阅读说明：本技术 一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用 (Insecticidal protein, nucleotide sequence and application thereof ) 是由 张�杰 曹蓓蓓 束长龙 耿丽丽 宋福平 彭琦 梁影屏 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用。本实验室从从北京百望山森林公园的土样分离得到的B4F11菌株(保藏号CGMCC NO.18611),从该菌株中得到一个1个基因的阳性克隆,通过纯化,检测,得到该蛋白编码基因共380氨基酸,如SEQ ID NO：1所示,编码基因一共1143碱基,基因序列如SEQ ID NO：2所示。将克隆得到的基因进行表达,蛋白功能验证显示该蛋白对三种稻飞虱有很强的毒杀作用,尤其是对灰飞虱。蛋白浓度为30ppm,三种稻飞虱校正死亡率均达90％,对于水稻中稻飞虱害虫的防治有很好的应用前景。(The invention relates to an insecticidal protein, a nucleotide sequence and application thereof. The laboratory obtains a positive clone of 1 gene from a B4F11 strain (with the preservation number of CGMCC NO.18611) separated from a soil sample of a Beijing Baiwangshan forest park, and obtains 380 amino acids of the protein coding gene through purification and detection, such as SEQ ID NO: 1, the total number of the encoding genes is 1143 basic groups, and the gene sequence is shown as SEQ ID NO: 2, respectively. The cloned gene is expressed, and protein function verification shows that the protein has strong poisoning effect on three rice planthoppers, particularly on the rice planthoppers. The protein concentration is 30ppm, the corrected mortality rate of three rice planthoppers reaches 90 percent, and the application prospect for preventing and controlling rice planthopper pests in rice is good.)

一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及一种对稻飞虱农业害虫具有高毒力杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质，以及该杀虫蛋白在防治稻飞虱中的应用。

背景技术

水稻是我国三大主粮作物之一，其安全生产关系着国计民生。稻飞虱是水稻上重要的刺吸式口器害虫，其主要包括灰飞虱(Laodelphax striatellus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)以及白背飞虱(Sogatella furcifera)三大类群。此类害虫属于半翅目飞虱科，主要通过刺吸式口器刺吸水稻等作物汁液，掠夺其营养物质，造成空秕率上升，千粒重下降，稻米品质降低。危害较重的是褐飞虱和白背飞虱，早稻前期以白背飞虱为主，后期以褐飞虱为主；中晚稻以褐飞虱为主。此外，稻飞虱还是水稻、玉米等禾本科作物病毒病的主要传毒介体。灰飞虱传播条纹叶枯病和黑条矮缩病，褐飞虱传播齿叶矮缩病和草状矮化病，白背飞虱传播南方黑条矮缩病。

灰飞虱以华北、华东和华中稻区发生较多，在田间以穗期为害最严重，华北地区每年发生4～5代，长江中、下游5～6代，福建7～8代。灰飞虱以若虫在华北地区杂草丛、稻桩或落叶下越冬，在浙江以若虫在麦田杂草上越冬，在福建南部各虫态皆可越冬。褐飞虱在中国北方各稻区均有分布，各虫态皆可越冬。在长江流域以南各省发生较烈，每年发生4～11代，部分地区世代重叠。白背飞虱与褐飞虱分布基本相同，以长江流域为主，以卵在自生苗和游草上越冬，每年发生3～8代，为害单季中、晚稻和双季早稻较重。

目前此类害虫的防治主要依赖于化学农药防治，如毒死蜱、吡虫啉、马拉硫磷、吡蚜酮、醚菊酯等，但是化学农药的长期滥用带来了害虫抗药性上升、农药残留、环境污染、食品安全等一系列严重后果，急需挖掘对此类害虫具有高效杀虫活性的蛋白用于生物防治以及转基因植物。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供了一种新的杀虫蛋白，对稻飞虱具有毒杀作用，且对常见的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱三种稻飞虱均有较强的毒杀作用，对于水稻的防治有较好的应用前景。

一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码上述杀虫蛋白的基因。

所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述杀虫蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用。

所述应用为将杀虫蛋白作为杀虫活性成分制作杀虫剂对稻飞虱进行杀灭。

所述应用为将表达杀虫蛋白的基因转入稻飞虱的寄主植物，使该植物表达对稻飞虱害虫的抗性。

所述害虫为灰飞虱、褐飞虱或白背飞虱。

本实验在高通量筛选与分离苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株资源的基础上，从北京百望山森林公园的土样中分离得到的B4F11菌株(保藏号CGMCCNO.18611)，该菌株在芽胞形成期产生了类椭球体状的伴胞晶体，被鉴定为苏云金芽孢杆菌。提取该菌株的晶体总蛋白，生测表明该菌株对灰飞虱具有一定的杀虫活性。从该菌株基因组中得到一个基因的阳性克隆，分析结果证明所克隆的基因为新基因，命名为Gene1，通过纯化，检测，得到该蛋白编码基因共380氨基酸，如SEQ ID NO：1所示，分子量42539.9道尔顿；编码基因一共1143碱基，具体信息如下：

Composition 434A；202C；192G；315T；0OTHER

Percentage:38.0％A；17.7％C；16.8％G；27.6％T；0.0％OTHER

编码该蛋白的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

将克隆得到的基因进行表达，蛋白功能验证显示该蛋白对三种稻飞虱均有很强的毒杀作用，尤其是对灰飞虱。蛋白浓度为30ppm，三种稻飞虱校正死亡率均达90％，对于水稻中稻飞虱害虫的防治有很好的应用前景。

菌株保藏信息：

B4F11菌种分类命名：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏日期：2019年9月23日

保藏编号：CGMCC NO.18611

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1，Rosetta菌株中诱导表达结果。

其中M的分子量marker；1，空白对照(指含有pET21b空载体)可溶性组分；2，含有杀虫基因载体(含有pET21b+Gene1载体)的可溶性组分；3，空白对照不可溶性组分；4，含有杀虫基因载体的不可溶性组分；箭头显示的是目标杀虫蛋白表达条带。

图2，纯化Gene1蛋白电泳结果

其中M的分子量marker；1，纯化的含有杀虫基因载体(含有pET21b+Gene1载体)的可溶性组分。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

1、生测体系的建立与验证

生测方法

参照Fu等报道的生测方法，并加以改进。

新的生测体系的建立在原有的生测体系的基础上，经过多点改进。首先，生测改用透明PET塑料瓶(容积50mL，瓶高69mm，直径42mm)进行，并在其瓶身一侧开6mm直径的孔，并于瓶内贴透气的医用胶带封住开孔，既能防止试虫逃逸又能为试虫的生长提供足量的空气，解决了试虫意外死亡对生测结果的影响。其次，瓶盖与瓶身可分离，可以只用瓶盖完成生测用饲料的准备。白色瓶盖，用直径30mm开孔器打孔，将双层石蜡封口膜(parafilm M，USA)拉伸4倍后罩住开孔的盖子，添加200μL人工饲料，再用拉伸的石蜡封口膜覆于人工饲料上密封，制作成饲料囊。将需替换的饲料与瓶盖一同取下，更换新的即可。整个过程可以分步骤进行，利于操作，减少试虫逃逸，极大的方便了生测实验的进行。最后，在瓶底加入2％浓度的琼脂糖凝胶，可以维持瓶内对灰飞虱适宜的湿度，只要控温良好的培养箱皆可进行灰飞虱的生测实验。

每瓶放入试虫21头，每个处理重复3次。以黑布覆盖瓶身，将瓶口朝向光源，每隔两天更换饲料。生测持续6d。

人工饲料

采用傅强等(2000)报道的，灰飞虱全纯人工饲料配方(表1)。

表中(i)浓度大于0.05mg/mL的组分直接用十万分之一天平称量；(ii)低于0.05mg/mL的组分配制10×母液；(iii)生物素，无机盐配制100×母液使用。用1mol/L NaOH溶液将饲料溶液的pH值调至6.8，容量瓶定容。最后人工饲料用一次性的Millipore微孔(0.22μm)过滤器过滤除菌，分装在2mL离心管，储存在-20℃备用。饲料配制所有试剂购自Amresco或Sigma-Aldrich。

表1.生测用灰飞虱全纯人工饲料配方

生测方法测试结果

新的生测体系的建立在原有生测体系的基础上，经过多点改进。相关改进使得先前生测对照处理组在20％上下浮动的死亡率，降至10％以下。

2、菌株B4F11分离、活性与基因组测定

Bt菌株分离

采集北京百望山森林公园土样时去除腐殖质，取土壤表皮至20cm深的土壤，约30g，放入自封袋。

Bt菌株分离采用温度筛选法。

a.将分装好的土样15g，80℃烘干5h；

b.装入50mL离心管，加入15mL无菌水，放入10颗玻璃珠，用涡旋振荡器将土样打碎混匀；

c.80℃水浴20min；

d.将土样混匀后，用无菌水稀释100倍，取100μL涂布LB固体培养基；

e.30℃培养约12小时，挑选疑似Bt菌落形态的单菌落进行纯培养；

f.1/2LB固体培养基培养36h左右，镜检是否具有伴胞晶体。

Bt菌株鉴定结果

该菌株镜检结果显示其具有伴胞晶体蛋白，属于Bt菌株，被定名为B4F11，后经保藏，保藏编号为CGMCC NO.18611。

Bt菌株晶体蛋白提取与活性筛选

a.准备90mm固体LB平板20板，每个涂布200μL菌液；

b.培养48h，用刮菌器收集菌体于50mL离心管。加入40mL预冷的超纯水洗涤菌体；

c.12000g离心5min弃上清；

d.加入40mL裂解液(50mmol/L Na₂CO₃，NaHCO₃，pH＝10)，超声50％输出功率，超3s停5s，共5min。超声后混合物于摇床上冰盒4h；

e.4℃12000g离心10min取上清；

f.加入H₂CO₃调节pH＝5.0使蛋白等电点沉淀，4℃冰箱静置过夜；

g.离心弃上清，沉淀用5mL裂解液溶解；

h.蛋白脱盐后溶液用于稻飞虱活性筛选。

Bt菌株活性筛选与鉴定结果

提取B4F11菌株晶体蛋白用于灰飞虱生测，菌株筛选结果显示该对灰飞虱有一定的杀虫活性。

B4F11基因组提取

基因组提取方法：

a.将B4F11划线接种于LB培养基上，30℃培养过夜；

b.收集菌体于1.5mL离心管中，用150μL S1充分悬浮；

c.加入100mg石英砂，组织破碎仪上破碎1min；

d.加入200μL S2充分混匀；

e.加入400μL S3，充分混匀，12000g离心10min；

f.将上层上清液转移至1.5mL离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，置于-20℃静置20min；

g.12000g离心10min弃上清；

h.70％无水乙醇清洗沉淀，室温晾干；

i.加入100μL超纯水水溶解沉淀。

各溶液配方：

S1：10mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA，1mol/L蔗糖pH＝7.0

S2：4％SDS

S3：5mol/L异硫氰酸胍，1mol/L NaAc

基因组测序

基因组经随机打断，构建文库，采用Illumina测序平台进行测序。利用SOAPdenovo对reads测序数据组装，得到Scaffold序列。基因组测序数据经过拼接后，采用GeneMark.hmmPROKARYOTIC(Version 3.2)以Bacillus thuringiensis konkukian为参考基因组，启用RBSmodel。对蛋白质编码基因进行预测。基因组草图中获取的蛋白质编码基因注释采用Blastx及NCBI非冗余数据库(Nr)进行。

基因组提取、测序及杀虫基因筛选结果

基因组拼接结果

表2基因组拼接统计

参考类型	数值
		基因组大小	6222236
Contig数量	94
		平均Contig长度	66194
最长Coting长度	685972

杀虫基因结果Blastx及NCBI非冗余数据库(Nr)比对结果

通过基因比对，发现一个可能的杀虫基因，命名为Gene1，序列见SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

3、基因克隆与表达

利用同源重组的方法将基因克隆到pET21b，将测序鉴定正确的杀虫基因的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，用于进一步蛋白表达与杀虫活性测定。

IPTG诱导表达

a.PCR检测正确的阳性克隆，用5mLLB菌液过夜，活化；

b.后加入300mLLB培养基，300μL氨苄抗生素和氯霉素，37℃，220rpm摇菌；

c.摇菌2h左右，检测OD到OD₆₀₀ 0.5-0.8之间，加入1mol/L IPTG 500μL；

d.调整温度18-20℃，转速150rpm，继续培养10-12h；

e.菌液倒入离心管中，配平，用落地式高速冷冻离心机离心8000g，10min，4℃；

f.弃上清液，加10mL 20mmol/L pH＝8.0Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，转入50mL离心管，超声破碎细胞壁(功率60％，5min，超3s，停5s)；

g.再离心，13000g，15min，4℃；

h.离心后分开，分别保留可溶组分和不可溶组分，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。

SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂

a.所用到的试剂：

浓盐酸调pH至8.8，超纯水定容至50mL，4℃保存

浓缩胶缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8)

Tris 6.1g

H₂O 40mL

浓盐酸调pH至6.8，超纯水定容至50mL，4℃保存

10％过硫酸铵

过硫酸铵 1.0g

H₂O 9.0mL

分装为0.5mL每管，-20℃保存

10％(w/v)SDS

SDS 1.0g

H₂O 8mL

68℃加热溶解，浓盐酸调pH至7.2，超纯水定容至10mL

5X电泳缓冲液

Tris 15.0g

甘氨酸 94.0g

SDS 5.0g

超纯水定容至1000mL，用时稀释5倍

染色液配方

溶液1(脱水)1L：500mL乙醇，100mL乙酸，400mL超纯水

溶液2(染色)1L：50mL乙醇，75mL乙酸，875mL超纯水

考马斯亮蓝R250：0.25g考马斯亮蓝R250，溶解于100mL 95％乙醇，滤纸过滤。

b.SDS-PAGE凝胶配方

不同浓度SDS-PAGE凝胶配方(表3)：

表3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶配方

c.制胶及电泳

按照上述配方配制分离胶，将其加入制胶器至距离上沿1.5cm，加入超纯水液封，室温下放置20min。配制浓缩胶，灌入制胶器，并***梳子。待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用80V电压，当样品至分离胶时，用150V电压。根据预染蛋白Marker条带判断适时停止电泳。

d.染色过程：

加入溶液1 50mL微波炉加热30s，置于摇床10～30min

加入溶液2 50mL+R250 200μL加热30s，置于摇床染色。

蛋白表达情况分析

用IPTG对含有Gene1基因的菌株进行诱导表达，对可溶组分和不可溶组分分别进行电泳分析，如图1所示。

镍亲和层析柱对Gene1蛋白进行纯化，脱盐后进行SDS-PAGE分析，如图2所示。

杀虫活性测定

进一步用提取蛋白并纯化进行杀虫活性初步测定，蛋白浓度为30ppm，测试结果如下。结果表明，Gene1对三种稻飞虱有较好的杀虫活性，尤其是对灰飞虱。对灰飞虱杀虫活性复筛结果显示LC₅₀为9.723μg/mL(95％置信限：7.722-13.293)。

表4-1全新Gene1基因诱导表达产物对灰飞虱的生物活性测定结果

表4-2全新Gene1基因诱导表达产物对褐飞虱的生物活性测定结果

表4-3全新Gene1基因诱导表达产物对白背飞虱的生物活性测定结果

本发明的有益效果：本发明分离克隆的Gene1基因序列及其基因表达产物能够对稻飞虱产生毒力，特别对于灰飞虱，可以通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种杀虫蛋白、其核苷酸序列及其应用

<141> 2019-10-08

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

Val Ser Asn Glu Asn Asn Thr Lys Glu Asn Leu Asn Ala Pro Leu Ile

1 5 10 15

Asn Asp Glu Glu Leu Ile Pro Asn Glu Ile Lys Ala Ser Gly Ala Arg

20 25 30

Ile Ser Phe Pro Asp Phe Asn Phe Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Cys Gly

35 40 45

Lys Tyr Ile Asp Ile Gln Asp Gly Ser Thr Ala Asn Gly Lys Ala Ala

50 55 60

Phe Gln Tyr Thr Ala Asn Asn Ser Asp Asn Gln Arg Phe Leu Ile Phe

65 70 75 80

Thr Leu Asp Asn Asn Tyr Ser Val Ile Ala Ala Lys His Ser Gly Lys

85 90 95

Val Leu Asp Val Met Asp Leu Pro Asn Phe Pro Ser Phe Pro Asp Met

100 105 110

Leu Ile Gln Tyr Asp Phe Gln Asn Gly Asp Asn Gln Lys Phe Phe Ile

115 120 125

Ala Asn Asp Gly Ala Ile Ala Val Gln Arg Thr Gly Gln Val Trp Asp

130 135 140

Val Met Asn Gly Ser Thr Lys Asp Lys Thr Pro Ile Ile Pro Tyr Asn

145 150 155 160

Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Gln Lys Phe Lys Leu Glu Pro Ser Gly Ala

165 170 175

Ala Ser Val Lys Pro Pro Gln Leu Gly Thr Leu Pro Asp Ala Pro Asp

180 185 190

Phe Arg Thr Ser Asn Leu Asn Glu Gln Leu Pro Asp Asn Thr Thr Pro

195 200 205

Val Ile Thr His Ala Thr Tyr Leu Pro Tyr Phe Met Ile Lys Asp Pro

210 215 220

Tyr Tyr Asn Ser Gln Gln Lys Met Gln Asn Ser Pro His Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Val Arg Arg Gln Tyr Trp Glu Lys Val Thr His Arg Ile Val Gly Ala

245 250 255

Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Glu Gln Thr Thr Gly Val Ser Arg Thr Asp

260 265 270

Gln Thr Ser Met Thr Glu Thr Thr Glu Ile Ser Ile Gly Ala Asp Leu

275 280 285

Gly Phe Met Phe Lys Gly Phe Ser Ala Gly Leu Ser Thr Ser Ile Thr

290 295 300

Lys Thr Leu Ser Val Thr Lys Ser Thr Ser Thr Thr Glu Ser Thr Ser

305 310 315 320

Lys Thr Glu Lys Val Lys Asp Ser Asn Pro Phe Met His Thr Ile Ala

325 330 335

Arg Ala Lys Tyr Met Leu Ile Asn Glu Tyr Tyr Val Thr Arg Ala Asn

340 345 350

Gly Gln Leu Ile Thr Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Trp Lys Val Pro Asn

355 360 365

Pro Asn Gln Thr Val Thr Arg Thr Ile Pro Arg Ser

370 375 380

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

gtgtcaaatg aaaataatac caaagaaaat ttgaatgcac ctttgataaa cgatgaggaa 60

ttaattccga atgaaattaa agctagtggt gcaagaatat cttttcctga ttttaatttt 120

tataaaatcc gtacattttg tggtaaatat attgatatac aagatggatc tactgctaac 180

ggaaaagccg cttttcaata tacagcgaac aatagtgata atcaaagatt cctaattttc 240

acccttgata ataattattc tgtaattgct gcaaagcata gcggaaaagt gctggatgtt 300

atggacttac caaatttccc aagttttcca gatatgctta tacaatacga ctttcaaaac 360

ggagataatc aaaagttttt tatagccaat gacggagcga ttgcagtaca aagaactggg 420

caggtatggg atgtaatgaa cggatcaact aaagataaaa caccaattat cccctataat 480

tattcagggt cttcaaatca aaaatttaag ctggaaccat ctggagcagc ttccgttaaa 540

ccaccacaat taggtacttt acctgatgct cctgatttca gaacaagtaa tttaaatgaa 600

caattaccgg ataacacaac accagttatt acacatgcta catacttacc ttattttatg 660

ataaaagacc catattacaa ttctcaacaa aaaatgcaaa attcaccgca ttatatctta 720

gtaagaagac aatattggga gaaggtaact cacagaatag tgggagctgg tgaatcatat 780

gaatttgaac aaacgactgg tgtctcacga acagatcaaa cttccatgac agaaacaaca 840

gaaatatcaa taggagcaga tttgggtttt atgtttaaag ggttttccgc tgggttatca 900

acatcaatta caaagacatt atccgttact aaaagtacat caaccacgga atcaacgtca 960

aaaacagaaa aagtgaagga ttcgaatcca tttatgcata caatagcacg tgcaaaatat 1020

atgttaatta acgaatacta tgtaacgcgt gcaaatggtc aattgataac atcaggggat 1080

gcagcttatt ggaaagtacc aaatccaaac caaacagtta caagaactat ccctcgatca 1140

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