一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶及其编码基因和应用 (Salix matsudana 1, 7-sedoheptulose diphosphate phosphatase, and coding gene and application thereof ) 是由 陈艳红 张健 江钰娜 余春梅 刘国元 钟非 连博琳 刘昱 朱星兆 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶及其编码基因和应用,涉及基因工程技术领域。基因来源于旱柳,命名为SmSBPase基因,基因的序列如SEQ ID NO:1所示,其编码的蛋白质为1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的基因及其编码的蛋白质具有1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶的功能,得到的含有SmSBPase基因的转基因拟南芥耐盐性显著提高,为植物耐盐性的研究中提供了优异的基因资源和酶资源。(The invention provides salix matsudana 1, 7-diphosphoric acid sedoheptulose phosphatase, a coding gene and application thereof, and relates to the technical field of genetic engineering. The gene is derived from salix matsudana and named as SmSBPase gene, the sequence of the gene is shown as SEQ ID NO. 1, the coded protein is sedoheptulose-1, 7-diphosphate, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO. 2. The gene and the protein coded by the gene have the functions of 1, 7-sedoheptulose diphosphate phosphatase, the salt tolerance of the obtained transgenic arabidopsis containing the SmSBPase gene is obviously improved, and excellent gene resources and enzyme resources are provided for the research of the salt tolerance of plants.)
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶及其编码基因和应用。
背景技术：
土壤盐分是影响植物器官生长和生产力的主要不利环境因子之一。约10亿公顷土地受盐害影响且呈逐年增加的趋势，占世界陆地总面积的6％以上。高浓度的盐会导致渗透胁迫、Na+和Cl-胁迫的积累以及活性氧(ROS)的产生，这些都对植物的新陈代谢和生长产生负面影响，并导致作物减产，每年损失可达273亿美元。在中国，估计约30％的盐渍土可以通过不同的策略进行复垦，以确保粮食安全和改善经济环境。耐盐植物的选择和育种将是盐渍土复垦中最有效、最直接的策略。要通过基因工程获得更多的耐盐植物，首先要解决植物耐盐网络的关键组成部分，揭示其分子机制，具有重要的理论和实践意义。
旱柳(Salix matsudana)，又名中国柳，是杨柳科、柳属中重要的树种之一，喜光，耐寒，湿地、旱地皆能生长，原产于中国东北部。旱柳是一种重要的观赏、绿化和用材树种。旱柳的基因组多为异源四倍体，其耐盐性高于二倍体近缘种，因此，在我国沿海高盐分滩涂种植时，通过改善滩涂土壤，缓解盐渍化，也起到了重要的生态作用。与其他模式植物和作物相比，目前对旱柳的耐盐分子机制的研究较少。
1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶(SBPase)是植物卡尔文循环过程中的关键酶，也是植物光合作用途径的主要限速酶之一，SBPase活性轻微受抑制，就会导致卡尔文循环更新能力的减弱、光合活性的下降。基因工程研究证实，多种植物中SBPase的生物学功能是明显提高植物光合固定CO2的效率和光合能力，促进植株体内糖类的累积和植株的生长。也有研究表明，SBPase在缓解氧化胁迫和盐胁迫中起重要作用。目前还未见旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶(SBPase)及其在种子萌发及幼苗抗盐方面的报道。
发明内容
：本发明的目的在于提供一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶及其编码基因和应用，所述基因来源于旱柳(Salix matsudana)，命名为SmSBPase基因，其编码的蛋白质为1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶。
本发明一方面提供了一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶的基因所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示；上述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一方面提供了一种含有上述的基因的重组T载体，所述重组T载体的获得包括以下步骤：
(1)SmSBPase基因的获得：提取旱柳叶的RNA，反转录合成cDNA，利用以下引物进行PCR扩增，得到PCR产物1，即SmSBPase cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物1：SmSBPase CDS-F
5’-AACTTGGACATCCAGCTAAAATG-3’；
引物2：SmSBPase CDS-R
5’-TTAAGCGGCAGCTCCAACAGTAAC-3’；
(2)重组T载体的获得：在步骤(1)得到的PCR产物1末端加A，与pGEM-T载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含有5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷、X-gal和100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜，挑单菌落，LB液体培养基培养过夜，提取质粒，得到重组T载体，即pGEM-T-SmSBPase。
一方面还提供了一种含有上述的基因的重组植物表达载体，所述重组植物表达载体的获得包括以下步骤：
(1)连接植物表达载体Pwm101：以上述得到的pGEM-T-SmSBPase质粒为模板，利用以下引物进行PCR扩增，得到PCR产物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
引物3：Pwm101-SmSBPase-F TCGAGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGAGACTGGTGTAGCATGCTG；
引物4：Pwm101-SmSBPase-R GCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATTAAGCGGCAGCTCCAACAGTAAC；
(2)重组植物表达载体的获得：将步骤(1)得到的PCR产物2和线性化Pwm101载体进行重组连接，连接产物进行大肠杆菌DH5α感受态细胞转化，在含有50ug/ml卡那霉素的LB固体培养基培养过夜，挑单菌落，LB液体培养基培养过夜，提取质粒，得到重组植物表达载体，即Pwm101-SmSBPase。
再一方面提供了一种含有上述基因的转基因拟南芥，所述转基因拟南芥的获得包括以下步骤：
将得到的上述的重组植物表达载体Pwm101-SmSBPase转化农杆菌GV3101的感受态细胞，得到重组菌GV3101/Pwm101-SmSBPase，将重组菌GV3101/Pwm101-SmSBPase转化拟南芥，在含50mg/L潮霉素的MS培养基上筛选阳性转基因株系T1代，T1代转基因株系经过两个世代的培养和筛选过程得到纯合的T3代转SmSBPase基因拟南芥种子，将T3代转基因拟南芥种子直接播种，在温室长日照条件下正常生长，得到转基因拟南芥。
本发明另一方面提供了上述的基因在植物耐盐中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的基因及其编码的蛋白质具有1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶的功能；本发明得到的含有SmSBPase基因的转基因拟南芥耐盐性显著提高，为植物耐盐性的研究中提供了优异的基因资源和酶资源。
附图说明
图1为SmSBPase基因在WT、L20和L22转基因株系中的表达水平。
图2为WT、L20和L22转基因株系中的SBPase活性。
图3为转SmSBPase拟南芥L20和L22株系和野生型拟南芥种子在不同浓度NaCl处理下7天萌发情况的观测结果。
图4为转SmSBPase拟南芥L20和L22株系和野生型拟南芥种子在不同浓度NaCl处理下7天萌发率统计结果。
图5为正常条件下生长和盐胁迫下处理24h和1周的野生型和转基因L20和L22株系植株叶片可溶性糖含量的变化。
图6为正常条件下生长和盐胁迫下处理24h和1周的野生型和转基因L20和L22株系植株叶片蔗糖含量的变化。
图7为正常条件下生长和盐胁迫下处理24h和1周的野生型和转基因L20和L22株系植株叶片淀粉含量的变化。
图8为正常条件下生长和盐胁迫下处理48h的野生型和转基因L20和L22株系植株叶片叶绿素含量的变化。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的药品、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：SmSBPase基因的编码序列和蛋白质序列的获得
参考中国专利CN110484599A中介绍的基于多组学测定发掘旱柳耐盐基因的方法，结合旱柳基因组基因序列注释信息和耐盐型与敏盐型旱柳植株盐胁迫条件下的差异表达基因数据，筛选出旱柳SBPase基因，其基因编码序列和蛋白质序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。经过和phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中红柳(Salixpurpurea)基因组信息进行Blast比对，确定为旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶(SBPase)基因，命名为SmSBPase。
上述基因编码序列可以通过人工合成和体外PCR扩增技术获得。
实施例2：含SmSBPase基因的重组T载体的获得
重组T载体的获得包括以下步骤：
(1)SmSBPase基因的获得：提取旱柳叶的RNA，反转录合成cDNA，利用以下引物进行PCR扩增，得到PCR产物1，即SmSBPase cDNA序列。
引物1：SmSBPase CDS-F
5’-AACTTGGACATCCAGCTAAAATG-3’；
引物2：SmSBPase CDS-R
5’-TTAAGCGGCAGCTCCAACAGTAAC-3’；
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃30sec，56℃38sec，72℃50sec，共33个循环；72℃延伸5min。
将PCR产物1进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，由1190个核苷酸组成，可编码SEQ ID NO:2所示的蛋白质SmSBPase。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:1相比，在起始密码子的上游包含了11bp 5’-UTR序列。
(2)重组T载体的获得：在步骤(1)得到的PCR产物1末端加A，与pGEM-T载体(Promega)连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞细胞(购自天根公司)，并涂布在含有5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷、X-gal和100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取白色单菌落，在LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定，同时碱法提取质粒DNA进行EcoRI单酶切分析和序列测定。
用限制性内切酶EcoRI进行酶切，得到酶切产物(含有上述SEQ ID NO:3所示的SmSBPase基因的DNA片段)。将pGEM-T载体重组质粒进行测序，测序结果表明，质粒为将序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的SmSBPase基因***pGEM-T载体的重组载体，命名为pGEM-T-SmSBPase。
实施例3：含SmSBPase基因的重组植物表达载体的获得
重组植物表达载体的获得包括以下步骤：
(1)连接植物表达载体Pwm101：以实施例2得到的pGEM-T-SmSBPase质粒为模板，利用以下引物进行PCR扩增，得到PCR产物2。
引物3：Pwm101-SmSBPase-F
TCGAGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGAGACTGGTGTAGCATGCTG；
引物4：Pwm101-SmSBPase-R
GCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATTAAGCGGCAGCTCCAACAGTAAC；
PCR产物2的两端各添加了植物表达载体Pwm101的18个核苷酸序列，且分别包含KpnI和XbaI酶切位点，产物序列如SEQ ID NO:4所示。
(2)重组植物表达载体的获得：将步骤(1)得到的PCR产物2和经KpnI和XbaI酶切线性化的Pwm101载体进行重组连接，连接产物进行大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自天根公司)转化，并涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板上培养过夜，挑取单菌落，在LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定，同时碱法提取质粒DNA进行KpnI和XbaI双酶切鉴定。
用限制性内切酶KpnI和XbaI进行双酶切，得到酶切产物(含有上述SEQ ID NO:1和4中所示的SmSBPase基因的DNA片段)。将重组质粒进行测序，测序结果表明，质粒为将序列表中SEQ ID NO:1或4所示的SmSBPase基因***载体Pwm101的重组载体，命名为Pwm101-SmSBPase。
实施例4：转SmSBPase基因拟南芥的获得
将实施例3得到的重组植物表达载体Pwm101-SmSBPase转化农杆菌GV3101的感受态细胞，得到重组菌GV3101/Pwm101-SmSBPase，将重组菌GV3101/Pwm101-SmSBPase通过花序浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)(购自ABRC)，含50mg/LHyg(潮霉素)的MS培养基筛选阳性转基因株系T1代，T1代转基因株系经过两个世代的培养和筛选过程得到纯合的T3代转SmSBPase基因拟南芥种子，将T3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，在温室长日照条件下正常生长，得到转基因拟南芥。其中L20和L22为转基因代表株系。
实施例5：转SmSBPase基因拟南芥的检测
1、RT-PCR检测SmSBPase基因表达水平
提取T3代转SmSBPase拟南芥株系(L20,L22)和野生型拟南芥(WT)全株的RNA，反转录得到cDNA，以其为模板，用如下引物进行PCR扩增。以野生型拟南芥为对照。
引物5：5’-TGTGTCGACAATGCTGGAAC-3’
引物6：5’-TGACTCACTCGCATTTCTGC-3’。
结果如图1所示，两个T3代转SmSBPase拟南芥株系(L20,L22)中SmSBPase的表达量显著高于野生型拟南芥(WT)，表明SmSBPase基因在T3代转SmSBPase拟南芥高水平表达。
2、转SmSBPase拟南芥中SBPase酶的酶活分析
将实施例4获得的两个T3代转SmSBPase(L20,L22)株系和野生型拟南芥(WT)移栽到蛭石中，温室培养(16h/8h光照黑暗周期，20-22℃)至3周。盐胁迫条件为用200mM NaCl浇灌拟南芥(处理组)，处理24小时，48小时和一星期，对照组(正常条件)浇灌等量的水，每组三个生物学重复。取对照组和处理组培养24小时和一星期的拟南芥测定可溶性糖，蔗糖和淀粉含量。用对照组和处理组培养48小时的拟南芥测定叶绿素含量和SmSBPase酶活性水平。
利用植物景天庚酮糖二磷酸酶(SBPase)ELISA试剂盒(购自南京草本源生物科技有限公司)提供方法，对野生型(WT)和T3代转基因株系中L20,L22在正常条件和盐胁迫条件下的景天庚酮糖二磷酸酶酶活水平进行检测，计算每组平均值。
结果如图2所示，两个T3代转SmSBPase拟南芥株系(L20,L22)中SmSBPase的酶活水平显著高于野生型拟南芥(WT)。在盐胁迫条件下，野生型拟南芥中和转SmSBPase拟南芥株系中酶活水平下降，但转SmSBPase拟南芥株系的酶活水平仍然高于正常条件下野生型拟南芥中的酶活水平，说明SmSBPase酶在转SmSBPase拟南芥株系中成功表达，并具有耐盐性。
实施例6：转SmSBPase拟南芥耐盐表型分析
1、种子萌发试验
取野生型拟南芥(WT)、两个T3代转SmSBPase株系L20,L22种子在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含不同浓度的NaCl(分别是0mM、50mM、75mM和100mM)，按照拟南芥每个株系约70粒种子，观测种子萌发时间并在第7天时统计萌发率。实验重复3次，结果取平均值。
结果如图3和图4所示(WT表示野生型拟南芥，L20,L22表示两个T3代转SmSBPase拟南芥，图3为表型图，图4为统计图)，T3代转SmSBPase拟南芥的种子在培养基中NaCl浓度为75mM和100mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥的种子萌发率，可见转SmSBPase拟南芥的耐盐性更高。
2、耐盐性试验
取野生型拟南芥(WT)、两个T3代转SmSBPase(L20,L22)株系直接播种到蛭石中，温室培养(16h/8h光照黑暗周期，20-22℃)至3周。盐胁迫条件为用200mM NaCl浇灌拟南芥(处理组)，处理24小时，48小时和一星期，对照组(正常条件)浇灌等量的水，每组三个生物学重复。处理24小时和一周后取植株叶片进行蔗糖、可溶性糖和淀粉的含量测定。同时取盐处理48小时的植株叶片进行叶绿素含量测定。
结果如图5-7所示，盐处理24h后，与野生型相比，L20和L22转基因株系的可溶性总糖含量(图5)和蔗糖含量(图6)明显高于野生型，而淀粉含量较低(图7)。盐胁迫1周后，野生型的可溶性糖(图5)和蔗糖含量(图6)也增加，淀粉含量下降(图7)。盐处理后，野生型品系叶绿素含量增加，但叶绿素含量降低(图8)。
上述结果表明，SmSBPase基因编码的蛋白具备耐盐性且通过以下两个机制赋予了拟南芥转基因系更高的耐盐性。第一，高盐溶液处理迅速引发转基因植株的盐胁迫反应，降解淀粉，促进可溶性糖(包括蔗糖)的积累，可溶性糖能够维持渗透平衡，从而提高耐盐能力的渗透物质。第二，盐胁迫后，转基因植株中高的叶绿素含量能增强植株光合能力，提高耐盐性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化均视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种旱柳1,7-二磷酸景天庚酮糖磷酸酶及其编码基因和应用
<130> 2020.07.20
<141> 2020-07-23
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213> 旱柳(Salix matsudana)
<400> 1
atggagactg gtgtagcatg ctgtgctcgt ggggcttact tacccggtgt ttcccagcat 60
tcaaaagctt cagtgtctcc acagtccatt ttcccatcct ttactgcgag gcgtctgaaa 120
tcaagctcgc tatttgggga gacgttgcgc ttcataccaa gatcatcact aaaggtttca 180
aaagcaaaaa actcttccct tgtgacccga tgtgaaattg gtgatagcct ggaagaattc 240
cttgcaaagg caactcctga taagggactg attagggtga tgatgtgcat gggagaggca 300
ttgaggacca ttgccttcaa agttaggact gcttcctgtg gaggaacggc ttgtgtgaac 360
tcctttggag atgagcagct tgctgttgat atgctagcca acaaccttct ttttgaggct 420
ttgactcact cgcatttctg caaatatgct tgctctgagg aggtccctga actgcaagac 480
atgggtggcc cggctgaagg tgggttcagt gttgcttttg atccacttga tggttccagc 540
attgtcgaca caaatttctc tgtgggcacc atcttcgggg tgtggccagg agacaaatta 600
actggggtaa ctgggagaga tcaagttgct gcagccatgg gggtttacgg tcctcgaacc 660
acttacgttc ttgctcttaa agactaccct ggaacccatg agtttcttct tcttgatgaa 720
ggaaaatggc aacatgtcaa agagacaaca gaggtcggtg aagggaaact tttctcccct 780
ggaaatttga gagccacatt tgacaaccct gactatgaaa agttgatcag ctactacgta 840
aaagagaagt acaccttgag atacacagga gggatggtgc cagatgtcaa tcagatcata 900
gttaaggaga agggtgtctt caccaatgtg atttctccaa cttccaaagc caagctgaga 960
ttgttatttg aggttgctcc tttggggtta ttggttgaaa aagctggggg ttacagtagt 1020
gatggtcatc ggtctgtgct agacaaggaa ataataaatc ttgatgacag aactcaagtt 1080
gcatatggtt ccaagaatga gattatccga tttgaggaaa ctctatatgg gaaatcaagg 1140
ctcgcggctg agggtgttac tgttggagct gccgcttaa 1179
<210> 2
<211> 392
<212> PRT
<213> METGVACCARGAYLPGVSQHSKA旱柳(Salix matsudana)
<400> 2
Met Glu Thr Gly Val Ala Cys Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Leu Pro Gly
1 5 10 15
Val Ser Gln His Ser Lys Ala Ser Val Ser Pro Gln Ser Ile Phe Pro
20 25 30
Ser Phe Thr Ala Arg Arg Leu Lys Ser Ser Ser Leu Phe Gly Glu Thr
35 40 45
Leu Arg Phe Ile Pro Arg Ser Ser Leu Lys Val Ser Lys Ala Lys Asn
50 55 60
Ser Ser Leu Val Thr Arg Cys Glu Ile Gly Asp Ser Leu Glu Glu Phe
65 70 75 80
Leu Ala Lys Ala Thr Pro Asp Lys Gly Leu Ile Arg Val Met Met Cys
85 90 95
Met Gly Glu Ala Leu Arg Thr Ile Ala Phe Lys Val Arg Thr Ala Ser
100 105 110
Cys Gly Gly Thr Ala Cys Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu Gln Leu Ala
115 120 125
Val Asp Met Leu Ala Asn Asn Leu Leu Phe Glu Ala Leu Thr His Ser
130 135 140
His Phe Cys Lys Tyr Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu Leu Gln Asp
145 150 155 160
Met Gly Gly Pro Ala Glu Gly Gly Phe Ser Val Ala Phe Asp Pro Leu
165 170 175
Asp Gly Ser Ser Ile Val Asp Thr Asn Phe Ser Val Gly Thr Ile Phe
180 185 190
Gly Val Trp Pro Gly Asp Lys Leu Thr Gly Val Thr Gly Arg Asp Gln
195 200 205
Val Ala Ala Ala Met Gly Val Tyr Gly Pro Arg Thr Thr Tyr Val Leu
210 215 220
Ala Leu Lys Asp Tyr Pro Gly Thr His Glu Phe Leu Leu Leu Asp Glu
225 230 235 240
Gly Lys Trp Gln His Val Lys Glu Thr Thr Glu Val Gly Glu Gly Lys
245 250 255
Leu Phe Ser Pro Gly Asn Leu Arg Ala Thr Phe Asp Asn Pro Asp Tyr
260 265 270
Glu Lys Leu Ile Ser Tyr Tyr Val Lys Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr
275 280 285
Thr Gly Gly Met Val Pro Asp Val Asn Gln Ile Ile Val Lys Glu Lys
290 295 300
Gly Val Phe Thr Asn Val Ile Ser Pro Thr Ser Lys Ala Lys Leu Arg
305 310 315 320
Leu Leu Phe Glu Val Ala Pro Leu Gly Leu Leu Val Glu Lys Ala Gly
325 330 335
Gly Tyr Ser Ser Asp Gly His Arg Ser Val Leu Asp Lys Glu Ile Ile
340 345 350
Asn Leu Asp Asp Arg Thr Gln Val Ala Tyr Gly Ser Lys Asn Glu Ile
355 360 365
Ile Arg Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Gly Lys Ser Arg Leu Ala Ala Glu
370 375 380
Gly Val Thr Val Gly Ala Ala Ala
385 390
<210> 3
<211> 1190
<212> DNA
<213> 人工合成(rengonghecheng)
<400> 3
atccagctaa aatggagact ggtgtagcat gctgtgctcg tggggcttac ttacccggtg 60
tttcccagca ttcaaaagct tcagtgtctc cacagtccat tttcccatcc tttactgcga 120
ggcgtctgaa atcaagctcg ctatttgggg agacgttgcg cttcatacca agatcatcac 180
taaaggtttc aaaagcaaaa aactcttccc ttgtgacccg atgtgaaatt ggtgatagcc 240
tggaagaatt ccttgcaaag gcaactcctg ataagggact gattagggtg atgatgtgca 300
tgggagaggc attgaggacc attgccttca aagttaggac tgcttcctgt ggaggaacgg 360
cttgtgtgaa ctcctttgga gatgagcagc ttgctgttga tatgctagcc aacaaccttc 420
tttttgaggc tttgactcac tcgcatttct gcaaatatgc ttgctctgag gaggtccctg 480
aactgcaaga catgggtggc ccggctgaag gtgggttcag tgttgctttt gatccacttg 540
atggttccag cattgtcgac acaaatttct ctgtgggcac catcttcggg gtgtggccag 600
gagacaaatt aactggggta actgggagag atcaagttgc tgcagccatg ggggtttacg 660
gtcctcgaac cacttacgtt cttgctctta aagactaccc tggaacccat gagtttcttc 720
ttcttgatga aggaaaatgg caacatgtca aagagacaac agaggtcggt gaagggaaac 780
ttttctcccc tggaaatttg agagccacat ttgacaaccc tgactatgaa aagttgatca 840
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atcagatcat agttaaggag aagggtgtct tcaccaatgt gatttctcca acttccaaag 960
ccaagctgag attgttattt gaggttgctc ctttggggtt attggttgaa aaagctgggg 1020
gttacagtag tgatggtcat cggtctgtgc tagacaagga aataataaat cttgatgaca 1080
gaactcaagt tgcatatggt tccaagaatg agattatccg atttgaggaa actctatatg 1140
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<210> 4
<211> 1226
<212> DNA
<213> 人工合成(rengonghecheng)
<400> 4
tcgagctttc gcgagctcgg taccatggag actggtgtag catgctgtgc tcgtggggct 60
tacttacccg gtgtttccca gcattcaaaa gcttcagtgt ctccacagtc cattttccca 120
tcctttactg cgaggcgtct gaaatcaagc tcgctatttg gggagacgtt gcgcttcata 180
ccaagatcat cactaaaggt ttcaaaagca aaaaactctt cccttgtgac ccgatgtgaa 240
attggtgata gcctggaaga attccttgca aaggcaactc ctgataaggg actgattagg 300
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gccaacaacc ttctttttga ggctttgact cactcgcatt tctgcaaata tgcttgctct 480
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