一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
阅读说明：本技术 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法 (Toxin modification method for solving excessive enzymolysis of insecticidal toxin by insect intestinal digestive enzyme ) 是由 吴松青 张飞萍 郭雅洁 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法。其是利用PeptideCutter或荧光多肽酶活测定或多重底物质谱分析法(MSP-MS)对昆虫肠道消化酶的特异性切割位点进行测定；然后利用Swiss Model和PyMOL软件相结合筛选出位于毒素非功能区域的改造位点；最后将筛选到的多个位点同时突变为不被肠道蛋白酶识别的氨基酸。本发明改造方法能够对毒素上的多个蛋白酶切割位点同时进行准确的突变,显著的提高对靶标昆虫的杀虫活性,具有特异性强,操作简单等优点。这为农、林业害虫的生物防治以及抗性的治理提供了一条有利的途径。(The invention provides a toxin modification method for solving the problem that insecticidal toxin is excessively enzymolyzed by digestive enzyme of insect intestinal tracts. The specific cleavage site of the insect intestinal digestive enzyme is determined by PeptideCutter or fluorescence polypeptide enzyme activity determination or multiple substrate mass spectrometry (MSP-MS); then, screening a modification site in a toxin non-functional area by combining Swiss Model and PyMOL software; finally, the screened multiple sites are mutated into amino acids which are not recognized by the intestinal protease at the same time. The modification method can simultaneously and accurately mutate a plurality of protease cleavage sites on the toxin, obviously improve the insecticidal activity to target insects, and has the advantages of strong specificity, simple operation and the like. It provides a favorable way for the biological control and resistance treatment of agricultural and forestry pests.)
技术领域
本发明属于害虫的生物防治领域，具体涉及一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法。
背景技术
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前应用最为广泛的微生物杀虫剂（Adang et al.,2014）。苏云金芽胞杆菌的主要特征为在产生孢子期间能够合成晶体蛋白，这些晶体蛋白中的毒力因子为δ-内毒素，且这些毒素主要被分为两个家族包括Cry和Cyt（Höfte et al., 1989）。而原毒素需要先被特定的蛋白酶活化，产生活性片段后才能发挥杀虫毒性（Pardo-López et al., 2013）。有研究表明若Cry毒素的酶解活化步骤的效率受到影响，则会影响毒素的后续作用过程，在某些情况下昆虫肠道蛋白酶对毒素的酶解速度过快也会影响毒素的杀虫活性（De Maagd et al., 2000）。因此，明确毒素在昆虫肠道中的酶解活化效率对昆虫的生物防治具有重要的意义。
目前，为解决昆虫肠道消化酶对毒素的过度酶解而对毒素进行的改造主要思路为：通过去掉毒素上的蛋白酶切割位点从而解决蛋白酶对Cry毒素的过度酶解（Bah etal., 2004），但利用该思路改造的毒素依然存在着局限性。首先，在现有的研究中，对于毒素上的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的选择主要通过两种方法来确定，一是根据Keil建立的胰蛋白酶和糜蛋白酶的特异性识别偏好来选择突变位点，但没有考虑是否为靶标昆虫肠道蛋白酶具体的识别位点（Keil, 1992）。然而，对于不同的昆虫，其肠道中胰蛋白酶和糜蛋白酶所识别的氨基酸的效率是不同的（Zhang et al., 2011; Lightwood et al., 2000;Bah et al., 2004）。二是利用底物比色法分析昆虫中肠蛋白酶酶活性进行测定从而对突变位点进行筛选（Walters et al., 2008）。由于缺乏先进的检测蛋白酶切割位点的方法，这些突变位点虽然是昆虫肠道蛋白酶能够识别的氨基酸，但是这些位点并不都能够被蛋白酶高效切割。此外，现有的研究主要集中于对毒素上单一位点的突变，只能够解决突变位点处的过度酶解问题，而对于毒素上其他蛋白酶识别位点的切割情况没有影响（Zhang etal., 2011; Lightwood et al., 2000; Bah et al., 2004），所以单个位点突变的毒素对克服昆虫肠道蛋白酶酶解的能力是有限的，且现有的研究中突变毒素对相应靶标昆虫的毒力只提高了2-4倍（Bah et al., 2004）。因此，为克服昆虫肠道蛋白酶对毒素的过度酶解，一方面要能够准确测定靶标昆虫肠道蛋白酶的的特异性切割位点，另一方面要针对毒素上的多个特异性高效识别位点同时进行突变。本发明针对以上思路旨在提供一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法，为利用毒素对靶标昆虫进行生物防治提供新的思路和途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法。解决昆虫肠道消化酶对毒素的过度酶解现象并提高毒素的杀虫活性，本发明提供一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法，其是利用PeptideCutter或荧光多肽酶活测定或多重底物质谱分析法（MSP-MS）对昆虫肠道消化酶特异性切割位点进行测定；然后利用Swiss Model和PyMOL软件相结合筛选出位于非功能区域的改造位点，最后将筛选到的多个位点同时突变为不被识别的氨基酸。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
本发明所述昆虫包括鞘翅目、鳞翅目、双翅目、膜翅目、同翅目、半翅目、直翅目，以及线虫、螨类。优选地，所述昆虫为松墨天牛。
本发明所述的杀虫毒素为苏云金芽胞杆菌（Bt）在芽孢期产生的伴孢晶体蛋白Cry和Cyt类毒素。
本发明所述的方法主要包括以下步骤：1）昆虫肠道蛋白酶切割位点的识别；2）毒素上蛋白酶识别位点的筛选；3）毒素的分子改造。
所述的昆虫肠道蛋白酶切割位点的识别，采用PeptideCutter或荧光多肽酶活测定或多重底物质谱分析法（MSP-MS）进行测定。
所述的毒素上蛋白酶识别位点的筛选，采用Swiss Model和PyMOL软件预测相结合的方法筛选出位于毒素蛋白表面且非功能区域的蛋白酶切割位点。
所述的毒素的分子改造，其所述方法为通过生物合成或点突变方法将筛选出的位点进行分子改造。
所述的PeptideCutter软件用于获得毒素蛋白上所有潜在的蛋白酶切割位点；荧光多肽底物酶活测定用于测定昆虫肠道蛋白酶的种类和活性；多重底物质谱分析法用于识别昆虫肠道蛋白酶的特异性切割位点。
本发明所述的利用Swiss Model软件和PyMOL软件筛选出分布于毒素蛋白表面且非功能区域的蛋白酶切割位点。毒素蛋白表面且非功能区域是指除去结构域II的loop1、loop2、loop3和loopα-8，以及结构域III的β16的其他非功区域。
所述的PeptideCutter软件预测，其具体步骤为：利用PeptideCutter软件对毒素上的各种蛋白酶切割位点进行预测，从而得到相应的切割位点。
所述的荧光多肽酶活测定，其具体步骤为：在显微镜下解剖昆虫肠道组织，重悬于双蒸水中，研磨匀浆后离心，获得肠道消化酶液，再进行蛋白浓度测定。选择淬灭荧光肽底物，取一定量昆虫肠酶液和等摩尔量的淬灭荧光多肽底物加入到Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 7.5；100 mM NaCl，2 mM DTT，and 0.01% Tween-20）进行反应。同时设置抑制剂实验。在室温下，设置330 nm的激发波长和400 nm的发射波长在黑色圆底微板中运行2小时。记录每秒钟荧光单位的变化。从而明确昆虫肠道蛋白酶种类，并根据创建好的的底物模型和结合该底物模型总结出的蛋白酶特异性结合规则得到昆虫肠道蛋白酶的切割位点。
所述的多重底物质谱分析法（MSP-MS），其具体步骤为：取一定量昆虫肠酶液，加入等摩尔量的tetradecapeptides（十四肽库）在Tris-HCl buffer（50 mM，pH 7.5；100 mMNaCl，2 mM DTT）中进行反应。所有酶在室温下孵育15、60、240和1200分钟，再用浓甲酸酸化至最终pH 2.5时停止反应。采用C18 tips脱盐并用LC-MS/MS多肽测序分析。采用IceLogo软件对卵裂位点周围的氨基酸频率进行可视化后进行分析。从而明确昆虫肠道蛋白酶识别效率较高的特异性切割位点。
所述的毒素上蛋白酶识别位点的筛选，其具体步骤为：利用Swiss Model软件对毒素蛋白进行建模，并利用PyMOL软件对毒素蛋白非功能区域的蛋白酶酶切位点进行筛选获得位于其蛋白表面的位点。
所述的生物合成，根据设计好的改造毒素核酸序列由生物公司直接进行全长合成。
所述的点突变，利用点突变试剂盒对毒素上的突变位点依次进行点突变，最后获得改造毒素。
本发明获得的有益效果：
采用本发明方法改造的两个毒素都能够在体外被胰蛋白酶和松墨天牛幼虫肠道消化酶水解出有效活性片段。与原始的毒素蛋白的体外酶解比较可以看出，经过改造的毒素能够更加稳定的活化出更多的活性片段。改造后的毒素蛋白过度酶解的现象得到明显改善，且其杀虫活性也得到显著的提高，这对鞘翅目昆虫松墨天牛进行生物防治提供了一条有利的途径。
附图说明
图1A为PeptideCutter软件预测的Cry3Aa蛋白中的胰蛋白酶酶切位点。
图1B为PeptideCutter软件预测的Cry3Aa蛋白中的糜蛋白酶酶切位点。
图2为PeptideCutter软件的原理模型图。
其中表示八个结合位点的酶-底物的示意图，底物中Pn和Pm’的中间的P1和P1’之间是被切割的位点。
图3为PeptideCutter软件中胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的原理图。
其中A和B为底物模型中糜蛋白酶切割效率，当P1=Lys (A)和P1=Arg (B)时，P2（横坐标）和P1’（纵坐标）的位点氨基酸序列对胰蛋白酶酶切的抑制作用，黑色的区域表示每个P2-Lys-P1’和P2-Arg-P1’三肽序列相应的抑制作用的百分比。C为底物模型中胰蛋白酶切割效率，纵坐标为P1位点的氨基酸，横坐标为P1’位点的氨基酸。黑色区域代表每个二肽氨基酸序列被糜蛋白酶切割的百分比。
图4为松墨天牛幼虫肠道消化酶的荧光底物多肽酶活测定。
其中AEBSF为丝氨酸类蛋白酶抑制剂；E-64为半胱氨酸蛋白酶抑制剂；pepstatin-A为天（门）冬氨酸；EDTA为金属蛋白酶抑制剂。
图5为松墨天牛幼虫肠道消化酶的特异性切割位点图谱。
其中横轴上方表示各位置上容易被蛋白酶切割的氨基酸，横轴下方表示各位置上不容易被蛋白酶切割的氨基酸，p<0.05。
图6为BRC1912和BRC1913改造毒素三维结构图。
A为Cry3Aa原毒素的三维结构图，A’为BRC1912改造毒素的三维结构图。
B为Cry3Aa原毒素的三维结构图，B’为BRC1913改造毒素的三维结构图。
图7为通用载体pGEX-6P-1的质粒图谱。
图8为BRC1912和BRC1913改造毒素的SDS-PAGE图。
图9为松墨天牛幼虫肠道消化酶对BRC1912和BRC1913改造毒素的体外酶解。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案以及有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，本说明书中的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为限定本发明。
实施例1松墨天牛肠酶液的提取
首先，解剖获得20只三龄初期松墨天牛幼虫中肠并将其放入300 μL双蒸水中，置于冰上利用匀浆器进行匀浆并离心，然后取上清液并利用超滤管过滤后，滤液即为松墨天牛幼虫中肠蛋白酶液并存储于-80℃。
实施例2毒素上胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的PeptideCutter预测
利用PeptideCutter软件对Cry3Aa蛋白中的胰蛋白酶和糜蛋白酶（丝氨酸类蛋白酶）切割位点进行预测，分别获得该毒素中的胰蛋白酶和糜蛋白酶两种蛋白酶的酶切位点，其中胰蛋白酶切割位点有55个（图1A），胰蛋白酶切割位点有75个（图1B）。PeptideCutter软件的原理模型和PeptideCutter软件中胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的原理图如图2、3所示。
实施例3荧光多肽酶活测定
将获得的松墨天牛幼虫中肠蛋白酶液与等摩尔质量的荧光底物（各0.5 μM）混合物加入Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 7.5；100 mM NaCl，2 mM DTT，and 0.01% Tween-20）至总体积为150 μL。为明确中肠主要的蛋白酶种类进行抑制试验，将等体积的酶液与荧光底物的反应液中分别加入0.5 mM AEBSF，10 μM E-64，10 μM Pepstatin-A，EDTA和1% DMSO四种蛋白酶抑制剂。以上反应均在黑色96孔酶标板中进行，室温下，用BioTek酶标仪在Ex/Em=320/400nm的条件下对各反应进行2小时的荧光测定。获得的活性报告为每秒荧光单位的变化，并利用信号线性范围内的斜率计算其活性。每个反应均有三个重复。结果表明，与对照组相比，AEBSF对蛋白酶活性的抑制作用显著，E-64和EDTA次之，然后，Pepstatin-A对蛋白酶活性没有显著的抑制作用，表明松墨天牛幼虫中肠蛋白酶主要丝氨酸类蛋白酶（图4）。然后，根据创建好的的底物模型和结合该底物模型总结出的蛋白酶特异性结合规则得到昆虫肠道蛋白酶的切割位点（图2、3）。
实施例4多重底物质谱分析法（MSP-MS）
将松墨天牛幼虫中肠蛋白酶液与等摩尔质量的228十四肽（各0.5 μM）的混合物混合并加入Tris-HCl buffer（50 mM，pH 7.5；100 mM NaCl，2 mM DTT）至总体积为150 μL，并设置三个重复。然后，分别在反映了0 min、15 min和60 min后取出20 μL反应混合物，并用浓甲酸将pH调为2.5从而猝灭酶活性，未加蛋白酶的对照组样品也作相同处理。接着，样品用C18tips进行脱盐，并用Ultimate 3000 HPLC的Q-Exactive质谱仪中进行质谱测定。最后，采用IceLogo软件对切割位点周围的氨基酸频率分析后绘制可视化图谱。
结果表明底物特异性图谱显示这些酶在P1位置处主要识别并切割精氨酸（R）和赖氨酸（K），表明松墨天牛幼虫中肠主要的蛋白酶为胰蛋白酶。而糜蛋白酶在P1位点主要识别苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和亮氨酸（L），但在图谱中显示P1位点之外的其他位点存在这三种氨基酸，表明在三龄初期天牛幼虫中肠组织中糜蛋白酶的活性并不高。此外，图谱显示组氨酸（H）也是在P1位点识别较多的氨基酸，但目前尚不清楚是哪种蛋白酶的识别位点。相反地，在P1和P1’位点是脯氨酸（P）和天冬氨酸（D）时不易被松墨天牛幼虫中肠蛋白酶识别切割（图5）。
说明：通过对实施例2、实施例3和实施例4的结果进行比对，可以看出利用PeptideCutter、荧光多肽酶活测定和多重底物质谱分析法（MSP-MS）三种方法均可得到昆虫肠道酶切割位点，但是利用多重底物质谱分析法（MSP-MS）较前两种方法得到的结果更加准确，且能够获得蛋白酶对各个氨基酸的切割效率，从而为突变位点的筛选提供了更加准确的结果。
实施例5 Cry3Aa蛋白表面丝氨酸类蛋白酶切割位点的筛选
利用Swiss Model软件对Cry3Aa蛋白进行三维结构的建模，获得该蛋白的3D结构模型图。然后，利用PyMOL软件将实施例2或实施例3或实施例4中获得蛋白酶切割位点在Cry3Aa三维模型结构上进行显示，从而筛选出位于毒素非功能区域且分布于该蛋白表面的酶切位点进行突变（图6）。
实施例6 Cry3Aa毒素分子改造
将筛选到的多个切割位点同时突变为丙氨酸，分别获得BRC1912（其氨基酸序列如SEQID NO.1所示）和BRC1913基因序列（其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示），改造BRC1912和BRC1913基因序列由生物公司合成并分别克隆于通用载体pGEX-6P-1的BamHI和XohI位点上（图7）。将两种质粒分别转化入大肠杆菌BL21内，获得能够表达毒素BRC1912和毒素BRC1913的工程菌。
实施例7改造毒素的表达与纯化
将毒素BRC1912和毒素BRC1913的工程菌在LB培养基中37℃培养至对数期并加入IPTG至终浓度为0.8 nM恒温培养诱导表达蛋白，依照Glutathione Sepharose 4B GST产品说明书进行蛋白纯化（图8）。
实施例8松墨天牛幼虫肠道消化酶对改造毒素的体外酶解
在冰上取改造毒素（50 μg）与肠道消化酶液按照2:1的质量比混合，加入PBS缓冲液至总体系为100 μL，37℃孵育16 h后制样，利用SDS-PAGE和Western blot对改造毒素的酶解条带进行分析，改造毒素不会被松墨天牛幼虫肠道消化酶过度酶解且被酶解出更多的活性片段（图9）。
实施例9松墨天牛幼虫生物测定
天牛人工饲料的配方：麸皮60 g，虾粉10 g，山梨酸2 g，苯钾酸钠4 g，酵母粉25 g，琼脂30 g，松树韧皮部100 g，松树木质部50 g，蔗糖40 g，水300 mL。
生物测定方法：松墨天牛幼虫分别培养在含有0.1 g人工饲料的500 µL离心管中。每一支离心管对应一只三龄初期幼虫，分别加入150 µL不同浓度梯度的改造毒素，浓度梯度为1000，500，250，125，62.5，6.25和3.12 µg/mL，每个处理三组重复，每组10只松墨天牛幼虫（各浓度梯度测试30只）。以单蒸水作为空白对照。放置于25℃，相对湿度为75%，光照：黑暗时间为16:8 h的环境中。两周后计算幼虫死亡率。最终获得的改造毒素对松墨天牛的杀虫活性得到了显著提高。
表1 生物测定
实施例10西方玉米根叶甲生物测定
人工饲料的配方：琼脂15 g，小麦粉30 g，蔗糖38.5 g，山梨酸0.38 g，苯钾酸钠 0.76g，氯四环素 0.064 g，水 800 mL。
生物测定方法：西方玉米根叶甲幼虫分别培养在含有1 g人工饲料的3 cm无菌培养皿中，然后每个培养皿中放入10只西方玉米根叶甲幼虫，分别加入150 µL不同浓度梯度的改造毒素并混匀，最终的浓度梯度为200，100，50，25和10 µg/mL，每个处理三组重复。以单蒸水作为空白对照。放置于室温，黑暗环境中。一周后计算幼虫死亡率。最终获得的改造毒素对西方玉米根叶甲的杀虫活性得到了显著提高。
表2 生物测定
以上均为本发明的实施例，并非对本发明加以任何形式限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的情况下，利用上述说明做出改进，变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明所附权利要求保护范围内。
SEQUENCE LISTING
序 列 表
<110> 福建农林大学
<120> 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1968
<212> DNA
<213> 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）
<400> 1
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<213> 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）
<400> 2
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