阅读说明：本技术 抗根癌病的靶基因片段及其干扰载体和应用 (Target gene segment for resisting root cancer, interference vector and application thereof ) 是由 齐希梁 李明 刘聪利 宋露露 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗根癌病的靶基因片段及其干扰载体和应用。本发明通过病毒诱导的基因沉默技术将18段樱桃根瘤病菌的iaaM、iaaH和ipt的靶标片段及其基因融合靶标片段导入樱桃砧木‘ZY-1’中,发现导入18段靶基因片段的樱桃砧木的抗病性都显著提高,其中有5段靶标片段的抗病性极显著提高,达到高抗水平以上甚至免疫；本发明进一步将这5段靶基因序列构建稳定遗传干扰载体转化樱桃砧木,发现转基因樱桃植物对根癌土壤杆菌抗病性显著增强,达到高抗水平以上。应用本发明所提供的抗根癌病的靶基因片段能够提高果树对根癌病的抗性或进一步培育获得抗根癌病的果树新种质。(The invention discloses a target gene segment for resisting root cancer, an interference vector and application thereof. According to the invention, 18 target segments of iaaM, iaaH and ipt of cherry rhizobium and gene fusion target segments thereof are introduced into cherry rootstocks 'ZY-1' by a virus-induced gene silencing technology, and the disease resistance of the cherry rootstocks introduced with 18 target gene segments is remarkably improved, wherein the disease resistance of 5 target segments is remarkably improved, so that the effect of resisting water at a high level or above and even immunity is achieved; the invention further constructs a stable genetic interference vector for transforming the 5 target gene sequences into the cherry rootstocks, and finds that the disease resistance of the transgenic cherry plants to the agrobacterium tumefaciens is obviously enhanced to reach a high water level or above. The target gene segment for resisting the root cancer disease provided by the invention can improve the resistance of fruit trees to the root cancer disease or further culture and obtain new germplasm of the fruit trees for resisting the root cancer disease.)

抗根癌病的靶基因片段及其干扰载体和应用

技术领域

本发明涉及抗根癌病的靶基因片段，本发明进一步涉及含有这些靶基因片段的干扰载体以及在提高果树对根癌土壤杆菌抗性中的应用，属于抗根癌病的靶基因片段及其应用领域。

背景技术

欧洲甜樱桃(Prunus avium.L)属于蔷薇科，李亚科，樱属果树植物，是目前北方落叶果树中栽培效益最好的树种之一，也是中国北方春季上市最早的鲜果。目前中国的甜樱桃栽培面积和产量已达世界第一。尽管中国甜樱桃产业取得可喜的成绩，但生产中仍存在许多问题，如樱桃根癌病等问题，严重威胁着中国樱桃产业(张开春.等中国甜樱桃的栽培历史、生产现状及发展建议.落叶果树,2017,49(06):1-5.)。

樱桃根癌病，又称冠瘿病，是由根癌土壤杆菌属(Agrobacterium spp.)中的致病菌引起的一种细菌性病害，可侵染多种高等植物(马德钦等.果树根癌病及其生物防治.中国果树,1995,2(5):42-44.)。根癌土壤杆菌可从植株伤口侵入，有寄主组织存在的情况下，细菌并不进入寄主植物细胞，只是把Ti质粒的T-DNA片段导入植物细胞基因组中，在T-DNA上包含数个诱发肿瘤的关键基因，如生长素合成中关键酶色氨酸单加氧酶基因(iaaM)、吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)以及细胞***素合成过程中的关键酶异戊烯基转移酶基因(ipt)等，若细胞***素和生长素过量表达，使被侵染转化植株的细胞内源激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限增殖，转化为肿瘤状态，引起癌变，干扰了树体正常养分和水分供应，导致树体衰弱或死亡。由于该病发病率高、传播速度快，严重时可导致全园感病，对中国樱桃产业造成严重的危害(Gohlke J,Deeken R.Plant responses to Agrobacteriumtumefaciens and crown gall development.Frontiers in Plant Science,2014,5:155.)。因此，对威胁樱桃产业发展的根癌病进行深入研究和有效地防治势在必行。选用抗病品种或砧木以及提高砧木的抗病性是防治樱桃根癌病的一个重要途径，而抗病品种或砧木的选育周期长，因此，利用生物技术等手段提高已有砧木品种的抗病性是一种快速而有效的手段。

寄主诱导的基因沉默(HIGS)是在病毒诱导的基因沉默(VIGS)的基础上发展起来，也是转录后基因沉默(PTGS)-RNA沉默的一种表现(Baulcombe DC.VIGS,HIGS and FIGS:small RNA silencing in the interactions of viruses or filamentous organismswith their plant hosts.Current Opinion in Plant Biology,2015,141-146.)。将病原菌的特定基因通过病毒载体或含有双启动子的目的基因片段反义发夹结构载体转染到寄主植物中，导致病原物产生特定序列的双链RNA(dsRNA)。当病原物攻击表达HIGS结构的寄主时，病原菌中的目的基因会下调，亦即通过RNAi结构对在寄主植物中的病原菌内源性基因的表达进行干扰，最终沉默植物病原菌的基因(Nunes and Dean,2012；Yin andHulbert,2018)。HIGS作为一种快速简便、通用性强、靶向性高的新技术克服了以前基因功能研究方法的不足，将在植物专性寄生菌基因功能研究中显示出其强大的优势(肖瑶等.寄主诱导的基因沉默技术研究和应用进展.植物保护学报,2020,47(01):11-17.)。

因此，利用HIGS技术筛选获得抗根癌病的生长素合成关键酶iaaM、iaaH和细胞***素合成关键酶ipt的靶标片段或它们的融合靶标片段，对于提高樱桃砧木的抗病性或培育抗根癌病的果树新品种等均具有重要的价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段；

本发明的目的之二是提供含有根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段的干扰载体；

本发明的目的之三是将所述的靶基因片段或融合靶以及含有该靶基因片段的干扰载体应用于提高果树对根癌病的抗病性或构建获得抗根癌病的果树新种质。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先提供了抗根癌病的靶基因片段，所述的靶基因片段选自(1)-(3)中的任何一种靶基因片段：

(1)iaaM基因的4段靶标区段中的任何一段，所述iaaM基因的4段靶标区段分别为iaaM-1、iaaM-2、iaaM-3和iaaM-4，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；

(2)iaaH基因的4段靶标区段中的任何一段，所述iaaH基因的4段靶标区段分别为iaaH-1、iaaH-2、iaaH-3和iaaH-4，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示；

(3)ipt基因的4段靶标区段中的任何一段，所述ipt基因的4段靶标区段分别为ipt-1、ipt-2、ipt-3和ipt-4，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示。

其中，将iaaM-2、iaaM-4或ipt-2靶标片段的转基因樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌表现出显著的抗病性，植株达到高抗水平以上；由此，本发明中所述的抗根癌病的靶基因片段优选为iaaM-2(SEQ ID NO.2)、iaaM-4(SEQ ID NO.4)或ipt-2(SEQ ID NO.10)靶标片段中的任何一种。

本发明还提供了将iaaM、iaaH或ipt基因中任何两个基因的靶基因片段进行融合所得到的抗根癌病的融合靶基因片段，所述的融合靶基因片段分别为iaaM-ipt-1(SEQ IDNO.13)、iaaM-ipt-2(SEQ ID NO.14)、iaaM-iaaH-1(SEQ ID NO.15)和iaaM-iaaH-2(SEQ IDNO.16)、iaaH-ipt-1(SEQ ID NO.17)、iaaH-ipt-2(SEQ ID NO.18)；其中，iaaM-ipt-1的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示、iaaM-ipt-2的核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示、iaaM-iaaH-1的核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示，iaaM-iaaH-2的核苷酸序列为SEQ ID NO.16所示、iaaH-ipt-1的核苷酸序列为SEQ ID NO.17所示、iaaH-ipt-2的核苷酸序列为SEQ IDNO.18所示。

其中，将iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2这两个融合的靶标片段的转基因樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌表现出显著的抗病性，植株达到高抗水平以上，尤其获得iaaM-ipt-2靶标片段的转基因樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌抗病性为免疫水平；由此，本发明中所述的抗根癌病的融合靶基因片段优选为iaaM-ipt-1(SEQ ID NO.13)或iaaM-ipt-2(SEQ IDNO.14)所示的融合靶标片段中的任何一种。

本发明进一步提供了所述抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段所转录的RNA。

本发明进一步提供了含有所述抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段的RNA干扰载体；优选的，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。

本发明更进一步提供了一种构建所述RNA干扰载体的方法，包括：将所述的抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段***到Gateway干扰载体得到RNA干扰载体，即得；优选的，通过BP反应，将所述的靶基因片段或融合靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。

本发明提供了一种培育果树对根癌土壤杆菌抗性的方法，包括：将所述的抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段***到Gateway干扰载体得到RNA干扰载体；将所构建的RNA干扰载体转化到果树细胞或组织中。

本发明更进一步提供了一种培育抗根癌土壤杆菌的果树新品种的方法，包括：(1)将所述的抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段***到Gateway干扰载体得到RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到果树细胞或组织中；(3)筛选获得对根癌土壤杆菌抗病性提高的转基因果树新品种。

本发明中所述的果树可以是樱桃、桃、李、杏、葡萄等各种果树，优选为樱桃。

所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移等。

本发明整体技术方案详述

本发明通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)将18段樱桃根瘤病菌的iaaM、iaaH和ipt的靶标片段及其基因融合靶标片段导入樱桃砧木‘ZY-1’中，瞬时表达dsRNA，然后进行根癌土壤杆菌接种，发现导入18段靶基因片段的樱桃砧木‘ZY-1’的抗病性都显著提高，都达到抗病水平以上，其中有5段靶标片段(或融合片段序列)的抗病性极显著提高，达到高抗水平以上甚至免疫。进一步，本研究利用RNAi技术，构建了上述5段靶基因序列(达到高抗水平以上甚至免疫)的稳定遗传干扰载体，转化樱桃砧木‘ZY-1’，获得转基因的樱桃砧木‘ZY-1植株，其对根癌土壤杆菌抗病性显著增强，达到高抗水平以上，尤其获得iaaM-ipt-2靶标片段的转基因樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌抗性为免疫水平。

将本发明所筛选获得抗根癌病的靶基因片段或融合靶基因片段构建稳定的遗传转化载体并将其转入樱桃、桃、李、杏、葡萄等果树中，能够有效提高果树对根癌病的抗性并可望培育获得抗根癌病的果树新种质，实现对果树根癌病的控制和防治，消除其在生产中的危害。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行***以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“RNA干扰(RNA interference,RNAi)”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同原序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1.瞬时转化18段靶标基因的樱桃砧木‘ZY-1’的冠瘿瘤直径分析。**表示t-test在p<0.01水平存在显著差异，***表示t-test在p<0.01水平存在极显著差异。

图2.瞬时转化18段靶标基因的樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌的病情指数分析。**表示t-test在p<0.01水平存在显著差异，***表示t-test在p<0.01水平存在极显著差异。

图3.樱桃砧木‘ZY-1’的遗传转化体系。(1)根癌农杆菌GV3101侵染樱桃CAB-6p试管苗幼嫩叶片转入再生培养基诱导再生不定芽初始状态(注：叶片必须用合拢状态的幼嫩叶片，用刀片在嫩叶上划伤数刀置于农杆菌菌液中侵染)。(2-3)叶片转入诱导再生培养基3周后的生长状态。(4-5)叶片转入再生培养基7周后诱导再生不定芽情况。(6)叶片诱导再生植株转入生根培养基4周后生根情况。

图4.樱桃砧木‘ZY-1’的遗传转化苗的分子鉴定。1-3(转基因植株)电泳通道都扩增到对应基因iaaM-2(A)、iaaM-4(B)、ipt-2(C)、iaaM-ipt-1(D)、iaaM-ipt-2(E)的靶基因片段，Wt(野生型植株)电泳通道没有扩增到相应片段，质粒(阳性对照)可扩增到相应靶标片段，M是DNA marker。

图5.转靶标基因的樱桃砧木‘ZY-1’的抗病性评价。A.冠瘿瘤直径统计分析。B.病情指数与抗病性分析。**表示t-test在p<0.01水平存在显著差异，***表示t-test在p<0.01水平存在极显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

试验例1樱桃根癌病菌的生长素合成关键酶iaaM、iaaH和细胞***素合成关键酶ipt的靶标片段或融合靶标片段的筛选、稳定遗传干扰载体的构建以及遗传转化

1.材料与方法

1.1 菌株和载体：

根癌土壤杆菌菌株为本发明人课题组从河南省郑州市中牟县感病樱桃树的冠瘿组织中分离、纯化所得，测序确定为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(序列号HQ143621.1)。发根农杆菌感受态C58C1购于上海唯地生物技术有限公司。

载体TRV1与TRV2是清华大学刘玉乐博士惠赠；载体pDONR207、pK7GWIWG2(I),0为本发明人实验室保存。

1.2 VIGS-iaaM、VIGS-iaaH、VIGS-ipt瞬时干扰载体的构建及发根农杆菌和根癌土壤农杆菌接种。

以樱桃根瘤病菌总RNA为模板，设计4对iaaM(NP_059676.1)基因、4对iaaH(NC_002377.1)基因和4对ipt(YP_001967412.1)基因的靶基因引物(引物序列见表1)：

表1引物名称及序列信息

分别扩增iaaM、iaaH和ipt基因的4段靶标区段信息，长度在200-450bp，其中，iaaM基因的4段靶标区段分别为iaaM-1(SEQ ID NO.1)、iaaM-2(SEQ ID NO.2)、iaaM-3(SEQ IDNO.3)和iaaM-4(SEQ ID NO.4)；iaaH基因的4段靶标区段分别为iaaH-1(SEQ ID NO.5)、iaaH-2(SEQ ID NO.6)、iaaH-3(SEQ ID NO.7)和iaaH-4(SEQ ID NO.8)；ipt基因的4段靶标区段分别为ipt-1(SEQ ID NO.9)、ipt-2(SEQ ID NO.10)、ipt-3(SEQ ID NO.11)和ipt-4(SEQ ID NO.12)；同时利用基因合成技术分别合成6段iaaM、iaaH和ipt基因的融合靶标片段，长度在200-450bp，这6段融合靶标片段分别为iaaM-ipt-1(SEQ ID NO.13)、iaaM-ipt-2(SEQ ID NO.14)、iaaM-iaaH-1(SEQ ID NO.15)和iaaM-iaaH-2(SEQ ID NO.16)、iaaH-ipt-1(SEQ ID NO.17)、iaaH-ipt-2(SEQ ID NO.18)。

分别扩增获得iaaM、iaaH和ipt基因的12段靶标片段和通过基因合成技术获得6段融合片段分别连接到载体TRV2的多克隆位点区域(图1)，获得重组载体TRV2-iaaM-1、TRV2-iaaM-2、TRV2-iaaM-3、TRV2-iaaM-4、TRV2-iaaH-1、TRV2-iaaH-2、TRV2-iaaH-3、TRV2-iaaH-4，TRV2-ipt-1、TRV2-ipt-2、TRV2-ipt-3、TRV2-ipt-4、TRV2-iaaM-ipt-1、TRV2-iaaM-ipt-2、TRV2-iaaH-ipt-1、TRV2-iaaH-ipt-2、TRV2-iaaM-iaaH-1和TRV2-iaaM-iaaH-2，测序正确后电击转化发根农杆菌C58C1，与TRV1(携带TRV病毒另一部分基因信息)的发根农杆菌C58C1菌株1：1混合，OD₆₀₀＝0.8-1.0，利用注射器将混合好的农杆菌注射到2年生的盆栽扦插苗的樱桃砧木‘ZY-1’嫩根中，每个靶标片段至少注射50株苗以上，并且至少进行3次生物学重复。14天以后，利用OD₆₀₀＝0.8浓度的新鲜根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(序列号HQ143621.1)悬浮液，通过新梢针刺注射法对产生dsRNA片段的樱桃砧木‘ZY-1’进行人工接种。2个月后，观察樱桃砧木‘ZY-1’的发病情况，并进行病情指数分析。

1.3 稳定干扰载体的构建

本发明利用Gateway技术，选择已筛选到的抗病性显著的5段靶基因片段iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1和iaaM-ipt-2。设计两端含有BP位点的引物(引物序列见表1)，在5’端加入attB1位点部分序列(aaaaaagcaggct)，在3’端加入attB2位点序列(aagaaagctgggt)。以上述含有靶标片段的TRV2载体为模板，分别扩增5段带有完整attB位点的靶基因片段，克隆到pEASY-T1载体，用于Gateway方法构建RNAi载体。构建干扰表达载体需发生两个反应：(1)BP反应：采用入门载体pDONR^TM207，BP反应参照invitrogn公司的

BP

II Enzyme mix(美国)说明书操作，生成具有attL重组位点的中间载体。(2)LR反应：干扰载体是pK7GWIWG2(I),0，LR反应参照invitrogn公司的

LRII Enzyme mix(美国)说明书操作，将克隆的5段靶基因片段通过中间载体构建到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上形成含有靶标基因的植物转化载体。电击法将获得含有靶基因片段的干扰载体转化农杆菌GV3101，用于欧洲酸樱桃‘ZY-1’等植株的遗传转化。

1.4 樱桃砧木‘ZY-1’的遗传转化及分子鉴定

利用本发明人团队已经建立的完善的根癌农杆菌介导樱桃的遗传转化体系(高喜叶等.樱桃砧木CAB-6p离体叶片再生体系的优化.果树学报,2008(04):589-592+623.)，转基因试材为欧洲酸樱桃‘ZY-1’，半野生樱桃品种。从苗龄1个月的樱桃试管苗上取出幼嫩完全未展开的叶片进行切割，用手术刀垂直叶片主脉横切5刀，切断主脉但不切断叶片。将切好的外植体在OD₆₀₀＝0.8-1.0的农杆菌菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将小叶摆放在铺有一层滤纸芽分化培养基(WPM+6-BA 2mg/L+IAA 2mg/L+AS 20mg/L)上进行共培养，25℃暗培养3天。将经过共培养的樱桃外植体转移到含有抗生素的抗性芽筛选培养基(WPM+6-BA 2mg/L+IAA 2mg/L+Cef 400mg/L+Kan 50mg/L)中进行培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，6～8周后即可生芽。待抗性芽生长至1～2cm高时，切下小芽转入生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 50mg/L)中诱导生根，2～3周后就会有不定根形成。

获得的樱桃砧木‘ZY-1’转化株系后，对其进行分子鉴定。提取转基因苗的总基因组为模板，设计iaaM-2-J-F/R、iaaM-4-J-F/R、ipt-2-J-F/R、iaaM-ipt-1-J-F/R、iaaM-ipt-2-J-F/R引物(序列见表1)，进行PCR分子检测，检测为阳性苗的植株进行继代培养，为下一步的抗病性实验准备。

1.5 抗性评价

根据未导入干扰靶标片段的植株的肿瘤直径将单个植株发病情况分为5个等级：0级(免疫)：为未发病，1级(高抗)：瘤径1.0～3.0mm，2级(抗病)：瘤径3.1～5.0mm，3级(感病)：瘤径5.1～7.0mm，4级(高感)：瘤径>7.1mm。

根据病情指数将樱桃砧木‘ZY-1’的转基因株系对根癌病的抗性分为5个等级。免疫(R0)，病情指数0；高度抗病(HR)，病情指数0-15；抗病(MR),病情指数15-30；感病(MS)，病情指数30-45；高度感病(HM)，病情指数45以上。

病情指数＝∑(病级×同病级株数)/最高病级×调查总株数×100

每次每个无性系材料接种60株以上，并且至少进行三次生物学重复。

1.6 数据处理

使用Microsoft Excel 2010软件对所获数据处理并绘图；使用SPSS17.0软件进行相关性分析和差异显著性(p<0.05)分析。

2.试验结果

2.1.VIGS-iaaM、VIGS-iaaH、VIGS-ipt及融合靶标片段瞬时干扰樱桃砧木‘ZY-1’的抗病性分析

本试验分别克隆到樱桃根瘤病菌iaaM、iaaH和ipt的靶标片段各4段以及基因合成的6段iaaM、iaaH和ipt的融合片段，共18条靶标片段通过发根农杆菌C58C1介导的遗传转化，分别导入2年生的盆栽扦插苗的樱桃砧木‘ZY-1’中表达出dsRNA。14天以后，对产生dsRNA片段的樱桃砧木‘ZY-1’进行人工接种根癌土壤杆菌。2个月后统计冠瘿瘤直径，计算病情指数并对其进行抗病性评价。

分析结果发现：导入靶标基因片段并产生dsRNA的樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌的感病症状(有无冠瘿瘤出现以及冠瘿瘤直径大小)显著低于空载注射的樱桃砧木‘ZY-1’。接菌2个月，导入靶标基因片段的樱桃砧木‘ZY-1’没有出现明显的感病症状，仅个别出现冠瘿瘤且直径小，甚至没有冠瘿瘤出现；而注射空载的樱桃砧木‘ZY-1’出现明显的感病症状，出现显著的冠瘿瘤且直径大(图1)。试验结果表明导入iaaM、iaaH和ipt的靶标片段以及iaaM、iaaH和ipt基因的融合片段的樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌的抗病性增强。

本试验对接种根癌土壤杆菌的樱桃砧木‘ZY-1’的病情指数进行统计分析结果发现：在接种根癌土壤杆菌2个月和3个月以后，导入iaaM、iaaH和ipt的靶标片段以及iaaM、iaaH和ipt基因的融合靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’的病情指数分别为0％～19.36％和0％～29.69％，而未导入靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’的病情指数分别为59.98％、86.67％，表明导入靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’的病情指数显著低于注射空载体的樱桃砧木‘ZY-1’。按照抗性分级标准进行评价，导入靶基因片段iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2的樱桃砧木‘ZY-1’为高抗(免疫)，导入靶基因片段iaaM-3、ipt-1、iaaM-iaaH-1、iaaH-ipt-1、iaaH-ipt-2的樱桃砧木‘ZY-1’为高抗，导入靶基因片段iaaM-1、iaaH-1、iaaH-2、iaaH-3、iaaH-4、ipt-3、ipt-4、iaaM-iaaH-2的樱桃砧木‘ZY-1’为抗病(图2)。

研究发现3个不同生长素或细胞***素合成的关键基因iaaM、iaaH和ipt之间的不同基因靶标区段导入樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌的抗病性存在差异，iaaM和ipt基因的靶标片段及其融合片段的抗病性显著高于iaaH基因的靶标片段及其融合片段，由此推测iaaM和ipt可能在根癌土壤杆菌形成冠瘿瘤中扮演重要的作用。

综上试验结果表明本发明所设计的18段iaaM、iaaH和ipt的靶标片段及iaaM、iaaH和ipt的融合片段瞬时干扰的樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌的抗病性显著增强，植株表现为抗病性；同时18段不同的靶基因片段之间的抗病性存在差异性。总之，本试验通过HIGS技术筛选，获得可以提高樱桃砧木‘ZY-1’抗根癌病的iaaM、iaaH和ipt基因靶标片段和融合靶基因片段。

2.2 转靶标基因烟草植株的获得

通过农杆菌介导的樱桃砧木‘ZY-1’的稳定遗传转化，分别将含有iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2的靶标片段的干扰载体转化至樱桃砧木‘ZY-1’，经卡那霉素筛选最终获得转基因樱桃砧木‘ZY-1’(图3)。对获得的转基因樱桃砧木‘ZY-1’进行PCR检测，每段靶基因都获得多个不同的阳性转化株系，分别随机挑选3个转基因株系进行下一步的抗病性分析(图4)。

2.3 转靶标基因的樱桃砧木‘ZY-1’的抗病性评价

为了确定转靶标基因片段的樱桃砧木‘ZY-1’株系对根癌土壤杆菌的抗性等级，是否能达到免疫等级，本试验对获得iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2的靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’组织培养苗进行根癌病抗性鉴定。结果显示：接种20天后，未获得靶标片段的阴性对照(转空载体)陆续在接种部位长出白色的突起，冠瘿瘤开始形成，而获得iaaM-2、iaaM-4、iaaM-ipt-1或ipt-2靶基因的樱桃砧木‘ZY-1’组织培养苗仅部分植株长出白色突起，获得iaaM-ipt-2靶基因的樱桃砧木‘ZY-1’均未在接种部位长出白色突起；接种40天后，未获得靶标片段的阴性对照(转空载体)的冠瘿瘤继续发育，且直径越来越大，而获得iaaM-2、iaaM-4、iaaM-ipt-1或ipt-2靶基因的樱桃砧木‘ZY-1’组织培养苗仅个别几株形成冠瘿瘤，冠瘿瘤直径显著小于未获得靶标片段的阴性对照，获得iaaM-ipt-2靶基因的樱桃砧木‘ZY-1’仍均未在接种部位长出白色突起(图5A)。对转基因株系进行病情指数分析，结果发现：接种2个月后，获得iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2的靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’组织培养苗对根癌土壤杆菌的病情指数分别为5.82％、9.78％、2.98％、4.67％和0％，而未获得靶标片段的阴性对照(转空载体)的樱桃砧木‘ZY-1’组织培养苗对根癌土壤杆菌的病情指数为68.90％(图6)。抗性分级标准进行评价，结果显示获得iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2的靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’组织培养苗对根癌土壤杆菌的抗病性与未获得靶标片段的阴性对照(转空载体)相比，抗病性极显著提高，获得iaaM-2、iaaM-4、ipt-2、iaaM-ipt-1靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’为高抗等级，获得iaaM-ipt-2靶标片段的樱桃砧木‘ZY-1’为免疫等级(图5B)。综上结果表明：获得iaaM-2、iaaM-4、iaaM-ipt-1、iaaM-ipt-2和ipt-2靶标片段的转基因樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌表现出显著的抗病性，植株达到高抗水平以上，尤其获得iaaM-ipt-2靶标片段的转基因樱桃砧木‘ZY-1’对根癌土壤杆菌抗病性为免疫水平。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 抗根癌病的靶基因片段及其干扰载体和应用

<130> HN-2002-200513A

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 313

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 1

gtttattgag atcctccgct tggtcatcaa cggatatgaa gaaaatcagc ggatgtgccc 60

tgaaggaatc tcagaacttc cacgtcggat cgcatctgaa gtggttaacg gtgtgtctgt 120

gagccagcgc atatgccatg ttcaagtcag ggcgattcag aaggaaaaga caaaaataaa 180

gataaggctt aagagcggga tatctgaact ttatgataag gtggtggtca catctggact 240

cgcaaatatc caactcaggc attgcctgac atgcgatacc aatatttttc aggcaccagt 300

gaaccaagcg gtt 313

<210> 2

<211> 373

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 2

cccaaatccc ggcacagtcg acacttactt ggtctaccaa ggcgtccaat acatgtggaa 60

agccgggcag ctgccaccga agctgttcca tcgcgtttac aacggttggc gtgcgttctt 120

gaaggacggt tttcatgagc gagatattgt gttggcttcg cctgtcgcta ttactcaggc 180

cttgaaatca ggagacatta ggtgggctca tgactcctgg caaatttggc tgaaccgttt 240

cgggagggag tccttctctt cagggataga gaggatcttt ctgggcacac atcctcctgg 300

tggtgaaaca tggagttttc ctcatgattg ggacctattc aagctaatgg gaataggatc 360

tggcgggttt ggt 373

<210> 3

<211> 435

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 3

ggcgcgggca acagtgagtg gtctcgttgc catcgacttg gcaccatttt gcatggattt 60

ctccgaagca caactaatcc aagccctgtt tttgctgagc ggtaaaagat gtgcaccgat 120

tgatcttagt catttcgtgg ccatttcaat ctctaagact gccggctttc gaaccctgcc 180

aatgccgctg tacgagaatg gcacgatgaa atgcgttacc gggtttacca taacccttga 240

aggggccgtg ccatttgaca tggtagctta tggtcgaaac ctgatgctga agggttcggc 300

aggttccttt ccaacaatcg acttgctcta cgactacaga ccgttttttg accaatgttc 360

cgatagtgga cggatcggct tctttccgga ggatgttcct aagccgaaag tggcggtcat 420

tggcgctggc atttc 435

<210> 4

<211> 265

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 4

gacgggatcg caaaagcagt gtattgcctg gactatgagt cgcaggatcc gaatggtaaa 60

ggtctagtgc tcatcagtta tacatgggag gacgactccc acaagctgtt ggcggtcccc 120

gacaaaaaag agcgattatg tctgctgcgg gacgcaattt cgagatcttt cccggcgttt 180

gcccagcacc tatttcctgc ctgcgctgat tacgaccaaa atgttattca acatgattgg 240

cttacagacg agaatgccgg gggag 265

<210> 5

<211> 309

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 5

cagtcattcg tatcacacga cgtgattgct gaattcccac caataatggc gcaagctggg 60

ttcaagcttg gtatatttat ttggtctgaa tgggtttgaa atttccaact cagagagatg 120

gtggccatta cctcgttagc ccaaagccta gaacacctga aacggaaaga ctactcctgc 180

ttagaactag tagaaactct gatagcgcgt tgtgaagctg caaaatcatt aaacgccctt 240

ctggctacag actgggatgg tttgcggcga agcgccaaaa aaattgatcg ccatggaaac 300

gccggagta 309

<210> 6

<211> 342

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 6

aggcgaacat cgctaccggc gtatttccca caagcgccgc tacgccggcg ctgataaacc 60

acttgccaaa gataccatcc cgcgtcgcag aaagactttt ttcagctgga gcactgccgg 120

gtgcctcggg aaatatgcat gagttatcgt ttggaattac aagcaacaac tatgccaccg 180

gggcggtgcg aaacccgtgg aatccagatc tgataccagg gggctcaagc ggtggtgtgg 240

ctgctgcggt agcaagccga ttgatgttag gcggcatagg caccgatacc ggtgcatctg 300

ttcgcctacc cgcagccctg tgtggcgtag taggatttcg ac 342

<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 7

gcagtgcgta gccgatgttg taatcctcga ccggataatt tccggcacac cggagagaat 60

accacccgtg ccgctgaagg ggctaaggat cggcctccct acaacctact tttatgatga 120

ccttgatgct gatgtggccc tagcagctga aacaacgatt cgcctgctag caaacaaagg 180

cgtaactttt gttgaagcta acattcccca ccttgacgaa ctgaataaag gggccagctt 240

cccagttgca ctctatgaat ttccacacgc tctaaaacag tatctcgacg actttgtaaa 300

aactgtttct ttttctgacg tcatcaaagg aattcgtagc cctgatgtag ccaacat 357

<210> 8

<211> 357

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 8

agatgctatt ctcttcccaa cagcaccctt ggtggccaga cccataggtc aggattcctc 60

agttatccac aatggcacga tgctggacac attcaagatc tacgtgcgaa atgtggaccc 120

aagcagcaac gcaggcctac ctggcttgag cattcctgtt tgcctgacac ctgatcgctt 180

gcctgttgga atggagatcg atggattagc ggattcagac caacgtctgt tagcaatcgg 240

gggggcattg gaagaagcca ttggattccg atattttgcc ggtttaccca attaaacttt 300

ctaccatgtt cgtttttaca atttttcaga ttgatgacaa tcaatccttg tattgcg 357

<210> 9

<211> 216

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 9

aggagacagc catgccccac actttgttga aaaacaagtt gccttttggg aagaacctaa 60

agccacttgc tcttcaagga ggaatatcga ggaagagaat ataacagcct ctggtacaga 120

cttctcttgt gcaaaaaaat caatttgtat tcaacatatc gcaagaccga tggatctacg 180

tctaattttc ggtccaactt gcacaggaaa gacatc 216

<210> 10

<211> 248

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 10

cgggcttatt cttgagggag gatctatctc gttgctcagg tgcatggcgc aaagtcgtta 60

ttggaacgcg gattttcgtt ggcatattat tcgcaacgag ttagcagacg aggagagctt 120

catgagcgtg gccaagacca gagttaagca gatgttacgc ccctctgcag gtctttctat 180

tatccaagag ttggttcaac tttggaggga gcctcggctg aggcccatac tggaagggat 240

cgatggat 248

<210> 11

<211> 235

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 11

gaaagacatc gactgcgata gctcttgccc agcagactgg cctcccagtc ctctcgctcg 60

atcgcgtcca atgctgtcct caactatcaa ccggaagcgg gcgaccaaca gtggaagaac 120

tgaaaggaac gactcgtctg taccttgatg atcgcccttt ggtaaagggt atcattacag 180

ccaagcaagc tcatgaacgg ctcattgcgg aggtgcacaa tcacgaggcc aaagg 235

<210> 12

<211> 225

<212> DNA

<213> Agrobacterium spp

<400> 12

aggcccatac tggaagggat cgatggatat cgatatgccc tgctatttgc tacccagaac 60

cagatcacgc ccgatatgct attgcagctc gacgcagata tggagaataa attgattcac 120

ggtatcgctc aggagtttct aatccatgcg cgtcgacagg aacagaaatt ccctttggtg 180

ggcgcgacag ctgtcgaagc gtttgaagga ccaccatttc gaatg 225

<210> 13

<211> 408

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 13

ccctgttttt gctgagcggt aaaagatgtg caccgattga tcttagtcat ttcgtggcca 60

tttcaatctc taagactgcc ggctttcgaa ccctgccaat gccgctgtac gagaatggca 120

cgatgaaatg cgttaccggg tttaccataa cccttgaagg ggccgtgcca tttgacatgg 180

tagcttatgg tcgaaacctg atgctgccac ttgctcttca aggaggaata tcgaggaaga 240

gaatataaca gcctctggta cagacttctc ttgtgcaaaa aaatcaattt gtattcaaca 300

tatcgcaaga ccgatggatc tacgtctaat tttcggtcca acttgcacag gaaagacatc 360

gactgcgata gctcttgccc agcagactgg cctcccagtc ctctcgct 408

<210> 14

<211> 447

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 14

cggttggcgt gcgttcttga aggacggttt tcatgagcga gatattgtgt tggcttcgcc 60

tgtcgctatt actcaggcct tgaaatcagg agacattagg tgggctcatg actcctggca 120

aatttggctg aaccgtttcg ggagggagtc cttctcttca gggatagaga ggatctttct 180

gggcacacat cctcctggtg gtgtcgttgc tcaggtgcat ggcgcaaagt cgttattgga 240

acgcggattt tcgttggcat attattcgca acgagttagc agacgaggag agcttcatga 300

gcgtggccaa gaccagagtt aagcagatgt tacgcccctc tgcaggtctt tctattatcc 360

aagagttggt tcaactttgg agggagcctc ggctgaggcc catactggaa gggatcgatg 420

gatatcgata tgccctgcta tttgcta 447

<210> 15

<211> 448

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 15

caggatccga atggtaaagg tctagtgctc atcagttata catgggagga cgactcccac 60

aagctgttgg cggtccccga caaaaaagag cgattatgtc tgctgcggga cgcaatttcg 120

agatctttcc cggcgtttgc ccagcaccta tttcctgcct gcgctgatta cgaccaaaat 180

gttattcaac atgattggct tacagacgag aatgccggcc ggggcggtgc gaaacccgtg 240

gaatccagat ctgataccag ggggctcaag cggtggtgtg gctgctgcgg tagcaagccg 300

attgatgtta ggcggcatag gcaccgatac cggtgcatct gttcgcctac ccgcagccct 360

gtgtggcgta gtaggatttc gaccgacgct tggtagatat ccgggagatc ggataatacc 420

ggttagccct acccgggaca ctcccgga 448

<210> 16

<211> 446

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 16

acggttggcg tgcgttcttg aaggacggtt ttcatgagcg agatattgtg ttggcttcgc 60

ctgtcgctat tactcaggcc ttgaaatcag gagacattag gtgggctcat gactcctggc 120

aaatttggct gaaccgtttc gggagggagt ccttctcttc agggatagag aggatctttc 180

tgggcacaca tcctcctggt ggtgaaacat gcacacgctc taaaacagta tctcgacgac 240

tttgtaaaaa ctgtttcttt ttctgacgtc atcaaaggaa ttcgtagccc tgatgtagcc 300

aacattgcca atgcgcaaat tgatggacat caaatttcca aagctgaata tgaactggcc 360

cgccactcct tcagaccaag acttcaagcc acctatcgca actacttcaa actgaataga 420

ttagatgcta ttctcttccc aacagc 446

<210> 17

<211> 421

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 17

aagactactc ctgcttagaa ctagtagaaa ctctgatagc gcgttgtgaa gctgcaaaat 60

cattaaacgc ccttctggct acagactggg atggtttgcg gcgaagcgcc aaaaaaattg 120

atcgccatgg aaacgccgga gtaggtcttt gcggcattcc actctgtttt aaggcgaaca 180

tcgctaccgg cgtaatgtta cgcccctctg caggtctttc tattatccaa gagttggttc 240

aactttggag ggagcctcgg ctgaggccca tactggaagg gatcgatgga tatcgatatg 300

ccctgctatt tgctacccag aaccagatca cgcccgatat gctattgcag ctcgacgcag 360

atatggagaa taaattgatt cacggtatcg ctcaggagtt tctaatccat gcgcgtcgac 420

a 421

<210> 18

<211> 445

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 18

gccagcttcc cagttgcact ctatgaattt ccacacgctc taaaacagta tctcgacgac 60

tttgtaaaaa ctgtttcttt ttctgacgtc atcaaaggaa ttcgtagccc tgatgtagcc 120

aacattgcca atgcgcaaat tgatggacat caaatttcca aagctgaata tgaactggcc 180

cgccactcct tcagaccaag acttcaagcc acctatcgca acttgcacag gaaagacatc 240

gactgcgata gctcttgccc agcagactgg cctcccagtc ctctcgctcg atcgcgtcca 300

atgctgtcct caactatcaa ccggaagcgg gcgaccaaca gtggaagaac tgaaaggaac 360

gactcgtctg taccttgatg atcgcccttt ggtaaagggt atcattacag ccaagcaagc 420

tcatgaacgg ctcattgcgg aggtg 445