一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用
阅读说明：本技术 一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用 (Insect-resistant protein Cry1ABn39, encoding gene and application ) 是由 舍亚涛 王长海 王爱华 侯兴松 刘野 姜辉 权永刚 王晓乐 高伟德 王博涵 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种抗虫蛋白Cry1ABn39编码基因和其在转基因抗虫玉米育种领域的应用。该抗虫蛋白Cry1ABn39的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,编码基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。所述应用是编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用,在制备重组抗虫蛋白Cry1ABn39中的应用,以及抗虫蛋白Cry1ABn39在制备抗虫剂中的应用。本发明通过对抗虫蛋白的人工改造及其植物表达载体的优化增加了其在转基因材料中的表达量且不影响其原本抗虫功能和转基因玉米的其他农艺性状,因此能够更容易获得抗虫效果。(The invention provides an insect-resistant protein Cry1ABn39 encoding gene and application thereof in the field of transgenic insect-resistant corn breeding. The amino acid sequence of the insect-resistant protein Cry1ABn39 is shown as SEQ ID No.1, and the base sequence of the coding gene is shown as SEQ ID No. 2. The application is the application of the coding gene in cultivating insect-resistant transgenic corn plants, the application in preparing recombinant insect-resistant protein Cry1ABn39 and the application of insect-resistant protein Cry1ABn39 in preparing insect-resistant agents. The invention increases the expression quantity of the insect-resistant protein in transgenic materials by artificial modification of the insect-resistant protein and optimization of plant expression vectors, and does not influence the original insect-resistant function and other agronomic characters of transgenic corns, thereby being capable of more easily obtaining the insect-resistant effect.)
技术领域
本发明涉及基因工程与分子生物学技术领域，具体涉及一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌来源的Bt(Bacillus thurngiensis)杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目、同翅目、双翅目等昆虫具有高度特异的毒杀活性。目前成功克隆并被应用于转基因作物研发的这类蛋白主要包含编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的Cry类和Cyt类基因，以及编码营养期杀虫蛋白(Vip)的vip类基因。三类基因表达蛋白、抗虫机制及抗虫性不尽相同。通常认为Cry蛋白作用机制包括溶解、酶解活化、与受体结合、插入和形成孔道和离子通道等过程。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。它们的应用不仅极大的削减了粮食生产中化学农药的依赖，提升了食品安全的保障，还显著增加了农业生产的经济收入。因此，新型安全可靠的抗虫基因的挖掘和开发成为分子农业领域的研发热点。
以防治鳞翅目玉米螟虫的Cry1Ab等基因是转基因玉米的首选基因。1993年，Michael等人对Cry1Ab基因进行改造，获得Bt转基因植株，对玉米螟有很好的抗性。1993年，Koziel等通过将Cry1A(b)基因转入玉米自交系，从而获得抗虫转基因玉米。1996年，Joachim W等人将Cry1Ab进行截短修饰，转化水稻，获得转Bt 水稻，靶标害虫死亡率达100％。1998年，Cheng等人根据植物所偏爱的密码子，改造了Cry1Ab和Cry1Ac基因用农杆菌转化法转化水稻获得转基因植株，R2代虫试，5天内有100％致死率。随着基因改造技术的应用，如MON810、MON89034 等利用密码子优化的转Bt基因抗虫玉米也进入了商业生产。就交互抗性而言，研究表明：能够在表达Cry1F蛋白的转基因玉米TC1507上完成幼虫发育的Cry1F抗性欧洲玉米螟品系，与Cry1Ab和Cry9C没有交互抗性，仅对Cry1Ac有低水平的交互抗性(Pereira E J G，2008)。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成，结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合，结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。
我国对Cry1Ab杀虫蛋白基因的研究主要集中在其转基因农作物的创制方面，如：朱常香(2002)通过共转化法将含有Cry1Ab基因和Bar基因的两个质粒导入玉米自交系，2个基因共整合的频率为70％，且呈连锁遗传和表达，大部分转化植株具有较高的抗虫性。袁英等(2007)采用基因枪法将杀虫毒蛋白基因(Cry1A)导入东北春玉米自交系铁7922中，通过对后代植株的PPT筛选、分子鉴定和ELISA 法检测，证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传，且筛选出一批抗玉米螟自交系。近年来，研究表明从分子水平上对Bt基因序列进行改造和对相关调控元件进行优化能够提高基因的表达量，得到了越来越多研究者的关注。
发明内容
本发明的目的在于提出一种经人工改造的Cry1ABn39基因，其编码蛋白的 N段第一个氨基酸后面插入了46个新的氨基酸，使其在玉米细胞中有效避免了被玉米内源蛋白酶的降解。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种抗虫蛋白Cry1ABn39，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明中所述的“抗虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是害虫，例如，但不限于，鳞翅目昆虫，包括玉米螟幼虫、水稻二化螟、草地贪夜蛾等。
本发明进一步保护编码上述蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID No.2所示，该编码基因是通过以下思路设计并合成的：
1)首先根据收集的天然蛋白在玉米细胞中的表达量信息进行训练，并建立向量机算法模型，利用该模型分析模拟天然Cry1Ab蛋白在玉米叶细胞中的稳定性与其N端氨基酸组成的关系；
2)根据分析结果首先我们对Genbank上已发表的天然Cry1Ab蛋白的氨基酸序列N端第一个氨基酸后面添加了46个氨基酸的新的序列信息结构最为稳定，为SEQ ID No.1所示氨基酸序列；
3)根据SEQ ID No.1所示氨基酸序列，利用Gene Designer设计其编码基因，对于氨基酸的编码密码子采用玉米密码子偏好性进行最优先选择，再通过Gene Designer内置算法工具去除富含AT的结构域、疑似内含子结构、连续存在的重复结构域，以及其内部出现的可能会影响该基因在未来商业化应用过程中用于植物表达载体构建的常用内切酶识别位点，进行优化，优化后的基因序列见SEQ ID NO.2所示；
所述位点包括但不限于：BamHI、BsaI、BstEII、ClaI、EcoRI、EcoRV、 HindIII、HpaI、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PciI、PmeI、 PmlI、PsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、SalI、SfiI、SmaI、SpeI、SphI、 SspI、StuI、Swai、XbaI、XhoI、XmaI和XmnI酶切位点；
4)通过化学合成法对上述优化后的基因序列进行全基因合成，并插入到克隆载体中，进行保存。
本发明进一步保护一种产生抗虫蛋白Cry1ABn39的方法，包括：
获得包含上述基因的转基因宿主生物的细胞；
在允许产生抗虫蛋白质Cry1ABn39的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；
回收所述抗虫蛋白质Cry1ABn39。
本发明进一步保护上述编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用。
本发明进一步保护含有上述编码基因的表达载体。
进一步的，所述表达载体可选用商业化植物表达载体pCAMBIA3301。
本发明进一步保护携带上述载体的携带上述的载体玉米转基因愈伤组织。
本发明进一步保护上述编码基因在制备重组抗虫蛋白Cry1ABn39中的应用。
本发明进一步保护上述抗虫蛋白Cry1ABn39在制备抗虫剂中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述抗虫剂为玉米螟幼虫抗虫剂。
本发明具有如下有益效果：本发明中经人工改造的杀虫蛋白Cry1ABn39，其N段添加了46个新的氨基酸，这使其在玉米细胞中的结构稳定性大大加强，避免了其被玉米内源蛋白酶的降解，因此能够在玉米细胞中获得更高的表达量。且通过抗虫实验我们发现，该改造后的蛋白与天然蛋白对玉米螟幼虫的杀虫毒性方面无显著差异；
本发明通过对玉米内源蛋白氨基酸序列与表达量关系的向量机算法模型的建立蛋白进行改造，通过分析Cry1Ab蛋白在其转基因植物中稳定性以及预测N端序列改造方案，结合蛋白杀虫毒力分析实验结果与玉米转基因植株群体蛋白含量分析等多种不同层次上的系统实验，实现对天然Cry1Ab蛋白的合理设计，获得不降低其杀虫毒性但可以更有效在转基因玉米叶片细胞中积累的新型杀虫蛋白 Cry1ABn39蛋白，使得转基因玉米材料中获得更高的杀虫蛋白积累，对抗害虫抗性的提升。
本发明通过对抗虫蛋白的人工改造及其植物表达载体的优化增加了其在转基因材料中的表达量且不影响其原本抗虫功能和转基因玉米的其他农艺性状，因此能够更容易获得抗虫效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为植物表达载体示意图；
图2为蛋白改造对转基因植株中总蛋白含量的影响图；
图3为蛋白改造对除草剂抗性蛋白在其转基因植株中表达量的影响图；
图4为蛋白改造对抗虫蛋白在其转基因植株中表达量的影响图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：抗虫蛋白Cry1Ab的N端改造
1)利用玉米叶片组织细胞天然蛋白表达量与氨基酸序列组成关系模型建立的向量机算法模型对天然Cry1Ab蛋白在玉米叶细胞中的稳定性与其N端氨基酸组成的关系用python的开发环境下用机器学习预测，将收集自Genbank数据库中天然氨基酸表达量与其N端氨基酸的关系进行必要库的建立，我们将预测变量(解释变量)数据和输出(因变量)数据拆分为训练数据集和测试数据集，建立一个线性回归模型。利用该线性回归模型预测并获得可显著提高其蛋白表达量的N端人工设计序列；
2)穷举法产生大概1000条人工序列模拟天然Cry1Ab蛋白N端第一个氨基酸 (甲硫氨酸)后面插入15-60个随机氨基酸对Cry1Ab蛋白在玉米叶肉细胞中异源表达水平的变化趋势，根据表达量预测得分高低进行排序，共计获得3个可能对 Cry1Ab蛋白表达具有显著提高的氨基酸序列，分别是N10、N39和N121。
其中，N10氨基酸序列，如SEQ NO.3所示；
N39氨基酸序列，如SEQ NO.4所示；
N121氨基酸序列，如SEQ NO.3所示。
实施例2：改造后抗虫蛋白的抗虫性能分析
1)利用大肠杆菌原核表达系统将融合N10、N39和N121三种氨基酸序列 Cry1Ab蛋白及野生型Cry1Ab蛋白进行原核表达，蛋白表达产物经葡聚糖凝胶 Sephadex G-200凝胶柱层析纯化后，对玉米螟的毒力测定。
2)称量5g亚洲玉米螟人工饲料，置于培养皿中，把饲料切成1-2mm薄片，将其置于50ng/ul蛋白液体中浸润2h。每培养皿中接入10头孵化24小时的玉米螟幼虫。试验以相同体积的蒸馏水为对照。每个处理设置5个重复。放置在温度28℃、光周期16h:8h(L:D)、相对湿度80％的人工气候培养箱中培养。调查并记录存活幼虫数量。结果如表1所示，融合N10和N121两种氨基酸序列Cry1Ab蛋白，都会减弱Cry1Ab蛋白对玉米螟幼虫的毒性。预测的氨基酸序列中仅N39对Cry1Ab蛋白的毒性不会减弱。
表1：对玉米螟幼虫的毒性
实施例3：新型抗虫蛋白Cry1Ab蛋白的编码基因的合成
根据向量机模拟结果及对改造后蛋白的玉米螟幼虫毒力检测实验结果分析，最终确定人工设计的新型抗虫蛋白Cry1Ab蛋白即在天然蛋白的第一个氨基酸(甲硫氨酸)后面添加45个氨基酸的N39序列的新的人工杀虫蛋白Cry1ABn39(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)；
根据SEQ ID No.1所示氨基酸序列，利用Gene Designer设计其编码基因，对于氨基酸的编码密码子采用玉米密码子偏好性进行最优先选择，再通过Gene Designer内置算法工具去除富含AT的结构域、疑似内含子结构、连续存在的重复结构域，以及其内部出现的可能会影响该基因在未来商业化应用过程中用于植物表达载体构建的常用内切酶识别位点如：BamHI、BsaI、BstEII、ClaI、EcoRI、EcoRV、 HindIII、HpaI、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PciI、PmeI、 PmlI、PsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、SalI、SfiI、SmaI、SpeI、SphI、 SspI、StuI、Swai、XbaI、XhoI、XmaI和XmnI酶切位点，优化后的基因序列见SEQ ID NO.2所示；
通过化学合成法将上述基因序列进行全基因合成，并插入到克隆载体中，进行保存。
实施例4：两种杀虫蛋白Cry1Ab和Cry1ABn39在玉米转基因植株中的表达差异分析
1)为评价两种蛋白的转基因玉米植株中表达差异，采用相同的植物表达载体骨架，即商业化植物表达载体pCAMBIA3301作为统一评测使用。利用限制性内切酶NcoI和BstEII对两者进行消化处理，释放原本载体中的报告基因GUS基因，并通过在扩增引物5’端添加限制性内切酶识别位点的方式，将相同内切酶识别位点添加到Cry1Ab和Cry1ABn39蛋白的编码基因两端，分别用限制性内切酶消化处理使其产生的粘性末端连入到去除GUS基因的商业化植物表达载体 pCAMBIA3301中，成功构建植物表达载体pCAMBIA3301-Cry1Ab和pCAMBIA3301-Cry1ABn39，载体结构示意图见图1。
2)利用冻融法将上述植物表达载体转化到农杆菌EHA105中，侵染作为植物受体材料的玉米幼胚，侵染后的玉米幼胚在黑暗环境中共培养3天，转入抑菌培养基培养7天，再经过35mg/L草铵膦抗性筛选产生抗性愈伤组织后，对愈伤组织进行分化，经PCR检测为阳性的植株即两种杀虫蛋白Cry1Ab和Cry1ABn39的玉米转基因植株。
3)取野生型玉米植株20株作为对照组，获得的Cry1Ab转基因玉米植株37株，Cry1ABn39转基因玉米植株44株作为两个实验组，每株0.05g叶片，3个重复，在液氮中研磨成粉末，按1:3(W/V)比例加入PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/L KH2PO4)，冰浴至完全融化。涡旋30 sec；在4℃条件下15000g离心20min，取上清即为总可溶性蛋白。利用考马斯亮蓝染色法对上述蛋白进行定量检测，分析不同杀虫蛋白的转基因植株叶片中总蛋白含量变化，结果如图2所示，转基因植株叶片中总蛋白含量与野生型之间没有显著差异。
4)利用商业化的PPT蛋白小鼠单克隆抗体对bar基因表达量分析结果如图3可知，抗虫蛋白的改造对抗除草剂基因(同时也是筛选标记基因)没有显著影响。利用商业化的Cry1Ab蛋白C端抗原决定簇的小鼠单克隆抗体进行Elisa检测，确定其中抗虫蛋白含量，结果如图4所示，经改造的抗虫蛋白Cry1ABn39的44个转基因玉米植株种抗虫蛋白的表达水平显著高于未改造的抗虫蛋白Cry1Ab的37个转基因植株。
与现有技术相比，本发明提供了一种经人工改造的杀虫蛋白Cry1ABn39，其N段第一个氨基酸后面插入了45个新的氨基酸序列，这使得改造后的蛋白不容易被玉米细胞中的内源蛋白酶识别和降解，从而保证了其表达产物能够在玉米细胞中积累，因此更容易获得高表达的转基因玉米材料。通过对该蛋白与未改造的Cry1Ab蛋白的体外抗虫实验发现，两者对玉米螟幼虫的杀虫毒性方面无显著差异。因此，更容易在玉米叶片细胞中积累的Cry1ABn39蛋白的转基因玉米显然更容易获得抗虫优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 2603
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 2
ccatggcccc ggcggtgatg gcctcctccg ccaccacggt ggccccgttc caggggctga 60
agtccaccgc cggcctgccg atctcctgcc gctccggctc caccggcctg tcctccgtgt 120
ccaacggcgg caggatcagg tgcgacaaca acccaaacat caacgagtgc atcccgtaca 180
actgcctctc taacccggag gtcgaggtgc tcggcggtga gcgcatcgaa accgggtaca 240
cccccatcga catctccctc tccctcacgc agttcctgct cagcgagttc gtgccaggcg 300
ctggcttcgt cctgggcctc gtggacatca tctggggcat ctttggcccc tcccagtggg 360
acgccttcct ggtgcaaatc gagcagctca tcaaccagag gatcgaggag ttcgccagga 420
accaggccat cagcaggctg gagggcctca gcaacctcta ccaaatctac gctgagagct 480
tccgcgagtg ggaggccgac ccgactaacc cagctctccg cgaggagatg cgcatccagt 540
tcaacgacat gaacagcgcc ctgaccaccg ccatcccact cttcgccgtc cagaactacc 600
aagtcccgct cctgtccgtg tacgtccagg ccgccaacct gcacctcagc gtgctgaggg 660
acgtcagcgt gtttggccag aggtggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca 720
acgacctcac caggctgatc ggcaactaca ccgaccacgc tgtccgctgg tacaacacgg 780
gcctggagcg cgtctggggc ccggattcta gggactggat tcgctacaac cagttcaggc 840
gcgagctgac cctcaccgtc ctggacattg tgtccctctt cccgaactac gactcccgca 900
cctacccgat ccgcaccgtg tcccaactga cccgcgaaat ctacaccaac cccgtcctgg 960
agaacttcga cggtagcttc aggggcagcg cccagggcat cgagggctcc atcaggagcc 1020
cacacctgat ggacatcctc aacagcatca ccatctacac cgatgcccac aggggcgagt 1080
actactggag cggccaccag atcatggcgt ccccggtcgg cttcagcggc ccggagttta 1140
cctttcctct ctacggcacg atgggcaacg ccgctccaca acaacgcatc gtcgcccagc 1200
tcgggcaggg cgtctaccgc accctgtcct ccaccctgta ccgcaggccg ttcaacatcg 1260
gtatcaacaa ccagcagctc tccgtcctgg atggcactga gttcgcctac ggcacctcct 1320
ccaacctgcc ctccgctgtc taccgcaaga gcggcacggt ggattccctg gacgagatcc 1380
caccacagaa caacaatgtg ccaccgaggc agggtttttc ccacaggctc agccacgtca 1440
gcatgttccg ctccggcttc agcaactcct ccgtgagcat catcagggcc ccgatgttct 1500
cctggattca tcgcagcgcg gagttcaaca atatcattcc gtcctcccaa atcacccaaa 1560
tccccctcac caagtccacc aacctgggca gcggcacctc cgtggtgaag ggcccaggct 1620
tcacgggcgg cgacatcctg cgccgcacct ccccaggcca gatcagcacc ctccgcgtca 1680
acatcaccgc tcccctgtcc cagaggtatc gcgtcaggat tcgctacgcg agcaccacca 1740
acctgcaatt ccacacctcc atcgacggca ggccgatcaa tcagggtaac ttctccgcca 1800
ccatgtccag cggcagcaac ctccaatccg gcagcttccg caccgtgggt ttcaccaccc 1860
ccttcaactt ctccaacggc tccagcgttt tcaccctgag cgcccacgtc ttcaattccg 1920
gcaatgaggt gtacattgac cgcattgagt tcgtcccagc cgaggtgacg ttcgaagccg 1980
agtacgacct ggagagggcg caaaaggctg tcaatgagct gttcacgtcc agcaatcaga 2040
tcgggctgaa gaccgacgtg actgactacc acatcgacca agtctccaac ctcgtggagt 2100
gcctctccga tgagttctgc ctcgacgaga agaaggagct gtccgagaag gtgaagcacg 2160
ccaagaggct cagcgacgag aggaatctcc tccaggaccc caatttcagg ggcatcaaca 2220
ggcagctcga caggggctgg cgcggcagca ccgacatcac gatccagggc ggcgacgatg 2280
tgttcaagga gaactacgtg actctcctgg gcactttcga cgagtgctac ccaacctact 2340
tgtaccagaa gatcgacgag tccaagctca aggcttacac tcgctaccag ctcaggggct 2400
acatcgaaga cagccaagac ctggagattt acctgatccg ctacaacgcc aagcacgaaa 2460
ccgtcaacgt gcccggtact ggttccctct ggccgctgag cgcccccagc ccgattggca 2520
agtgtgccca ccacagccac cacttctccc tggacatcga cgtgggctgc accgacctga 2580
acgaggactt tcggtaggtg acc 2603
<210> 3
<211> 864
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 3
Met Ala Pro Ala Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe
1 5 10 15
Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Leu Pro Ile Ser Cys Arg Ser Gly
20 25 30
Ser Thr Gly Leu Ser Ser Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Asp
35 40 45
Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn
50 55 60
Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly Tyr Thr
65 70 75 80
Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser Glu Phe
85 90 95
Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile Trp Gly
100 105 110
Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln
115 120 125
Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser
130 135 140
Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe
145 150 155 160
Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met
165 170 175
Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro
180 185 190
Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val
195 200 205
Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe
210 215 220
Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn
225 230 235 240
Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val Arg Trp
245 250 255
Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp Trp
260 265 270
Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp
275 280 285
Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Ile Arg
290 295 300
Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu
305 310 315 320
Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu Gly Ser
325 330 335
Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr
340 345 350
Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln Ile Met
355 360 365
Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr
370 375 380
Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu
385 390 395 400
Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro
405 410 415
Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr
420 425 430
Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg
435 440 445
Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn
450 455 460
Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser
465 470 475 480
Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala
485 490 495
Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile
500 505 510
Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr Asn Leu
515 520 525
Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp
530 535 540
Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg Val Asn
545 550 555 560
Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala
565 570 575
Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg Pro Ile
580 585 590
Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gln
595 600 605
Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser
610 615 620
Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn Ser Gly
625 630 635 640
Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu Val Thr
645 650 655
Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Glu
660 665 670
Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp
675 680 685
Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu
690 695 700
Phe Cys Leu Asp Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala
705 710 715 720
Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg
725 730 735
Gly Ile Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile
740 745 750
Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu
755 760 765
Leu Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile
770 775 780
Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg Gly Tyr
785 790 795 800
Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala
805 810 815
Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu
820 825 830
Ser Ala Pro Ser Pro Ile Gly Lys Cys Ala His His Ser His His Phe
835 840 845
Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Phe Arg
850 855 860
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 3
Ser Thr Ala Ser Pro Ala Pro Thr Leu Lys Thr Ile Arg Cys Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Val Ser Thr Thr Ala Arg Val Ala Pro Phe Ala Gly Arg Lys
20 25 30
Asn Met Ala Ser Leu Val Gly Arg
35 40
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 4
Ala Pro Thr Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Ala Val Ala Pro Phe Gln
1 5 10 15
Gly Leu Lys Ser Thr Ala Thr Leu Pro Val Ala Arg Arg Ser Thr Thr
20 25 30
Ser Leu Ala Lys Val Ser Asn Gly
35 40
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 5
Ala Thr Leu Ala Thr Ala Val Pro Val Ala Phe Gln Gly Arg Thr Lys
1 5 10 15
Thr Ile Arg Cys Thr Val Ser Thr Ala Pro Lys Thr Leu Ala Lys Val
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Ser Pro Thr Ala Val Ala Pro Ala Gly Arg Lys Asn
35 40 45
Ala Ser Val Gly Arg Ser Thr Ser Ala Pro
50 55
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