具体实施方式

以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

实施例1

Vip蛋白的表达

基于如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列设计引物F1/R1(SEQ ID No.2/SEQ IDNo.3；ATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGC；CTACTTAATAGAGACATCGTAAAAATG TAC)，如SEQ IDNo.1的核苷酸序列和引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，如SEQ IDNo.1所示的核苷酸编码如SEQ ID No.4所示的蛋白(即Vip蛋白)。

以F1/R1为模板，以合成的如SEQ ID No.1所示的核苷酸为模板，进行PCR扩增，之后将扩增后的产物连接到pET28a载体上，得到pET-VIP重组质粒，然后将阳性的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选出阳性转化子BL21(DE3)/pET-VIP。

挑取BL21(DE3)/pET-VIP新鲜的菌落接种于5ml的LB液体培养基中活化8小时，然后以1％的接种量接种于装有20L已灭菌LB培养基的发酵罐中(加入1/1000的氨苄青霉素)，37℃，220rpm培养3.5h左右至OD_600nm为0.6时，加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，设定诱导温度20℃，诱导培养12h，然后于4℃下以10000g 15min的方式离心收集被诱导的菌体，菌体再用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)悬浮均匀，接下来以70％的功率对菌体进行超声破碎6min(超3s停5s)，然后4℃，10000g离心25min，分别收集上清和沉淀，其中，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)悬浮。对上清和悬浮的沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示Vip蛋白在上清(可溶性组分)中的表达量比在沉淀(不可溶性组分)中的表达可多达一倍以上，因此，以可溶性组分进行杀虫活性分析。

在活性测定前，通过BSA定量Vip蛋白的浓度。

实施例2

突变蛋白的表达

设计突变引物P-I544L(SEQ ID No.5)，从而对SEQ ID No.4进行I544L突变；设计突变引物P-W552A(SEQ ID No.6)，从而对SEQ ID No.4进行W552A突变；设计突变引物P-N624A(SEQ ID No.7)，从而对SEQ ID No.4进行N624A突变；设计突变引物P-E627A(SEQ IDNo.8)，从而对SEQ ID No.4进行E627A突变；设计突变引物P-S686R(SEQ ID No.9)，从而对SEQ ID No.4进行S686R突变；设计突变引物P-S543N/I544L(SEQ ID No.10)，从而对SEQ IDNo.4进行S543N/I544L突变；设计突变引物P-N624A/E627A(SEQ ID No.11)，从而对SEQ IDNo.4进行N624A/E627A突变。以pET-VIP质粒为模板，用超高保真聚合酶(Phusion)和上述突变引物分别进行PCR扩增，得到PCR产物，将得到的PCR产物用DPN I内切酶去除作为模板的质粒以排除后期对转化的影响，得到酶切PCR产物。酶切PCR产物纯化后转大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单斑摇菌后对菌液进行测序，分别得到阳性重组菌株DH5α/pET-VIP-I544L，DH5α/pET-VIP-W552A，DH5α/pET-VIP-N624A，DH5α/pET-VIP-E627A，DH5α/pET-VIP-S543N/I544L，DH5α/pET-VIP-N624A/E627A。其中，各个突变对应的密码子如表1所示。

以P-E627A(SEQ ID No.8)为突变引物，以pET-VIP-S543N/I544L为模板，用超高保真聚合酶(Phusion)进行PCR，从而对SEQ ID No.4进行S543N/I544L/E627A突变。将得到的PCR产物用DPN I内切酶去除作为模板的质粒以排除后期对转化的影响，得到酶切PCR产物。酶切PCR产物纯化后转大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单斑摇菌后对菌液进行测序，分别得到阳性重组菌株DH5α/pET-VIP-S543N/I544L/E627A。其中，突变对应的密码子如表1所示。

以P-S686R(SEQ ID No.9)为突变引物，以pET-VIP-S543N/I544L为模板，用超高保真聚合酶(Phusion)进行PCR，从而对SEQ ID No.4进行S543N/I544L/S686R突变。将得到的PCR产物用DPN I内切酶去除作为模板的质粒以排除后期对转化的影响，得到酶切PCR产物。酶切PCR产物纯化后转大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单斑摇菌后对菌液进行测序，分别得到阳性重组菌株DH5α/pET-VIP-S543N/I544L/S686R。其中，突变对应的密码子如表1所示。

表1

从重组菌株DH5α/pET-VIP-I544L、DH5α/pET-VIP-W552A、DH5α/pET-VIP-N624A、DH5α/pET-VIP-E627A、DH5α/pET-VIP-S543N/I544L、DH5α/pET-VIP-N624A/E627A、DH5α/pET-VIP-S543N/I544L/E627A和DH5α/pET-VIP-S543N/I544L/S686R中分别提取质粒，然后将质粒分别转化BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/pET-VIP-I544L、BL21(DE3)/pET-VIP-W552A、BL21(DE3)/pET-VIP-N624A、BL21(DE3)/pET-VIP-E627A、BL21(DE3)/pET-VIP-S543N/I544L、BL21(DE3)/pET-VIP-N624A/E627A、BL21(DE3)/pET-VIP-S543N/I544L/E627A和BL2(DE3)1/pET-VIP-S543N/I544L/S686R以用于表达突变蛋白。

以实施例1同样的方式诱导表达突变蛋白，结果显示突变蛋白在上清(可溶性组分)中的表达量比在沉淀(不可溶性组分)中的表达要多，因此，以可溶性组分进行杀虫活性分析。

同样，在活性测定前，通过BSA定量突变蛋白的浓度。

实施例3

对草地贪夜蛾杀虫活性测定

草地贪夜蛾由吉林省农业科学院植物保护研究所提供。

以20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作为空白对照；将Vip蛋白及其单位点突变蛋白的浓度依次设置为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，得到各待测蛋白样品。以用于测定Vip蛋白及其单位点突变蛋白对草地贪夜蛾的活性。

杀虫活性测定步骤：称取5g人工饲料(配方见表2)于灭菌培养皿中，加入1mL各个浓度下的待测蛋白样品或空白对照，充分混合均匀，均匀的分装于已消毒的24孔细胞培养板中，室温放置至饲料中多余水分全部蒸发；用毛笔将健康的、个体活跃的、未经取食的草地贪夜蛾初孵幼虫(孵化后12h内)拉线接入装有上述饲料的孔内，每孔1头虫铺上湿润卫生纸后盖上塑料盖，用橡皮筋捆紧，竖立放入生化培养箱中，于28℃，光周期16L:8D，相对湿度65％培养，每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结；7d后调查死虫数，结果见表2。然后计算死亡率。每个处理24头虫，重复3次。利用PoloPlus软件分析蛋白的致死中浓度(LC₅₀)。结果见表3。

表2

表3

注：“-”表示丧失活性。

以20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作为空白对照；将Vip蛋白、其双位点突变蛋白和其三位点突变蛋白的浓度依次设置为0.375μg/mL、0.75μg/mL、1.5μg/mL、3.0μg/mL、6.0μg/mL、12.0μg/mL、24μg/mL，得到各待测蛋白样品。以用于测定Vip蛋白、其双位点突变蛋白和其三位点突变蛋白对草地贪夜蛾的活性。

草地贪夜蛾的杀虫活性测定步骤同上。

结果见表4。

表4

注：*表示数值与Vip之间有显著差异，P≤0.05。

如表4所示，S543N/I544L/E627A突变蛋白是突变前活性的8.02倍，S543N/I544L/S686R突变蛋白是突变前活性的2.59倍，活性均有显著的提高。

实施例4

对棉铃虫杀虫活性测定

以20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作为空白对照；将Vip蛋白和三位点突变体蛋白S543N/I544L/S686R的浓度分别依次设置为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL、80.00μg/mL、160.00μg/mL。

称取15g人工饲料(配方见实施例3中的表1)于灭菌培养皿中，加入3mL各个浓度下的待测蛋白样品或空白对照，充分混合均匀，均匀的分装于已消毒的24孔细胞培养板中，室温放置至饲料中多余水分全部蒸发；用毛笔将健康的、未经取食的棉铃虫初孵幼虫(孵化后12h内)拉线接入装有上述饲料的孔内，每孔1头虫铺上湿润卫生纸后盖上塑料盖，用橡皮筋捆紧，竖立放入生化培养箱中，于25℃，光周期16L:8D，相对湿度30％培养，每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。7d后调查死虫数。然后计算死亡率。每个处理24头虫，重复3次。利用PoloPlus软件分析蛋白的致死中浓度(LC₅₀)，结果见表5。

表5

如表5所示，S543N/I544L/S686R突变蛋白是突变前活性的3.59倍，活性有显著的提高。

虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种蛋白在防治草地贪夜蛾和/或棉铃虫中的应用

<130> LHA2160443

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2370

<212> DNA

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

atgaacaaga ataatactaa attaagcaca agagccttac caagttttat tgattatttt 60

aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaacatgat ttttaaaacg 120

gatacaggtg gtgatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgat 180

atttctggta aattggatgg ggtgaatgga agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240

ttaaatacag aattatctaa ggaaatatta aaaattgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300

aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcgggtata tctacctaaa 360

attacctcta tgttgagtga tgtaatgaaa caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420

tacttaagta aacaattgca agagatttct gataagttgg atattattaa tgtaaatgta 480

cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcgtatc aaaggattaa atatgtgaac 540

gaaaaatttg aggaattaac ttttgctaca gaaactagtt caaaagtaaa aaaggatggc 600

tctcctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aactagcgaa aagtgtaaca 660

aaaaatgatg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720

aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcatcgg aattaattac taaagaaaat 780

gtgaaaacaa gtggcagtga ggtcggaaat gtttataact tcttaattgt attaacagct 840

ctgcaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900

attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960

aacatcctcc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga 1020

agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt gattgggttt 1080

gaaattagta atgattcaat tacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1140

tatcaagtcg ataaggattc cttatcggaa gttatttatg gtgatatgga taaattattg 1200

tgcccagatc aatctgaaca aatctattat acaaataaca tagtatttcc aaatgaatat 1260

gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg 1320

aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1380

gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatgggg tgtatatgcc gttaggtgtc 1440

atcagtgaaa catttttgac tccgattaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500

agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta 1560

agcaataaag aaactaaatt gatcgtcccg ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag 1620

aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat 1680

gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga 1740

atttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact 1800

gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa 1860

gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattaata aacgttttac tacaggaact 1920

gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980

aactttatta ttttggaaat tagtccttct gaaaagttat taagtccaga attaattaat 2040

acaaataatt ggacgagtac gggatcaact aatattagcg gtaatacact cactctttat 2100

cagggaggac gagggattct aaaacaaaac cttcaattag atagtttttc aacttataga 2160

gtgtattttt ctgtgtccgg agatgctaat gtaaggatta gaaattctag ggaagtgtta 2220

tttgaaaaaa gatatatgag cggtgctaaa gatgtttctg aaatgttcac tacaaaattt 2280

gagaaagata acttttatat agagctttct caagggaata atttatatgg tggtcctatt 2340

gtacattttt acgatgtctc tattaagtag 2370

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atgaacaaga ataatactaa attaagc 27

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctacttaata gagacatcgt aaaaatgtac 30

<210> 4

<211> 789

<212> PRT

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 4

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atattgtaga gaacgggtcc ttagaagagg acaatttaga gcc 43

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aagaggacaa tttagagccg gcgaaagcaa ataataagaa tgc 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ttcattatga agatacaaat gctaatttag aagattatca aac 43

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gaagatacaa ataataattt agctgattat caaactatta ataaacg 47

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

attaattaat acaaataatt ggacgcgtac gggatcaact aatattagcg gta 53

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

tattagcaat attgtagaga acgggaactt agaagaggac aatttagagc cgtgga 56

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ctggatatat tcattatgaa gatacaaatg ctaatttagc tgattatcaa actattaata 60

aacgtt 66