害生物具有毒性的新型杂合毒素的有效策略。结构域II环序列的定向诱变可以产生具有增加的杀昆虫活性的新毒素。结构域II环区是初始Cry毒素的关键结合区，其是用于诱变和选择具有提高的杀昆虫特性的Cry毒素的合适靶标。Cry毒素的结构域I可以进行修饰，以引入蛋白酶切割位点而提高针对某些有害生物的活性。用于在大量cry基因中改组这三个不同结构域的策略和高通量生物测定筛选方法可以提供具有提高的或新型的毒性的新型Cry毒素。

如所指出的那样，本文公开的多肽的片段和变体将保留杀有害生物活性。杀有害生物活性包括组合物实现减少靶有害生物的出现或活性的可观察效应的能力，包括例如导致至少一种有害生物的死亡，或者有害生物生长、进食或正常生理发育的明显下降。数目、有害生物生长、进食或正常发育的这些下降可以包含任何统计学上显著的降低，包括例如约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％或更多的降低。本文提供了针对各种有害生物中的一种或多种的杀有害生物活性，包括例如针对鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、线虫(Nematodes)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等或本文描述的任何其他有害生物的杀有害生物活性。要认识到，相对于天然蛋白的活性而言，杀有害生物活性可以是不同的或提高的，或者它可以保持不变，只要保留杀有害生物活性即可。用于测量杀有害生物活性的方法在本文中其它地方提供。也参见Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology 78:290-293；和美国专利号5,743,477，所有这些文献通过引用整体并入本文。

“变体”意指具有与下述任一个SEQ ID NO的氨基酸序列至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的氨基酸序列并且保留杀有害生物活性的多肽：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。要注意，表1对SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312中的每一种提供了变体多肽(以及编码所述变体多肽的多核苷酸)的非限制性实例。本发明的杀有害生物多肽的生物学活性变体可以有少至约1-15个氨基酸残基、少至约1-10个、诸如约6-10个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个、或少至1个氨基酸残基的差异。在具体的实施方案中，所述多肽可以包含N末端或C末端截短，其可以包括从所述多肽的N或C末端缺失至少10、15、20、25、30、35、40、45、50个氨基酸或更多个氨基酸。

表2提供了基于PFAM数据在SEQ ID NO:1-312中发现的蛋白质结构域。结构域描述和在给定SEQ ID NO内的位置两者都在表2中提供。在特定的实施方案中，包含SEQ ID NO:1-312中任何一个的活性变体可以包含与SEQ ID NO:1-312中任何一个有至少70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且进一步包含表2中所示的保守结构域中的至少一个。例如，在一个实施方案中，活性变体包含与SEQ ID NO：1有至少70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且进一步包含270-345处的天然氨基酸。

表2.SEQ ID NO:1-312中的每一个中的PFAM结构域的概述

还提供了编码本文公开的杀有害生物多肽的重组或合成核酸。特别有兴趣的是已被设计用于在目的植物中表达的核酸序列。即，可以对核酸序列进行优化以增加在宿主植物中的表达。本发明的杀有害生物蛋白可以被反向翻译以产生包含为了在特定宿主例如作物植物中表达而优化的密码子的核酸。在另一个实施方案中，可以将编码本文提供的多肽的多核苷酸进行优化，用于增加在经转化的植物中的表达。即，多核苷酸可以使用植物偏好的密码子来合成用于提高表达。关于宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11。本领域可获得用于合成植物偏好基因的方法。参见例如通过引用并入本文的美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。通过经转化的植物(例如双子叶植物或单子叶植物)表达这种编码序列将导致产生杀有害生物多肽，并且在植物中赋予针对有害生物的增加抗性。编码本发明的杀有害生物蛋白的重组和合成核酸分子不包括编码该蛋白的天然存在的细菌序列。

“重组多核苷酸”或“重组核酸”包含两种或更多种化学连接的核酸区段的组合，所述核酸区段在自然界中未发现直接连接。“直接连接”意指两个核酸区段直接相邻并且通过化学键彼此连接。在具体的实施方案中，重组多核苷酸包含目的多核苷酸或其变体或片段，使得附加的化学连接的核酸区段位于目的多核苷酸的5’、3’或内部。备选地，重组多核苷酸的化学连接的核酸区段可以通过序列缺失而形成。额外的化学连接的核酸区段或缺失以连接所连接的核酸区段的序列可以具有任何长度，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个核苷酸。用于制备这种重组多核苷酸的各种方法包括化学合成或通过基因工程技术操作分离的多核苷酸区段。在具体的实施方案中，重组多核苷酸可以包含重组DNA序列或重组RNA序列。“重组多核苷酸或核酸的片段”包含两个或更多个化学连接的氨基酸区段的组合中的至少一个，所述区段在自然界中未发现直接连接。

多核苷酸(RNA或DNA)的片段可以编码保留活性的蛋白片段。在具体的实施方案中，重组多核苷酸或重组多核苷酸构建体的片段包含所述两个或更多个化学连接的或可操作地连接的核酸区段的至少一个连接，所述核酸区段在自然界中未发现直接连接。编码保留杀有害生物活性的多肽的生物学活性部分的多核苷酸的片段将编码如下面的SEQ ID NO所示的全长多肽中存在的至少25、30、40、50、60、70、75、80、90、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180个连续氨基酸或高达全部数目的氨基酸：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。在具体的实施方案中，此类多肽片段是活性片段，在另外的其他实施方案中，所述多肽片段包含重组多肽片段。如本文使用的，重组多肽的片段包含两个或更多个化学连接的氨基酸区段的组合中的至少一个，所述氨基酸区段在自然界中未发现直接连接。

“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点处一个或多个核苷酸的取代。如本文使用的，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。

也可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与由参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估本发明的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体。因此，例如，公开了编码与下述SEQ ID NO的多肽具有给定百分比序列同一性的多肽的分离的多核苷酸：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。任意两个多肽之间的序列同一性百分比可以使用本文其他地方所述的序列比对程序和参数来计算。当通过比较由它们编码的两种多肽共享的百分比序列同一性来评估本发明的任何给定的多核苷酸对时，两种编码多肽之间的序列同一性百分比为与下述SEQ ID NO有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同一性：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。在其他实施方案中，本文提供的多核苷酸的变体与天然序列的差别有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。

变体多核苷酸和蛋白还涵盖衍生自诱变和重组程序诸如DNA改组的序列和蛋白。使用这样的程序，操作本文公开的一种或多种不同的杀有害生物蛋白(SEQ ID NO:1-312)，以产生具有所需性质的新杀有害生物蛋白。以这种方式，由相关序列多核苷酸群体生成重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸包含具有很高序列同一性并且可在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用这种方法，编码目的结构域的序列基序可以在本文提供的杀有害生物序列和其他已知的杀有害生物基因之间改组，以获得编码具有提高的目的性质的蛋白的新基因，所述目的性质诸如在酶的情况下有增加的K_m。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。“改组”核酸是通过改组程序诸如本文所述的任何改组程序产生的核酸。通过例如以人工和任选递归的方式重组(实体地或虚拟地)两个或更多个核酸(或字符串)来产生改组的核酸。一般地，在改组过程中使用一个或多个筛选步骤来鉴定目的核酸；这个筛选步骤可以在任何重组步骤之前或之后执行。在一些(但不是全部)改组实施方案中，理想的是在选择之前执行多轮重组，以增加待筛选的库的多样性。重组和选择的整个过程任选递归地重复。根据上下文，改组可以指重组和选择的整个过程，或备选地，可以仅指整个过程的重组部分。

在一个实施方案中，提供了获得编码包含杀有害生物活性的改良多肽的多核苷酸的方法，其中所述改良多肽具有超过SEQ ID NOS:1-312中任一个的至少一种改良的性质。此类方法可包括：(a)重组多个亲本多核苷酸，以产生编码重组杀有害生物多肽的重组多核苷酸文库；(b)筛选所述文库以鉴定编码改良的重组杀有害生物多肽的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸与亲本多核苷酸相比具有改良的增强性质；(c)回收(b)中鉴定的编码所述改良的重组杀有害生物多肽的重组多核苷酸；和(d)使用步骤(c)中回收的重组多核苷酸作为重复步骤(a)中的多个亲本多核苷酸之一，重复步骤(a)、(b)和(c)。

iii.序列比较

如本文使用的，当关于所比对的氨基酸序列的特定对使用时，术语“同一性”或“百分比同一性”指氨基酸序列同一性百分比，其通过计数在比对中的相同匹配数目，并且将这样的相同匹配数目除以比对序列的长度来获得。如本文使用的，当关于所比对的氨基酸序列的特定对使用时，术语“相似性”或“百分比相似性”指从比对中的每个氨基酸对的评分矩阵获得的评分总和除以比对序列的长度。

除非另有说明，否则将通过Needleman-Wunsch全局比对和评分算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)计算同一性和相似性，如通过作为EMBOSS软件包的一部分分销的“needle”程序执行的(Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.,EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,2000,Trends in Genetics 16,(6)276—277页,可在embnet.org/resource/emboss和emboss.sourceforge.net处以及其他资源处从EMBnet获得的版本6.3.1)，使用默认缺口罚分和评分矩阵(用于蛋白质的EBLOSUM62和用于DNA的EDNAFULL)。也可以使用等效程序。“等效程序”指任何这样的序列比较程序，对于所讨论的任何两个序列，当与通过来自EMBOSS 6.3.1版的needle所生成的相应比对比较时，其生成具有相同核苷酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对。

另外的数学算法是本领域中已知的并且可以用于比较两个序列。参见例如Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中进行改动。这种算法被引入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序内。可以用BLASTN程序(针对核苷酸序列搜索的核苷酸查询)执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的杀有害生物样核酸分子同源的核苷酸序列，或用BLASTX程序(针对蛋白质序列搜索的翻译核苷酸查询)，以获得与本发明的杀有害生物核酸分子同源的蛋白序列。可以用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的杀有害生物蛋白分子同源的氨基酸序列，或用TBLASTN程序(针对翻译的核苷酸序列搜索的蛋白质查询)，以获得与本发明的杀有害生物蛋白分子同源的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述利用Gapped BLAST(缺口BLAST，在BLAST2.0中)。备选地，PSI-Blast可以用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系。参见Altschul等人(1997)，见上。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过手动检查执行。

当为达到对于该对序列可能的最高评分使用限定的氨基酸取代矩阵(例如，BLOSUM62)、缺口存在罚分和缺口延伸罚分，对两个序列就相似性评分进行比对时，它们是“最佳比对的”。氨基酸取代矩阵及其在量化两个序列之间的相似性中的用途是本领域众所周知的，并且在例如Dayhoff等人(1978)"A model of evolutionary change inproteins."在"Atlas of Protein Sequence and Structure,"Vol.5,Suppl.3(M.O.Dayhoff编),345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.和Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919中描述。BLOSUM62矩阵经常被用作序列比对方案中的默认评分取代矩阵。对于在比对的序列之一中引入单个氨基酸缺口而施加缺口存在罚分，对于***已经开放的缺口内的每个额外的空氨基酸位置施加缺口延伸罚分。由比对在每个序列上开始和结束的氨基酸位置、并且任选地通过在一个或两个序列中***一个缺口或多个缺口以便达到最高的可能评分来确定比对。尽管可以手动实现最佳比对和评分，但通过使用计算机执行的比对算法来促进该过程，所述算法例如，缺口BLAST2.0，如在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述，且在美国国家生物技术信息中心网站(National Center for Biotechnology InformationWebsite)(www.ncbi.nlm.nih.gov)上可公开获得。最佳比对(包括多重比对)可以使用例如PSI-BLAST来制备，所述PSI-BLAST可通过www.ncbi.nlm.nih.gov获得，且如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。

关于与参考序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”参考序列中的在比对中与残基配对的位置。“位置”由基于其相对于N末端的位置依次识别参考序列中的每个氨基酸的数目表示。例如，在SEQ ID NO:1中，位置1是V，位置2是F，位置3是L，等等。当测试序列与SEQ ID NO:1最佳比对时，测试序列中与在位置3处的L比对的残基被说成“对应于SEQ ID NO:1的位置3”。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、***、截短、融合等，一般而言，如通过从N末端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的数目相同。例如，在比对的测试序列中存在缺失的情况下，在缺失位点处将不存在对应于参考序列中的位置的氨基酸。当比对的参考序列中存在***时，该***将不对应于参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可以存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。

iv.抗体

还涵盖了针对本发明的多肽或其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；和美国专利号4,196,265)。这些抗体可以用在检测和分离毒素多肽的试剂盒中。因此，本公开内容提供了包含抗体的试剂盒，所述抗体与本文所述的多肽，包括例如具有下述SEQ ID NO的序列的多肽特异性结合：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

II.有害生物

本文提供的组合物和方法可用于对抗各种有害生物。“有害生物”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、原生动物病原体、动物寄生性肝吸虫等等。特别感兴趣的有害生物是昆虫害虫，特别是对农业植物造成严重损害的昆虫害虫。昆虫害虫包括选自鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)或线虫的昆虫。在非限制性实施方案中，昆虫害虫包括：西方玉米根虫，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)；秋粘虫，草地贪夜蛾；科罗拉多马铃薯甲虫，马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)；棉铃虫，美洲棉铃虫(在北美相同物种攻击棉花且被称为棉铃虫)；欧洲玉米螟，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)；黑切根虫，小地老虎；小菜蛾，小菜蛾(Plutella xylostella)；黍豆毛毛虫，大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；西南玉米螟，西南玉米螟(Diatraea grandiosella)；棉铃虫，棉铃虫(Helicoverpaarmigera，在全世界除美国外的其他地区发现)；南绿蝽象，稻绿蝽(Nezara viridula)；绿蝽象，Chinavia halaris；褐翅蝽象，褐翅蝽象(Halyomorpha halys)；和褐臭蝽，褐臭蝽(Euschistus servus)、英雄美洲蝽(Euschistus heros)(新热带褐蝽象或大豆蝽象)；红蝽(Piezodorus guildinii)(红带蝽象)；Dichelops melacanthus(无通用名)和/或Dichelops furcatus(无通用名)；蚜虫，诸如大豆蚜虫。在其他实施方案中，有害生物包含线虫，包括但不限于：根结线虫(Meloidogyne hapla)(北方根结线虫)；象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)(花生根结线虫)；和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)。

如本文使用的，术语“昆虫害虫”指昆虫和其他类似的害虫，诸如例如蜱螨亚纲的那些，包括但不限于螨和蜱。本发明的昆虫害虫包括但不限于鳞翅目昆虫，例如小蜡螟(Achoroia grisella)、西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana)、黑头长翅卷蛾(Aclerisvariana)、苹果小卷叶蛾(Adoxophyes orana)、小地老虎、棉叶波纹夜蛾(Alabamaargillacea)、秋尺蠖(Alsophila pometaria)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、桃枝麦蛾(Anarsia lineatella)、橙纹犀额蛾(Anisotasenatoria)、柞蚕(Antheraea pernyi)、大豆夜蛾、黄卷蛾属物种(Archips sp.)、带卷蛾属物种(Argyrotaenia sp.)、Athetis mindara、家蚕(Bombyx mori)、棉潜蛾(Bucculatrixthurberiella)、粉斑螟蛾(Cadra cautella)、色卷蛾属物种(Choristoneura sp.)、Cochylls hospes、苜蓿黄蝶(Colias eurytheme)、米蛾(Corcyra cephalonica)、Cydialatiferreanus、苹果蠹蛾、古月桃黄蝶(Datana integerrima)、Dendrolimus sibericus、Desmiafeneralis、甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)、黄瓜绢野螟(Diaphanianitidalis)、西南玉米螟、小蔗螟(Diatraea saccharalis)、白尺蠖蛾(Ennomossubsignaria)、墨西哥稻螟(Eoreuma loftini)、烟草粉螟(Esphestia elutella)、菩提松尺蠖(Erannis tilaria)、盐泽灯蛾(Estigmene acrea)、Eulia salubricola、Eupocoelliaambiguella、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、褐尾蠹(Euproctis chrysorrhoea)、暗缘地老虎(Euxoa messoria)、大蜡螟(Galleria mellonella)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)、黑拟蛉蛾(Harrisina americana)、亚曲叶娥(Helicoverpa subflexa)、美洲棉铃虫、烟芽夜蛾、Hemileuca oliviae、向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)、美国白蛾(Hyphantia cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、铁杉尺蠖(Lambdinafiscellaria fiscellaria)、西部铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria lugubrosa)、柳毒蛾(Leucoma salicis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、草地螟(Loxostegesticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、Macalla thyrisalis、天幕毛虫属物种(Malacosoma sp.)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、蓓带夜蛾(Mamestra configurata)、番茄天蛾(Manduca quinquemaculata)、烟草天蛾(Manduca sexta)、豆荚野螟(Marucatestulalis)、Melanchra picta、冬尺蛾(Operophtera brumata)、毒蛾属物种(Orgyiasp.)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)、春尺蠖(Paleacrita vernata)、美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes)、红棉铃虫(Pectinophora gossypiella)、加州槲蛾(Phryganidiacalifornica)、斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella)、暗脉菜粉蝶(Pieris napi)、菜粉蝶(Pieris rapae)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、Platynota flouendana、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、洋葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、小莱蛾(Plutella xylostella)、美国纹白蝶(Pontiaprotodice)、美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)、Pseudoplasia includens、杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata)、红抚天社蛾(Schizura concinna)、麦蛾(Sitotrogacerealella)、苹果小卷叶蛾(Spilonta ocellana)、斜纹夜蛾属物种(Spodoptera sp.)、松行列蛾(Thaurnstopoea pityocampa)、衣蛾(Tinsola bisselliella)、粉纹夜蛾(Trichoplusia hi)、温室结网野螟(Udea rubigalis)、Xylomyges curiails和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)。

昆虫害虫还包括选自双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目、鞘翅目的昆虫。对于主要作物来说，本发明的昆虫害虫包括但不限于：玉蜀黍：欧洲玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑切根虫；美洲棉铃虫(Helicoverpa zeae)，棉铃虫；草地贪夜蛾，秋粘虫；西南玉米螟，西南玉米螟；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫；小蔗螟，甘蔗螟虫；西方玉米根虫，例如玉米根萤叶甲；北方玉米根虫，例如长角叶甲(Diabrotica longicornis barberi)；南方玉米根虫，例如食根叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；梳爪叩甲属物种(Melanotus spp.)，线虫；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)，北方假面金龟子(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方假面金龟子(蛴螬)；日本弧丽金龟，日本金龟子；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲；玉米象虫(Sphenophorusmaidis)，玉米象虫；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米叶蚜；玉蜀黍根蚜(Anuraphismaidiradicis)，玉米根蚜；英雄美洲蝽(新热带褐蝽或豆椿象)；红蝽(红带椿象)；Dichelops melacanthus(没有通用名)；Dichelops furcatus(没有通用名)；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，高粱长蝽；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢；迁徒蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)，迁徒蚱蜢；灰地种蝇(Hylemya platura)，种蝇；美洲黍潜叶蝇(Agromyza parvicornis)，玉米斑潜叶蝇；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)，草蓟马；红火蚁(Solenopsis milesta)，盗蚁；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；高粱：玉米斑点螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地贪夜蛾，秋粘虫；美洲棉铃虫，棉铃虫；小玉米茎蛀虫，小玉米茎蛀虫；粒肤地老虎(Feltiasubterranea)，颗粒地老虎；Phyllophaga crinita，蛴螬；伪金针虫属(Eleodes)，宽胸叩头虫属(Conoderus)和Aeolus spp.，线虫；谷叶甲虫(Oulema melanopus)，谷物叶甲；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲；玉米象虫(Sphenophorus maidis)，玉米象虫；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米叶蚜；蔗黄伪毛蚜(Sipha flava)，黄甘蔗蚜虫；高粱长蝽，例如美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，高粱瘿蚊；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；小麦：美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)，粘虫；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；秋粘虫；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpuslignosellus)，小玉米茎蛀虫；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方灰地老虎；小玉米茎蛀虫(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫；谷叶甲虫(Oulema melanopus),谷叶甲虫；三叶草叶象(Hypera punctata)，三叶草叶象；南方玉米根虫，例如十一星叶假食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)；俄罗斯小麦蚜虫；麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)，绿蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；红腿蝗(Melanoplusfemurrubrum)，红腿蚱蜢；殊种蚱蜢(Melanoplus differentialis)，殊种蚱蜢；迁徒蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)，迁徒蚱蜢；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蝇；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，小麦吸浆虫；美州麦杆蝇(Meromyza americana)，麦杆蝇；麦种蝇(Hylemya coarctata)，麦种蝇；烟草褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草蓟马；麦茎蜂(Cephus cinctus)，小麦茎蜂；小麦曲叶螨(Aceria tulipae)，小麦卷叶螨；向日葵：向日葵茎象甲(Cylindrocupturus adspersus)，向日葵茎象甲；红色种子象(Smicronyx fulus)，红色向日葵种子象鼻虫；灰色种子象(Smicronyx sordidus)，灰色向日葵种子象鼻虫；向日葵食芽蛾(Suleima helianthana)，向日葵芽蛾；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵螟；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana)，向日葵籽瘿蚊；棉花：烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，烟夜蛾；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甜菜夜蛾；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，红铃虫；棉铃象鼻虫，例如，棉铃象甲(Anthonomusgrandis)；棉蚜(Aphis gossypii)，棉蚜；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉盲蝽；纹翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)，纹翅粉虱；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，牧草盲蝽；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢；殊种蚱蜢(Melanoplusdifferentialis)，殊种蚱蜢；烟蓟马(Thrips tabaci)，葱蓟马；烟草褐花蓟马(Franklinkiella fusca)，烟草蓟马；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；稻：小蔗螟(Diatraea saccharalis)，甘蔗螟虫；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋粘虫；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄肖叶甲；稻水象(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻水象甲；米象(Sitophilus oryzae)，米象；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，稻叶蝉；高粱长蝽，例如美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)；拟绿蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；大豆：大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)，大豆尺蠖；大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，黍豆毛毛虫；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)，绿夜蛾；欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑切根虫；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，甜菜夜蛾；烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，烟夜蛾；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)，墨西哥豆甲虫；桃蚜(Myzus persicae)，绿桃蚜虫；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉；拟绿蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；红腿蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢；殊种蚱蜢(Melanoplus differentialis)，殊种蚱蜢；灰地种蝇(Hylemya platura)，种蝇；大豆蓟马(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；烟蓟马(Thrips tabaci)，葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)，草莓蜘蛛螨；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二斑叶螨；大麦：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟；小地老虎(Agrotisipsilon)，黑切根虫；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜；高粱长蝽，例如美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)；拟绿蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；褐臭蝽(Euschistus servus)，褐臭蝽；Jylemya platura，种蝇；小麦瘿蚊(Mayetioladestructor)，小麦瘿蝇；麦岩螨(Petrobia latens)，棕色小麦螨；油籽油菜：甘蓝蚜(Vrevicoryne brassicae)，卷心菜蚜虫；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae)，十字花科跳甲；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)，黄条跳甲；大豆淡足跳甲(Phyllotretanemorum)，条纹萝卜跳甲；油菜露尾甲(Meligethes aeneus)，油菜甲虫；以及花粉甲虫Meligethes rufimanus、Meligethes nigrescens、Meligethes canadianus和Meligethesviridescens；马铃薯：马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，科罗拉多马铃薯甲虫。

本发明提供的方法和组合物可以有效抗半翅目，诸如草盲蝽(Lygus hesperus)、美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)、牧草盲蝽(Lygus pratensis)、长毛草盲蝽(Lygusrugulipennis Popp)、Lygus pabulinus、土豆盲蝽(Calocoris norvegicus)、泛奥盲蝽(Orthops compestris)、苹果盲蝽(Plesiocoris rugicollis)、Cyrtopeltis modestus、黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus)、白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus)、Diaphnocoris chlorinonis、Labopidicola allii、棉盲蝽(Pseudatomoscelisseriatus)、苜蓿盲蝽(Adelphocoris rapidus)、四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus)、美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus)、小长蝽(Nysius ericae)、Nysius raphanus、褐臭蝽(Euschistus servus)、稻绿蝽(Nezara viridula)、扁盾蝽属(Eurygaster)、缘蝽科(Coreidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)、谷蛾科(Tinidae)、负子蝽科(Blostomatidae)、猎蝽科(Reduviidae)和臭虫科(Cimicidae)。感兴趣的害虫还包括咖啡豆象(Araecerusfasciculatus)，咖啡豆象；大豆象(Acanthoscelides obtectus)，大豆象；蚕豆象(Bruchusrufmanus)，蚕豆象；豌豆象(Bruchus pisorum)，豌豆象；墨西哥豆象(Zabrotessubfasciatus)，墨西哥豆象；黄瓜叶甲(Diabrotica balteata)，带状黄瓜甲虫；菜豆萤叶甲(Cerotoma trifurcata)，豆叶甲；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)，墨西哥玉米根虫；黄瓜跳甲(Epitrix cucumeris)，马铃薯跳甲；甘薯跳甲(Chaetocnema confinis)，甘薯跳甲；苜蓿叶象(Hypera postica)，苜蓿象甲；苹果花象(Anthonomus quadrigibbus)，苹果象鼻虫；豆茎象(Sternechus paludatus)，豆茎象鼻虫；埃及苜蓿叶象(Hyperabrunnipennis)，埃及苜蓿象甲；谷象(Sitophilus granaries)，谷象；葡萄象(Craponiusinaequalis)，葡萄象鼻虫；玉米象(Sitophilus zeamais)，玉米象；李象(Conotrachelusnenuphar)，李象鼻虫；西印度群岛甘薯象甲(Euscepes postfaciatus)，西印度甘薯象甲；紫绒鲍角金龟(Maladera castanea)，亚洲花园甲虫；欧洲金龟(Rhizotrogus majalis)，欧洲金龟子；蔷薇刺金龟(Macrodactylus subspinosus)，玫瑰金龟子；杂拟谷盗(Triboliumconfusum)，杂拟谷盗；黑粉虫(Tenebrio obscurus)，黑粉虫；赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)，赤拟谷盗；黄粉虫(Tenebrio molitor)，黄粉虫。

线虫包括寄生线虫例如根节、孢囊和病变线虫，包括异皮线虫属物种(Heteroderaspp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)(大豆孢囊线虫)；甜菜孢囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜孢囊线虫)；禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)(禾谷孢囊线虫)；以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯孢囊线虫)。病变线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchusspp.)。

可以在早期发育阶段(例如幼虫或其他未成熟形式)对昆虫害虫测试本发明组合物的杀有害生物活性。昆虫可以在完全黑暗中在约20℃至约30℃和约30％至约70％相对湿度下饲养。生物测定可以如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6):2480-2485中所述执行。还参见本文的实验部分。

III.表达盒

可以在表达盒中提供编码本文提供的杀有害生物蛋白的多核苷酸，用于在目的生物体中表达。所述盒将包括与编码本文提供的杀有害生物多肽的多核苷酸可操作地连接的5'和3'调控序列，其允许多核苷酸的表达。所述盒可以另外含有待共转化到生物体内的至少一种另外的基因或遗传元件。当包括另外的基因或元件时，各组分可操作地连接。备选地，可以在多个表达盒上提供另外的(多个)基因或(多个)元件。这样的表达盒有多个限制性位点和/或重组位点，用于***多核苷酸以处于调控区的转录调控之下。表达盒可以另外含有选择标记基因。

表达盒将在5'-3'转录方向上包括转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的杀有害生物多核苷酸、以及在目的生物体即植物或细菌中有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。本发明的启动子能够指导或驱动编码序列在宿主细胞中的表达。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)对于宿主细胞或彼此之间可以是内源的或异源的。如本文使用的，提及序列时“异源”是源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预而在组成和/或基因组基因座中从其天然形式基本上修饰而来。如本文使用的，嵌合基因包含可操作地连接至对编码序列异源的转录起始区的编码序列。

方便的终止区可从根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒获得，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

另外的调控信号包括但不限于转录开始起始位点、操纵子、激活子、增强子、其他调控元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等等。参见例如，美国专利号5,039,523和4,853,331；EPO 0480762A2；Sambrook等人(1992)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Maniatis等人编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.),下称"Sambrook 11"；Davis等人编辑(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory Press),Cold Spring Harbor,N.Y.，以及其中引用的参考文献。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以便提供处于正确取向并且适当地正确读码框的DNA序列。为此，可以采用衔接子或接头来连接DNA片段，或者可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性、退火、再取代例如转换和颠换。

在本发明的实施中可以使用许多启动子。可以基于所需结果来选择启动子。核酸可以与组成型、诱导型、组织偏好型或其他启动子组合，用于在目的生物体中表达。参见例如，WO 99/43838以及下述美国专利号:8,575,425；7,790,846；8,147,856；8,586832；7,772,369；7,534,939；6,072,050；5,659,026；5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中所述的启动子；这些专利文献通过引用并入本文。

为了在植物中表达，组成型启动子还包括CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell 2:163-171)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3:2723-2730)。诱导型启动子包括驱动发病机制相关蛋白(PR蛋白)表达的那些启动子，所述PR蛋白在被病原体感染后被诱导。参见，例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell 4:645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116；和WO 99/43819，它们通过引用并入本文。也可以使用在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子(Marineau等人(1987)PlantMol.Biol.9:335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions2:325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977；Chen等人(1996)Plant J.10:955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.3:191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1:961-968；Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)；以及其中引用的参考文献)。

创伤诱导型启动子可以用于本发明的构建。此类创伤诱导型启动子包括pin II启动子(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan等人(1996)NatureBiotechnology 14:494-498)；wun1和wun2(美国专利号5,428,148)；win1和win2(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；系统素(McGurl等人(1992)Science 225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters 323:73-76)；MPI基因(Corderok等人(1994)Plant J.6(2):141-150)；等等，它们通过引用并入本文。

用于本发明中的组织偏好型启动子包括在下述中所阐述的那些：Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2):157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3):495-505。

叶偏好的启动子包括在下述中所阐述的那些：Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto等人(1994)PlantCell Physiol.35(5):773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3:509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；和Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590。

根偏好的启动子是已知的，并且包括下述中的那些：Hire等人(1992)PlantMol.Biol.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10):1051-1061(根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)PlantMol.Biol.14(3):433-443(根瘤土壤杆菌的甘露碱合成酶(MAS)基因；和Miao等人(1991)Plant Cell 3(1):11-22(胞质谷氨酰胺合成酶(GS))；Bogusz等人(1990)Plant Cell 2(7):633-641；Leach和Aoyagi(1991)Plant Science(Limerick)79(1):69-76(rolC和rolD)；Teeri等人(1989)EMBO J.8(2):343-350；Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772(VfENOD-GRP3基因启动子)；和Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.25(4):681-691(rolB启动子)。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。

“种子偏好型”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育过程中有活性的那些启动子，诸如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发过程中有活性的那些启动子)两者。参见Thompson等人(1989)BioEssays 10:108。种子偏好型启动子包括但不限于Cim1(细胞***素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利号6,225,529)。γ-玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于，玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩蛋白(shrunken)1、收缩蛋白2、球蛋白1等。也参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好型启动子。

为了在细菌宿主中表达，在细菌中起作用的启动子是本领域众所周知的。这样的启动子包括任一个已知的晶体蛋白基因启动子，包括本发明的任一个杀有害生物蛋白的启动子，以及对于苏云金芽孢杆菌σ因子特异性的启动子。备选地，诱变的或重组的晶体蛋白编码基因启动子可以被重组改造并且用于促进本文公开的新基因区段的表达。

表达盒还可以包含用于选择经转化的细胞的可选择标记基因。可选择标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性的基因。另外的可选择标记是已知的，并且可以使用任一个。参见例如2014年12月19日提交的美国临时申请62/094,697，和2015年7月7日提交的美国临时申请62/189,505，二者均通过引用整体并入本文中，其中公开了可以用作可选择标记的草铵膦抗性序列。参见，例如，通过引用整体并入本文的于2015年12月18日提交的国际申请号PCT/US2015/066648，其公开了可以用作可选择标记的草铵膦抗性序列。

IV.方法、宿主细胞和植物细胞

如所指出的，包含编码杀有害生物蛋白或其活性变体或片段的核苷酸序列的DNA构建体可以用于转化感兴趣的植物或感兴趣的其他生物体。用于转化的方法涉及将核苷酸构建体引入植物内。“引入”意指将核苷酸构建体以下述方式引入植物或其他宿主细胞，使得构建体进入植物细胞或宿主细胞的内部。本发明的方法不需要将核苷酸构建体引入植物或宿主细胞的特定方法，只要核苷酸构建体进入植物或宿主生物体的至少一个细胞的内部即可。用于将核苷酸构建体引入植物和其他宿主细胞内的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

所述方法产生经转化的生物体，诸如植物，包括完整植物，以及植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“经转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织意指已掺入或整合了编码本发明的至少一种杀有害生物多肽的多核苷酸的植物。要认识到其他外源或内源核酸序列或DNA片段也可以掺入该植物细胞内。土壤杆菌和生物弹道介导的转化仍然是两种主要采用的方法。然而，可以通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击、生物弹道或粒子轰击、电穿孔、二氧化硅/碳纤维、超声介导、PEG介导、磷酸钙共沉淀、聚阳离子DMSO技术、DEAE葡聚糖程序、Agro和病毒介导(花椰菜花叶病毒(Caulimoriviruses)、双生病毒(Geminiviruses)、RNA植物病毒)、脂质体介导等来执行转化。

转化方案以及用于将多肽或多核苷酸序列引入植物内的方案可以根据被靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶或双子叶植物)而变化。转化方法是本领域已知的，包括美国专利号：8,575,425；7,692,068；8,802,934；7,541,517中所述的那些；所述每一个美国专利通过引用并入本文。还参见Rakoczy-Trojanowska,M.(2002)Cell Mol BiolLett.7:849-858；Jones等人(2005)Plant Methods 1:5；Rivera等人(2012)Physics ofLife Reviews 9:308-345；Bartlett等人(2008)Plant Methods 4:1-12；Bates,G.W.(1999)Methods in Molecular Biology 111:359-366；Binns和Thomashow(1988)AnnualReviews in Microbiology 42:575-606；Christou,P.(1992)The Plant Journal 2:275-281；Christou,P.(1995)Euphytica 85:13-27；Tzfira等人(2004)TRENDS in Genetics20:375-383；Yao等人(2006)Journal of Experimental Botany 57:3737-3746；Zupan和Zambryski(1995)Plant Physiology 107:1041-1047；Jones等人(2005)Plant Methods 1:5；

转化可导致核酸稳定或瞬时掺入细胞内。“稳定转化”意指引入宿主细胞内的核苷酸构建体整合到宿主细胞的基因组内，并且能够被其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入宿主细胞内，并且不整合到宿主细胞的基因组内。

用于叶绿体转化的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Nail.Acad.Sci.USA 87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于含有可选择标记的DNA的粒子枪递送，并且通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，质体转化可以通过由核编码的和质体定向的RNA聚合酶的组织偏好表达反式激活沉默的质体携带的转基因来实现。这种系统已在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中报道。

已转化的细胞可以按照常规方式生长成植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以使这些植物生长，并且用相同的转化品系或不同品系授粉，并且鉴定所得到的具有所需表型特征的组成型表达的杂种。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子以确保已实现了所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了具有稳定整合到其基因组内的本发明的核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)的经转化的种子(也称为“转基因种子”)。

在具体的实施方案中，本文提供的序列可以被靶向宿主细胞或植物细胞的基因组内的特定位点。此类方法包括但不限于针对目的植物基因组序列设计的大范围核酸酶(meganucleases)(D’Halluin等人2013Plant Biotechnol J)；CRISPR-Cas9、TALENs和用于基因组的精确编辑的其他技术(Feng,等人Cell Research 23:1229-1232,2013,Podevin,等人Trends Biotechnology,在线发表,2013,Wei等人,J Gen Genomics,2013,Zhang等人(2013)WO 2013/026740)；Cre-lox位点特异性重组(Dale等人(1995)Plant J 7:649-659；Lyznik,等人(2007)Transgenic Plant J 1:1-9；FLP-FRT重组(Li等人(2009)PlantPhysiol 151:1087-1095)；Bxb1介导的整合(Yau等人Plant J(2011)701:147-166)；锌指介导的整合(Wright等人(2005)Plant J 44:693-705)；Cai等人(2009)Plant Mol Biol 69:699-709)；和同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)Methods Mol Biol 701:51-65)；Puchta(2002)Plant Mol Biol 48:173-182)。

本文提供的序列可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属物种(Brassicasp.)、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、甘薯、木薯(cassaya)、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、绿豆、利马豆、豌豆和黄瓜属(Curcumis)的成员，诸如黄瓜、哈密瓜和甜瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、绣球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。

如本文使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、由其可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和在植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药等。谷类意指商业种植者为了除生长或繁殖物种外的目的而生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。进一步提供了保留了本文公开的序列的经加工的植物产物或副产物，包括例如豆粕。

在另一个实施方案中，编码杀有害生物蛋白的基因可以用于转化昆虫致病生物体。这样的生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根际和/或根面(rhizoplana))的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定的环境中与野生型微生物成功竞争，提供表达杀有害生物蛋白的基因的稳定维持和表达，并且期望地提供对杀有害生物剂免于环境降解和灭活的更好保护。

这样的微生物包括古细菌、细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱菌属(Alcaligenes)。真菌包括酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是这些植物圈细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、土壤杆菌属(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenesentrophus)、木质棒状杆菌(Clavibacter xyli)和维氏固氮菌(Azotobacter vinlandir)，以及植物圈酵母物种诸如深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散假丝酵母(C.diffluens)、生防酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomycesrosues)、香气掷抱酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。

示例性的原核生物(革兰氏阴性和革兰氏阳性两者)包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)，诸如根瘤菌属；螺菌科(Spirillaceae)，诸如发光杆菌属(Photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺旋菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，诸如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真菌包括藻菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，例如酵母，诸如酵母属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；和担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，诸如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属等。

编码杀有害生物蛋白的基因可以借助于电转化、PEG诱导的转化、热休克、转导、缀合等手段引入。具体地，可以将编码杀有害生物蛋白的基因克隆到穿梭载体例如pHT3101内(Lerecius等人(1989)FEMS Microbiol.Letts.60:211-218)。含有特定杀有害生物蛋白基因的编码序列的穿梭载体pHT3101可以例如借助于电穿孔转化到根部定植的芽孢杆菌内(Lerecius等人(1989)FEMS Microbiol.Letts.60:211-218)。

可以设计表达系统使得通过将适当的信号肽融合到杀有害生物蛋白的氨基末端，使杀有害生物蛋白分泌到革兰氏阴性细菌的细胞质外。被大肠杆菌识别的信号肽包括OmpA蛋白(Ghrayeb等人(1984)EMBO J,3:2437-2442)。

杀有害生物蛋白及其活性变体可以在细菌宿主中发酵，并且可以将得到的细菌加工且以与苏云金芽孢杆菌菌株被用作杀有害生物喷雾剂的相同方式用作微生物喷雾剂。在杀有害生物蛋白由芽孢杆菌分泌的情况下，使用本领域已知的操作去除或突变分泌信号。这种突变和/或缺失防止杀有害生物蛋白在发酵过程期间分泌到生长培养基内。杀有害生物蛋白保留在细胞内，然后加工细胞以产生包封的杀有害生物蛋白。

备选地，通过将异源基因引入细胞宿主内来产生杀有害生物蛋白。异源基因的表达直接或间接地导致细胞内生产和维持杀有害生物剂。然后在将细胞施用于一种或多种靶有害生物的环境时延长细胞中产生的毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得到的产物保留了毒素的毒性。然后可以根据常规技术配制这些天然包封的杀有害生物蛋白，用于施用于靶有害生物栖息的环境例如土壤、水和植物叶子。参见，例如美国专利号6,468,523和美国公开号20050138685，以及其中引用的参考文献。在本发明中，经转化的微生物(其包括完整生物体、细胞、孢子、杀有害生物蛋白、杀有害生物组分、影响有害生物的组分、突变体、活细胞或死细胞和细胞组分，包括活细胞和死细胞以及细胞组分的混合物，并且包括破碎的细胞和细胞组分)或分离的杀有害生物蛋白可以用可接受的载体配制成杀有害生物或农业组合物，其为例如混悬剂、溶液剂、乳剂、撒粉剂、可分散颗粒剂、可湿性粉剂和可乳化浓缩物、气溶胶、浸渍颗粒剂、佐剂、可涂布糊剂，以及还包封在例如聚合物物质中。

如本文公开的，农业组合物可以包含多肽、重组多肽或其变体或片段。本文公开的农业组合物可以应用于植物的环境或栽培区域，或者应用于植物、植物部分、植物细胞或种子。

上述公开的这种组合物可以通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、进食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、UV保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体或影响植物生长的其他制剂而获得。一种或多种农业化学品，包括、但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料，可以与载体、表面活性剂或配制领域常规采用的辅料或其他组分相组合，以促进产品处理和对于特定靶有害生物的应用。合适的载体和辅料可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常采用的物质，例如天然或再生矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明的活性成分通常以组合物的形式应用，并且可以应用于待处理的作物区域、植物或种子。例如，本发明的组合物可以应用于准备在粮仓或筒仓等中贮存或者在粮仓或筒仓等中贮存期间的谷类。本发明的组合物可以与其他化合物同时或相继应用。应用本发明的活性成分或含有由本发明的细菌菌株产生的至少一种杀有害生物蛋白的本发明农业化学组合物的方法包括，但不限于，叶面施用、种子包被和土壤应用。施用次数和施用速率取决于相应有害生物的侵扰强度。

合适的表面活性剂包括、但不限于阴离子化合物，诸如例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或者这些酯的盐；脂肪醇硫酸盐诸如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐诸如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如丁基萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐诸如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子型试剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酸酯如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，这些酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇诸如2,4,7,9-四乙基-5-癸炔-4,7-二醇或乙氧基化炔二醇。阳离子表面活性剂的实例包括，例如，脂肪族单胺、二胺或多胺如乙酸盐(酯)、萘酸盐(酯)或油酸盐(酯)；或含氧的胺诸如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或多胺缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。

惰性材料的实例包括但不限于无机矿物质如高岭土、层状硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐，或植物材料诸如软木、粉状玉米芯、花生壳、稻壳和核桃壳。

本发明的组合物可以以用于直接施用的合适形式，或者作为主要组合物的浓缩物，其在施用前需要用合适量的水或其他稀释剂稀释。杀有害生物浓度将根据具体制剂的性质而变化，具体地，无论它是浓缩物还是直接使用。该组合物含有1至98％的固体或液体惰性载体，以及0至50％或0.1至50％的表面活性剂。这些组合物将以用于商业产品的标示速率施用，例如当以干燥形式时为约0.01lb-5.0lb/英亩，当以液体形式时为约0.01pts.-10pts./英亩。

在进一步的实施方案中，本文提供的组合物以及经转化的微生物和杀有害生物蛋白可以在配制前进行处理，以延长其在施用于靶有害生物的环境时的杀有害生物活性，只要预处理对该杀有害生物活性没有害处即可。这种处理可以通过化学和/或物理手段进行，只要处理不会有害地影响组合物的性质即可。化学试剂的例子包括但不限于卤化剂；醛诸如甲醛和戊二醛；抗感染药诸如苯扎氯铵；醇诸如异丙醇和乙醇；和组织固定剂诸如Bouin固定剂和Helly固定剂(参见，例如，Humason(1967)Animal Tissue Techniques(W.H.Freeman and Co.))。

在一个方面，可以通过将本文提供的杀有害生物蛋白施加到给定区域而杀死该区域内的有害生物或减少其中的有害生物数目。备选地，杀有害生物蛋白可以预防性地应用于环境区域，以预防易感有害生物的侵扰。优选地，有害生物摄取或接触杀有害生物有效量的所述多肽。“杀有害生物有效量”意指能够使至少一种有害生物死亡或明显降低有害生物生长、进食或正常生理发育的杀有害生物剂的量。此量取决于诸如下列的因素而变化：例如待防治的特定靶有害生物、特定环境、地点、植物、作物或待处理的农业地点、环境条件，以及杀有害生物有效多肽组合物的施用方法、速率、浓度、稳定性和数量。制剂或组合物也可以根据气候条件、环境考虑因素和/或施用频率和/或有害生物侵扰的严重程度而变化。

活性成分通常以组合物的形式应用，并且可以应用于待处理的作物区域、植物或种子。因此提供了用于对植物、植物细胞、种子、植物部分或栽培区域提供有效量的包含所述多肽、重组多肽或其活性变体或片段的农业组合物的方法。“有效量”是指足以杀死或防治有害生物，或者导致有害生物生长、进食或正常生理发育的显著下降的具有杀有害生物活性的蛋白质或组合物的量。数目、有害生物生长、进食或正常发育的这种下降可以包括任何统计学上显著的下降，包括例如下降约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％或更多。

例如，所述组合物可以应用于准备在粮仓或筒仓等中贮存或者在粮仓或筒仓等中贮存期间的谷类。所述组合物可以与其他化合物同时或相继应用。应用包含如本文公开的多肽、重组多肽或者其变体或片段中的至少一种的活性成分或农业化学组合物的方法包括但不限于叶面施用、种子包被和土壤施用。

提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文公开的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，以及使所述植物或其种子在侵染了所述多肽对其具有杀有害生物活性的有害生物(或易受其侵染)的田地中生长。在一些实施方案中，所述多肽具有针对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫害虫的杀有害生物活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫害虫侵扰。如本文定义的，植物的“产量”指由植物产生的生物质的质量和/或数量。“生物质”意指任何测量的植物产物。生物质产量中的增加是测量的植物产物的产量中的任何提高。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物消费的叶用蔬菜的产量。另外，增加叶生物量可以用于增加植物衍生的药物或工业产品的生产。产量增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括、但不限于与不表达所述杀有害生物序列的植物相比，产量有至少1％增加、至少3％增加、至少5％增加、至少10％增加、至少20％增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大增加。在具体方法中，由于表达本文公开的杀有害生物蛋白的植物的有害生物抗性提高，植物产量增加。杀有害生物蛋白的表达导致有害生物侵袭或进食的能力降低。

还可以用一种或多种化学组合物(包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂)处理植物。

非限制性实施方案包括：

1.一种分离的具有杀有害生物活性的多肽，其包含：

(a)包含选自由下列SEQ ID NO所示序列组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312；或

(b)包含与选自由下列SEQ ID NO所示序列组成的组的氨基酸序列具有至少表1中所示的百分比序列同一性的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

2.实施方案1所述的多肽，其中所述多肽包含下列SEQ ID NO所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

3.一种包含实施方案1或2所述的多肽的组合物。

4.实施方案2所述的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。

5.一种编码实施方案1所述的多肽的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子不是编码所述多肽的天然存在的序列。

6.实施方案5所述的重组核酸，其中所述重组核酸分子是设计用于在植物中表达的合成序列。

7.实施方案6所述的重组核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接到能够指导在植物细胞中表达的启动子。

8.实施方案5所述的重组核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接到能够指导在细菌中表达的启动子。

9.一种包含实施方案8中所述的重组核酸分子的宿主细胞。

10.实施方案9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。

11.一种DNA构建体，其包含在植物细胞中驱动表达的启动子，所述启动子与重组核酸分子可操作地连接，所述重组核酸分子包含：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含下列任一个SEQ ID NO的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312；或，

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自由下列SEQ ID NO所示序列组成的组的氨基酸序列具有至少表1中所示的百分比序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

12.实施方案11所述的DNA构建体，其中所述核苷酸序列是已被设计用于在植物中表达的合成DNA序列。

13.一种包含实施方案11所述的DNA构建体的载体。

14.一种包含实施方案11或12所述的DNA构建体或实施方案13所述的载体的宿主细胞。

15.实施方案14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。

16.一种包含实施方案15所述的宿主细胞的转基因植物。

17.一种包含实施方案10所述的宿主细胞的组合物。

18.实施方案17所述的组合物，其中所述组合物选自由下列各项组成的组：散剂、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体剂和溶液剂。

19.实施方案17所述的组合物，其中所述组合物包含按重量计约1％至约99％的所述多肽。

20.一种防治有害生物群体的方法，所述方法包括使所述群体与杀有害生物有效量的实施方案17所述的组合物接触。

21.一种杀死有害生物群体的方法，所述方法包括使所述群体与杀有害生物有效量的实施方案17所述的组合物接触。

22.一种生产具有杀有害生物活性的多肽的方法，所述方法包括在表达编码所述多肽的所述核酸分子的条件下培养实施方案9所述的宿主细胞。

23.一种在基因组中已经稳定地掺入了DNA构建体的植物，所述DNA构建体包含编码具有杀有害生物活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含下列任一个SEQ ID NO的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312；或，

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自由下列SEQ ID NO所示序列组成的组的氨基酸序列具有至少有表1中所示的百分比序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

24.实施方案23所述的植物的转基因种子。

25.一种保护植物免受昆虫害虫侵害的方法，所述方法包括在植物或其细胞中表达编码杀有害生物多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含下列任一个SEQ ID NO的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312；或，

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自由下列SEQ ID NO所示序列组成的组的氨基酸序列具有至少表1中所示的百分比序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

26.实施方案25所述的方法，其中所述植物产生具有针对鳞翅目或鞘翅目害虫的杀有害生物活性的杀有害生物多肽。

27.一种增加植物产量的方法，所述方法包括使在其基因组中稳定地掺入了DNA构建体的植物或其种子在田里生长，所述DNA构建体包含在植物中驱动表达的启动子，所述启动子与编码杀有害生物多肽的核苷酸序列可操作地连接，其中所述核苷酸序列包含：

(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含下列任一个SEQ ID NO的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312；或，

(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与选自由下列SEQ ID NO所示序列组成的组的氨基酸序列具有至少表1中所示的百分比序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312。

28.一种获得编码包含杀有害生物活性的改良多肽的多核苷酸的方法，其中所述改良多肽具有至少一种超过下列任一个SEQ ID NO的改良性质：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312，所述方法包括：

(a)重组多个包含下列SEQ ID NO的亲本多核苷酸或其活性变体或片段：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311和/或312，以产生编码重组杀有害生物多肽的重组多核苷酸的文库；

(b)筛选所述文库以鉴定编码改良的重组杀有害生物多肽的重组多核苷酸，所述重组多核苷酸与所述亲本多核苷酸相比具有改良的增强性质；

(c)回收(b)中鉴定到的编码所述改良的重组杀有害生物多肽的所述重组多核苷酸；和

(d)使用步骤(c)中回收的所述重组多核苷酸作为重复步骤(a)中的多个亲本多核苷酸之一，重复步骤(a)、(b)和(c)。

下述实施例以举例说明性而非限制性的方式提供。

实验部分

实验1.通过测序和DNA分析发现新型基因

微生物培养物在标准实验室培养基中以液体培养物生长。在DNA制备之前，使培养物生长至饱和(16至24小时)。通过去污剂裂解从细菌细胞中提取DNA，随后与二氧化硅基质结合并且用乙醇缓冲液洗涤。纯化的DNA用弱碱性水性缓冲液从二氧化硅基质中洗脱下来。

通过分光光度法测试用于测序的DNA的纯度和浓度。根据制造商的试验方案，使用Nextera XT文库制备试剂盒制备测序文库。根据Illumina HiSeq 2000系统用户指南协议，在HiSeq 2000上生成序列数据。

使用CLC Bio Assembly Cell软件包将测序读数组装成基因组草图。在组装之后，通过几种方法进行基因调用，并且分析所得到的基因序列，以鉴定杀有害生物基因的新型同系物。新型基因通过BLAST、结构域组成、以及与一组靶标杀有害生物基因的成对比对进行鉴定。这些序列的概括示于表1中。

通过PCR从细菌DNA扩增同源性搜索中鉴定的基因，并且克隆到含有框内融合的纯化标签的细菌表达载体内。克隆的基因在大肠杆菌中表达并且通过柱层析纯化。在昆虫饮食生物测定研究中评价纯化的蛋白质，以鉴定活性蛋白。

实施例2.在大肠杆菌中的异源表达

将如SEQ ID NO:1-312中所示的每个开放读码框克隆到含有麦芽糖结合蛋白(pMBP)的大肠杆菌表达载体内。将表达载体转化到BL21*RIPL内。用单菌落接种补充有羧苄青霉素的LB培养基，并且在37℃下生长过夜，使用0.5％过夜培养物，接种新鲜培养基并且在37℃下培养至对数期。使用250mM IPTG在16℃下将培养物诱导18小时。将细胞沉淀成团块并且重悬浮于补充有蛋白酶抑制剂的10mM Tris pH7.4和150mM NaCl中。通过SDS-PAGE评估蛋白质表达。

实施例3.针对鞘翅目和鳞翅目的杀有害生物活性

方法

蛋白质表达：如实施例2中所述，将如SEQ ID NO:1-312中所示的每个序列在大肠杆菌中表达。接种400mL的LB并且生长至OD 600达到0.6。培养物用0.25mM IPTG在16℃诱导过夜。将细胞离心下来，并且将细胞沉淀团块重悬浮于5mL缓冲液中。重悬浮物在冰上超声处理2分钟。

生物测定：从商业养虫室(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)购买秋粘虫(FAW)、玉米穗虫(corn ear worm，CEW)、欧洲玉米螟(ECB)、西南玉米螟(SWCB)和小菜蛾(diamond backed moth，DBM)卵。将FAW、CEW、ECB和BCW卵孵化至将在测定设置的12小时内发生羽化的时间点。将SWCB和DBM作为新生幼虫引入测定中。在含有多物种鳞翅目饮食(SOUTHLAND PRODUCTS INCORPORATED，Lake Village，AR)的24孔盘中进行测定。将超声处理的裂解产物样品涂抹于饮食表面(饮食涂层)，并且使其蒸发且浸入到饮食内。对于CEW、FAW、BCW、ECB和SWCB，将125μl超声处理的裂解产物加入饮食表面并干燥。对于DBM，将50μl1:2稀释的超声处理的裂解产物加入饮食表面。将生物测定板用平板密封膜密封，利用针孔通气。将平板在26℃、65％RH在Percival中以16:8白天:黑夜循环温育5天。评价测定中的死亡率、生长抑制和进食抑制的水平。

对于西方玉米根虫生物测定法，通过在24孔板(Cellstar，24孔，Greiner BioOne)的孔中的饮食顶部表面上分配60μl体积并且允许干燥，在昆虫生物测定中评估蛋白质构建体/裂解产物。每孔含有500μl饮食(Marrone等人，1985)。使用细尖端涂料刷在每个孔中引入十五至二十个新生幼虫，并且用膜(Viewseal，Greiner Bio One)覆盖平板。将生物测定贮存于环境温度，并且在第4天时对死亡率和/或生长/进食抑制进行评分。

对于科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)，从马铃薯叶中切下8号木塞钻孔器大小的叶盘，并且浸入蛋白质构建体/裂解产物中直至彻底湿润，置于滤盘(Millipore，玻璃纤维滤纸，13mm)的上方。将60μl dH₂O加入每个滤盘中，并且置于24孔板(Cellstar，24孔，GreinerBio One)的每个孔中。允许叶盘干燥，并且使用细尖端涂料刷在每个孔中引入五至七个一龄幼虫。将平板用膜(Viewseal，Greiner Bio One)覆盖，并且在膜的每个孔中刺穿小孔。构建体用一式四份进行评估，并且在第3天时对死亡率和叶损害进行评分。

实施例4.针对半翅目的杀有害生物活性

蛋白质表达：如实施例2中所述，将如SEQ ID NO:1-312中所示的每个序列在大肠杆菌中表达。接种400mL的LB并且生长至OD 600达到0.6。培养物用0.25mM IPTG在16℃诱导过夜。将细胞离心下来，并且将细胞沉淀团块重悬浮于5mL缓冲液中。重悬浮物在冰上超声处理2分钟。

二龄南绿蝽象(SGSB)从商业养虫室(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)获得。以超声处理的裂解产物样品与20％蔗糖的50％v/v比用于生物测定。将拉伸的石蜡膜(parafilm)用作饲养膜，以使SGSB暴露于饮食/样品混合物。将平板在25℃：21℃的16:8白天：黑夜循环于65％RH孵育5天。

对于每个样品评分死亡率。

实施例5.大豆的转化

将包含与在植物中有活性的启动子可操作连接的SEQ ID NO:1-312中的每一个或其活性变体或片段的DNA构建体克隆到转化载体内，并且引入土壤杆菌属内，如于2015年12月19日提交的美国临时申请No.62/094,782中所述，该申请通过引用整体并入本文。

接种前四天，将几个接种环的土壤杆菌划线接种到补充有合适抗生素**(壮观霉素、氯霉素和卡那霉素)的YEP*培养基的新鲜平板上。细菌在28℃在黑暗中生长两天。两天后，将几个接种环的细菌转移到在125ml锥形烧瓶中的3ml具有抗生素的YEP液体培养基内。将烧瓶置于处于28℃的旋转振荡器上以250RPM过夜。接种前一天，将2-3ml过夜培养物转移至500ml锥形烧瓶中的125ml具有抗生素的YEP内。将烧瓶置于处于28℃的旋转振荡器上以250RPM过夜。

在接种之前，在OD 620处检查细菌培养物的OD。0.8-1.0的OD指示培养物处于对数期。培养物在Oakridge管中以4000RPM离心10分钟。弃去上清液，并且将沉淀团块重悬浮于一定体积的大豆感染培养基(SI)中，以达到所需的OD。将培养物伴随定期混合保持直至需要接种。

接种前两天或三天，使用氯气将大豆种子表面灭菌。在通风橱中，将具有种子的皮氏培养皿置于盖打开的钟形罩中。将1.75ml 12N HCl缓慢加入在钟形罩内的250ml锥形烧瓶中的100ml漂白剂中。将盖立即放在钟形罩的顶部上。使种子灭菌14-16小时(过夜)。将顶部从钟形罩上移开，并且替换皮氏培养皿的盖子。然后将表面灭菌的皮氏培养皿在层流中打开约30分钟，以消散任何剩余的氯气。

将种子用无菌DI水或大豆感染培养基(SI)吸胀1-2天。将20-30粒种子在100x25mm皮氏培养皿中用液体覆盖，并且在24℃在黑暗中孵育。吸胀后，弃去没有萌发的种子。

子叶外植体在具有无菌滤纸的无菌纸板上进行加工，其中无菌滤纸采用美国专利7,473,822(通过引用并入本文)的方法使用SI培养基弄湿。

通常，每次处理接种16-20片子叶。弃去用于保持外植体的SI培养基，并且用25ml土壤杆菌属培养物(OD 620＝0.8-20)替换。在所有的外植体都浸没后，接种进行30分钟，同时对培养皿进行周期性地涡旋。30分钟后，去除土壤杆菌属培养物。

通过将一片无菌纸覆盖在大豆共培养基(SCC)上来制备共培养板。无需印迹，将接种的子叶近轴侧朝下地在滤纸上培养。每块板上可以培养约20个外植体。将板用石蜡膜密封，并且在24℃和以约120μmol m^-2s^-1(在Percival培养箱中)培养4-5天。

共培养后，将子叶在具有200mg/l头孢噻肟和特美汀的25ml大豆洗涤培养基中洗涤3次。将子叶印迹到无菌滤纸上，然后转移到大豆芽诱导培养基(SSI)。外植体的结节末端略微压入培养基内，其中远端以约45度保持高于表面。在每块板上培养不超过10个外植体。用Micropore带包裹板并且在24℃和以约120μmol m^-2s^-1在Percival中培养。

14天后将外植体转移到新鲜的SSI培养基中。弃去来自茎尖和子叶节的新芽。在相同的条件下继续芽诱导另外14天。

在芽诱导4周后，将子叶从结节端分离，并且在芽诱导区(芽垫)下面进行平行切割。将平行切割的区域放置在大豆芽伸长培养基(SSE)上，并且将外植体在24℃和以约120μmol m^-2s^-1在Percival中培养。这个步骤每两周重复一次，直至8周，只要芽继续伸长即可。

当芽达到2-3cm的长度时，将它们转移到Plantcon容器中的大豆生根培养基(SR)中，并且在相同的条件下温育2周，或者直到根达到约3-4cm的长度。这之后，将植物转移到土壤。

注意，对于大豆转化提到的所有培养基都可见于Paz等人(2010)Agrobacterium-mediated transformation of soybean and recovery of transgenic soybean plants；Plant Transformation Facility of Iowa State University中，所述参考文献通过引用整体并入本文。(参见agron-www.agron.iastate.edu/ptf/protocol/Soybean.pdf.)

实施例6.玉蜀黍的转化

玉蜀黍穗最好在授粉后8-12天收集。将胚从穗中分离出来，尺寸为0.8-1.5mm的那些胚优选用于转化。将胚以盾片侧朝上的方式接种在合适的温育培养基诸如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(1000倍原液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL原液)2,4-D)上。然而，除DN62A5S外的培养基和盐也是合适的，并且是本领域已知的。胚在黑暗中在25℃温育过夜。然而，将胚温育过夜本身并不是必要的。

将所得到的外植体转移到网格正方形(30-40个/板)，转移到渗透培养基上约30-45分钟，然后转移到光束板(参见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。设计用于在植物细胞中表达本发明的GRG蛋白的DNA构建体使用气溶胶光束加速器加速进入到植物组织内，使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所述的条件。光束照射后，将胚在渗透培养基上温育约30分钟，并且置于孵育培养基上在黑暗中在25℃过夜。为了避免过度损伤受光束照射的外植体，在转移至恢复培养基之前将它们温育至少24小时。然后将胚铺展到恢复期培养基上在25℃在黑暗中约5天，然后转移到选择培养基上。外植体在选择培养基中温育达八周，这取决于所利用的特定选择的性质和特征。选择期后，将所得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基，直至观察到成熟体细胞胚的形成。然后将得到的成熟体细胞胚置于弱光下，并且通过本领域已知的方法启动再生过程。使所得到的芽在生根培养基上生根，并且将所得到的植物转移到育苗盆中且作为转基因植物繁殖。

实施例7.针对线虫的杀有害生物活性

Heterodera glycine(大豆孢囊线虫)的体外测定

将大豆孢囊线虫分配到96孔测定板内，每孔具有100ul总体积和100个J2。如SEQID NO:1-312中任一个所示的感兴趣蛋白被分配到孔内，并且保持在室温用于评价。最后，分析含有SCN J2的96孔板的运动性。数据报告为与对照相比的％抑制率。命中被定义为大于或等于70％抑制率。

Heterodera glycine(大豆孢囊线虫)的植物上测定

如本文其他地方所述，生成表达SEQ ID NO:1-312中的一个或多个的大豆植物。3周龄的大豆切条用5000个SCN卵/植物进行接种。这种感染保持70天，然后收获用于对已在植物上发育的SCN孢囊进行计数。数据报告为与对照相比的％抑制率。命中被定义为大于或等于90％抑制率。

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(根结线虫)体外测定

将根结线虫分配到96孔测定板内，每孔具有100ul总体积和100个J2。包含SEQ IDNO:1-312中任一个的感兴趣蛋白被分配到孔内，并且保持在室温用于评价。最后，分析含有RKN J2的96孔板的运动性。数据报告为与对照相比的％抑制率。命中被定义为大于或等于70％抑制率。

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(根结线虫)植物上测定

如本文其他地方所述，生成表达SEQ ID NO:1-312中的一个或多个的大豆植物。3周龄的大豆用5000个RKN卵/植物进行接种。这种感染保持70天，然后收获用于对已在植物中发育的RKN卵进行计数。数据报告为与对照相比的％抑制率。命中被定义为大于或等于90％抑制率。

实施例8.对杀有害生物活性的额外测定

可以以多种方式测试SEQ ID NO:1-312中所示的各种多肽充当有害生物的杀有害生物剂。一种这样的方法是执行进食测定。在这样的进食测定中，将有害生物暴露于含有待测试的化合物的样品或对照样品。通常这通过将待测试的材料或这种材料的适当稀释液放置在有害生物将摄取的材料诸如人造饮食上执行。待测试的材料可以由液体、固体或浆料组成。待测试的材料可以放置在表面上，然后使其干燥。备选地，待测试的材料可以与熔化的人造饮食混合，然后分配到测定室内。测定室可以是例如杯子、盘或微量滴定板的孔。

用于刺吸式有害生物(例如蚜虫)的测定可以涉及通过分隔物(理想的是可被刺吸式昆虫的刺吸式口器刺穿的部分)使测试材料与昆虫隔开，以允许测试材料的摄取。通常将测试物质与进食刺激剂(诸如蔗糖)混合，以促进测试化合物的摄取。

其他类型的测定可以包括将测试物质显微注射到有害生物的口腔或肠内，以及转基因植物的研发，随后测试有害生物以转基因植物为食的能力。植物测试可以涉及到正常消耗的植物部分的分离，例如，附着到叶上的小笼，或者在含有昆虫的笼中分离整个植物。

测定有害生物的其他方法和途径是本领域已知的，并且可见于，例如Robertson和Preisler,编辑(1992)Pesticide bioassays with arthropods,CRC,Boca Raton,Fla中。备选地，测定通常描述于期刊Arthropod Management Tests和Journal of EconomicEntomology或通过与美国昆虫学会(Entomological Society of America)(ESA)会员的讨论。可以表达SEQ ID NO:1-312中任一个，并且用于如本文实施例3和4中所示的测定中。

实施例9.针对南绿蝽象(SGSB)的杀有害生物活性

蛋白质表达：如实施例2中所述，将SEQ ID NO:298在大肠杆菌中表达。接种400mL的LB并且生长至OD 600达到0.6。培养物用0.25mM IPTG在16℃诱导过夜。将细胞离心下来，并且将细胞沉淀团块重悬浮于5mL缓冲液中。重悬浮物在冰上超声处理2分钟。

二龄SGSB从商业养虫室(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)获得。以超声处理的裂解产物样品与20％蔗糖的50％v/v比用于生物测定。将拉伸的石蜡膜(parafilm)用作饲养膜，以使SGSB暴露于饮食/样品混合物。将平板在25℃：21℃、16:8的白天：黑夜循环于65％RH孵育5-7天。

对于每个样品评分死亡率。SEQ ID NO:298显示在孵育5天后针对南绿蝽象约30％至约60％的死亡率，在孵育7天后约50％至约70％的死亡率。结果在表3中示出。阴性对照(表达结合结构域的空载体和仅缓冲液)两者均显示死亡率为0。

表3.针对南绿蝽象的杀有害生物活性的总结

说明书中提及的所有出版物和专利申请指示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有的出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度与每个个别出版物或专利申请被特别且个别地指出通过引用并入相同。

尽管为清楚理解起见，前述发明已通过举例说明和实施例的方式较为详细地进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改。