阅读说明：本技术 一种基于育性差异蛋白的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730鉴定及应用 (Identification and application of CMS male sterility gene Ca06g18730 of pepper based on fertility differential protein ) 是由 柴伟国 裘劼人 忻雅 肖文斐 王淑珍 方献平 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于育性差异蛋白的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,本发明利用定量蛋白质组学技术鉴定到一种辣椒CMS性状相关的花药特异基因Ca06g18730,明确了不育系植株的花药从减数分裂四分体时期开始变异,造成花粉败育；通过VIGS技术沉默保持系辣椒Ca06g18730基因的表达,说明CA06g18730基因在花粉发育过程中起着关键作用,且CA06g18730基因下调为导致CMS不育系花粉败育的一个重要因素；利用VIGS技术沉默辣椒Ca06g18730基因表达,造成植株花粉败育,创制辣椒雄性不育材料,为辣椒育种提供新的材料。(The invention discloses a fertility differential protein-based pepper CMS male sterility gene Ca06g18730, the nucleotide sequence of which is shown in SEQ ID NO.1, the invention identifies a pepper CMS character-related anther specific gene Ca06g18730 by utilizing a quantitative proteomics technology, and confirms that the anther of a sterile line plant begins to mutate from a meiosis tetrad period to cause pollen abortion; the expression of the conservation line pepper Ca06g18730 gene is silenced by VIGS technology, which shows that the CA06g18730 gene plays a key role in the pollen development process, and the CA06g18730 gene is down-regulated to be an important factor causing CMS sterile line pollen abortion; the VIGS technology is utilized to silence the gene expression of the pepper Ca06g18730, so that the pollen of the plant is aborted, the pepper male sterile material is created, and a new material is provided for pepper breeding.)

一种基于育性差异蛋白的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730 鉴定及应用

技术领域

本发明属于辣椒育种技术领域，涉及辣椒花药育性差异蛋白的特异基因Ca06g18730及其应用。

背景技术

植物雄性不育（male sterility）是指植物花药不能产生正常有功能的花粉的现象，通常包括花药无法产生花粉、花粉败育和花药无法开裂等类型(Kaul 1988)。因雄性不育植株雄蕊无法产生有功能花粉，杂交过程无需去除雄蕊，节省了大量的人力、物力和财力，且因可避免植株的自花授粉从而为保证杂交一代的种子纯度提供了有力保障，为杂种优势（heterosis）在农业生产中的广泛应用提供了一个有效的途径。辣椒（Capsicumannuum L.）属茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum L.）作物，是我国第二大蔬菜作物，仅次于白菜。辣椒为常异花授粉蔬菜作物，其F1代杂种优势明显。1956年辣椒雄性不育现象首次由Martin在甜椒中发现，其后又发现了辣椒核质互作雄性不育现象（Peterson et al.,1958），目前辣椒雄性不育系已经在杂交制种中得到了广泛应用。用于杂种种子生产的辣椒雄性不育可分为细胞核雄性不育（Genetic male sterility, GMS）和细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility , CMS），前者主要来源于地方品种分离后代、X射线、γ射线和EMS处理后代等，后者主要来源于自然突变、诱变后代和种间杂交后代等。核雄性不育虽然遗传简单、 比较稳定、 转育容易，但在制种时需拔掉两用系内的可育株，导致其利用受到一定限制，国内有部分单位用这一方法制种。利用胞质雄性不育三系配套生产辣椒杂交种子，可以省去人工去雄、 隔离等人工成本，提高种子纯度, 同时有利于知识产权的保护等, 因此各国农业专家逐步重视对辣椒CMS的研究和利用。

花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，花粉发育的全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键。近年来，利用雄性不育系进行雄蕊和花粉发育研究、育性基因表达调控研究成为植物育种领域的研究热点。目前，仅有少数关于辣椒花粉发育相关基因被报道，因此仍需研究开发更多关于辣椒花粉发育相关基因，以用于创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。蛋白质组学技术作为当今生命科学的研究热点，已经成为生物学中破译基因功能和贡献于育种程序的重要途径。采用蛋白质组学技术对于影响植物性状的基因表达的直接产物－蛋白质进行筛选，是挖掘差异表达功能基因的更为直接有效的方法之一。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种基于育性差异蛋白的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730鉴定及应用。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的一种基于育性差异蛋白的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含权利要求1所述的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730的载体和重组菌。

所述的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730在调控辣椒花药育性中的应用。

所述的应用，其特征在于所述辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730在调控辣椒花药育性中的应用，包括以下步骤：

1）构建含有辣椒花药育性相关基因Ca06g18730的载体；

2）将所构建的辣椒花药育性相关基因Ca06g18730的载体瞬时转化到保持系辣椒中；

3）筛选得到花粉败育的转基因辣椒株系。

所述的应用，其特征在于所述载体为pTRV2-CA06g18730。

本发明具体通过以下实验加以实现：

通过对辣椒CMS植物的花药显微结构观测，确定不育发生的原因及时期。

本发明基于定量蛋白质组学的辣椒CMS性状相关蛋白筛选。筛选出在四分体期与小孢子期在辣椒保持系显著上调，而在不育系中含量几乎不变的胼胝质酶蛋白CA06g18730。

本发明辣椒CMS性状相关蛋白编码基因Ca06g18730的克隆及功能验证。根据差异蛋白CA06g18730编码基因的CDS序列，利用反向PCR技术进行了CA06g18730基因ORF全长克隆。根据CA06g18730基因同源区序列设计一对特异引物，构建CA06g18730基因病毒沉默载体和转化农杆菌，通过注射侵染辣椒植株叶片，观察花器官发育情况，确定基因功能。

沉默辣椒植株CA06g18730基因能够创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1）本发明利用定量蛋白质组学技术鉴定到一种辣椒CMS性状相关的花药特异基因Ca06g18730。通过对辣椒CMS植物的花药显微结构观测，明确了不育系植株的花药从减数***四分体时期开始变异，绒毡层细胞的过度液泡化，逐渐径向肥大，使得四分体被挤向药室中央且原生质体浓厚，四分体周围的胼胝质不能解体和然后逐渐解体，造成花粉败育。采用定量蛋白质组学方法对辣椒CMS不育系和保持系的不同时期花药蛋白进行筛选，筛选出在四分体期与小孢子期在辣椒保持系显著上调，而在不育系中含量几乎不变的胼胝质酶蛋白CA06g18730；

2）辣椒Ca06g18730基因全长2146bp，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

3）本发明通过VIGS技术沉默保持系辣椒Ca06g18730基因的表达，对沉默植株花粉活力等进行分析来鉴定CA06g18730基因在花粉发育中的功能，发现CA06g18730基因沉默植株与对照相比，仅能产生少量的异常花粉，且花粉不能萌发。说明CA06g18730基因在花粉发育过程中起着关键作用，且CA06g18730基因下调为导致CMS不育系花粉败育的一个重要因素；

4）利用VIGS技术沉默辣椒Ca06g18730基因表达，造成植株花粉败育，创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。

附图说明

图1为辣椒不育系和保持系的花形态，对比明确败育特征；

图2为辣椒不育系和保持系花药的石蜡切片电镜图，观察花粉败育原因及发生时期；

图3为pTRV2- CA06g18730载体构建流程；

图4为pTRV2- CA06g18730病毒载体EcoRI、BamHI双酶切检测，检查病毒沉默载体是否构建成功；

图5为VIGS注射白化辣椒植株生长状况；

图6为 VIGS沉默植株与保持系CA06g18730基因表达量比较；

图7为VIGS植株与对照植株花器官形态，检查花粉败育效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明做进一步详细描述，并给出具体实施例。

实施例1：辣椒CMS性状的花药显微结构观测

辣椒不育系DH-01-1-1A和保持系DH-01-1-1B于11月上旬在由杭州市农业科学研究院基地播种，次年3月上旬移栽入大棚，至4月上旬辣椒材料进入盛花期，观察不育系DH-01-1-1A的花药瘦小干瘪，无花粉散出，雌蕊发育正常，见图1。

在上午8:00—9:00将花蕾按从小到大分为6个不同时期采摘。然后,用镊子将花蕾中的花药剥离出备用。按从小到大选取五个不同时期的辣椒不育系花药做石蜡切片，于Leica DM1000显微镜下观察其发育过程的差异。结果发现，不育系植株的花药从减数***四分体时期开始，绒毡层细胞的过度液泡化，逐渐径向肥大，四分体周围的胼胝质不能解体，使得四分体被挤向药室中央且原生质体浓厚，最后逐渐解体，引起花粉败育，见图2。

实施例2：基于定量蛋白质组学的辣椒CMS性状相关蛋白筛选

取四分体期和小孢子期的不育系和保持系花药，通过定量蛋白质组技术筛选CMS性状相关的蛋白，具体包括以下步骤：

1）总蛋白提取及酶解：不育系和保持系各取2g花药样本在液氮下充分研磨成粉，各组样品分别加入粉末4倍体积裂解缓冲液（8 M尿素，1% TritonX-100，10 mM二硫苏糖醇和1%蛋白酶抑制剂），超声裂解。4℃，20000 g离心10min，取上清并加入终浓度为20%的三氯乙酸，4℃静置2h。4℃，12000 g离心3 min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤三次。最后沉淀用8M尿素复溶，利用BCA 试剂盒（碧云天，上海）进行蛋白浓度测定。

蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5 mM，56 °C还原30 min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11 mM，室温避光孵育15 min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2 M。以1:50的质量比例（胰酶：蛋白）加入胰酶，37 °C酶解过夜。再以1:100的质量比例（胰酶：蛋白）加入胰酶，继续酶解4 h。酶解的肽段用Strata X C18（Phenomenex，美国）除盐后真空冷冻干燥。

2）肽段标记及分级：以0.5 M 四乙基溴化铵溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2 h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。

肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18（5 μm粒径，4.6 mm内径，250 mm长）。操作如下：肽段分级梯度为8%-32%乙腈、pH 9，60 min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。

3）液相色谱-质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相（0.1% (v/v) 甲酸水溶液）溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1% 甲酸和2% 乙腈的水溶液；流动相B为含0.1% 甲酸和90% 乙腈的水溶液。液相梯度设置：0~26 min，7%-23%B；26~34 min，23%-35% B；34~37 min，35%-80% B；37~40min，80% B，流速维持在400 nL/min。

肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM质谱进行分析。离子源电压设置为2.0 kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800 m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100 m/z，Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描（DDA）程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用31%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制（AGC）设置为5E4，信号阈值设置为10000ions/s，最大注入时间设置为200 ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。

4）数据分析：二级质谱数据使用Maxquant (v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库为客户提供的数据库（34899条序列），添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率（FDR），并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20 ppm和5 ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02 Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。定量方法设置为TMT-6plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1%。

5）CMS不育相关差异表达蛋白筛选：质谱共鉴定到4400个蛋白质，其中3721个蛋白质包含定量信息。以1.5倍为差异倍数筛选阈值，t-test p-value<0.05为标准，筛选保持系四分体期与小孢子期有显著表达差异、而不育系中无显著差异的蛋白，结果共筛选到49个候选蛋白。其中CA06g18730蛋白为CMS性状相关蛋白，其表达量在辣椒保持系花蕾发育过程中显著上调，差异倍数达到1.88倍，而在不育系中含量几乎不变。生物信息学分析显示CA06g18730蛋白为一个胼胝质酶，在花粉发育过程中参与了细胞膜的解聚过程，与辣椒细胞质雄性不育中四分体小孢子的分离过程密切相关。

实施例3：辣椒CMS性状相关蛋白编码基因Ca06g18730的克隆及功能验证

结合生物信息学工具，根据差异蛋白的筛选结果获得对应编码基因的CDS序列，通过反向PCR技术克隆育性相关的Ca06g18730基因，并通过VIGS技术验证其在辣椒花药发育中功能，具体包括以下步骤：

1)Ca06g18730基因克隆：

根据差异蛋白的筛选结果获得CA06g18730编码基因的CDS序列，利用反向PCR技术进行了CA06g18730基因ORF全长克隆。

2)CA06g18730基因病毒沉默载体的构建：

根据保持系中CA06g18730基因同源区序列设计一对特异引物，引物序列如下：

EcoRI CA06g18730-F 5'-CCGGAATTCGCAAGCCGTCTGTATGCTTATGC-3'；

BamHI CA06g18730-R 5'-CGCGGATCCATGCTTGGTGCTGTCGCTGCATG-3'。

用于RT-PCR扩增保持系CA06g18730基因一段350bp的片段，然后将PCR产物和TRV2载体经EcoRI、BamHI双酶切后，回收酶切产物，并用T4连接酶（Takara，Japan）按照说明书将片段正向连接到TRV2载体的EcoRI-BamHI位点上（图1），并转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落至含有10μL ddH2O的PCR管中，轻轻混匀作为DNA模板，以pMD19-T载体通用引物M13F、M13R为PCR引物进行菌落PCR反应。挑取阳性克隆进行摇菌，并用TianGen质粒DNA小提试剂盒提取质粒，质粒经EcoRI、BamHI双酶切鉴定，构建好的载体命名为pTRV2-CA06g18730，见图3。对构建的pTRV2: CA06g18730病毒沉默载体用相应的酶进行双酶切，结果表明获得的目的片段在350bp左右，符合原定目标大小，见图4，说明病毒沉默载体已构建成功。

将pTRV1、pTRV2空载体、pTRV2-CA06g18730载体及pTRV2-PDS载体转化农杆菌感受态GV3101菌株，挑取单菌落进行菌落PCR，得到的阳性克隆摇菌备用。

3)CA06g18730基因沉默载体侵染辣椒：

包含pTRV1和TRV:CA06g18730的工程菌液及pTRV1和TRV:PDS的工程菌液被注射入辣椒植株叶片中。注射空载体（pTRV2）的野生不育系植株及野生保持系植株为本次试验的对照。在辣椒5～6片真叶时接种。首先含各个病毒载体的GV3101菌株单克隆在5mL含50 mg mL-1Kan，50 mg mL-1Rif 及50 mg mL-1Gen 3种抗生素的LB液体培养基（10 mg mL-1 酵母提取物，10 mg mL-1胰蛋白胨，5 mg mL-1 NaCl）中28℃摇菌，至其OD600值达到0.8～1.0。将菌株初始培养物按1：25比例稀释，于含对应抗生素及200μM乙酰丁香酮的诱导培养基（IM）中28℃培养至OD600达0.5～0.8。3000× g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用等体积的侵染缓冲液（10 mM MgCl2，10 mM MES，pH 5.7）悬浮，并调整OD600至一致。3000× g离心10min再次收集菌体，沉淀用1/2体积含400μM乙酰丁香酮的侵染缓冲液悬浮。将悬浮液在28℃条件下静置培养3h，然后将pTRV1菌株分别与pTRV2空载体、pTRV2-CA06g18730载体及pTRV2-PDS载体按1：1（V:V）比例混合，准备接种。每个植株接种4片叶子，将接种后的植株在18℃60%的相对湿度下黑暗培养2d，然后将培养条件改为25℃条件下培养，16h光照、8h黑暗交替培养。

所有的沉默植株均表现出正常的营养生长和生殖生长，注射TRV:PDS的植株在上部叶片中出现白化现象，新嫩叶呈现正常生长，见图5。为了检测CA06g18730基因在沉默植株中的表达情况，用特异引物进行qRT-PCR分析，引物与CA06g18730序列的结合区域在沉默片段以外。引物序列如下：

CA06g18730 F 5'-GTCCAGGGTCCATGTTAGT-3'；

CA06g18730 R 5'-TGCGGATGCTCCCAGCTCT-3'。

结果表明，相应的mRNA水平在TRV:CA06g18730沉默保持系植株中比对照（pTRV2）最高均可减少95%以上，见图6。

4）CA06g18730基因沉默植株的形态学观察

对于分子检测呈阳性的CA06g18730基因沉默植株及相应的空载体转化辣椒苗进行形态学观察，观察花器官发育情况。结果显示保持系对照空载体与保持系植株花粉饱满，见图7A、B，CA06g18730基因沉默植株与对照空载株相比，仅能产生少量的异常花粉，且花粉不能萌发，见图7C。在CA06g18730基因沉默植株中，花药极少，与不育系对照株花药形态相似，见图7D。由此说明CA06g18730基因在花粉发育过程中起着关键作用，且CA06g18730基因下调为导致CMS不育系花粉败育的一个重要因素。

序列表

<110> 杭州市农业科学研究院

<120> 一种基于育性差异蛋白的辣椒CMS雄性不育基因Ca06g18730鉴定及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2146

<212> DNA

<213> Capsicum annuum L.(辣椒)

<400> 1

cacgaggcga gtcaaaacaa ttgtgacgac gcctttcaag aaacattcga aacagtactc 60

taaacctcct ccacagccag agccaccacc tcctccacca aatatgtctc caccaccacc 120

accacaaatt gttaggccat tgttacagcc ttttctgttt ccaaaaacaa aatccactgt 180

ccttcctgaa ccatctcctt tttttgctca taacctctta tcaagtcctt tgcccacaaa 240

ttctttcttt cagaactttg ttttgaaaaa tggtgatcaa cctgaataca tccacccgta 300

tcttataaaa tcatcaaatt catctcttac tatttgttac ccacctcagt tccgtaatcc 360

ttcattcgtt taccagatat tcaatgctga tctcactatt tctatgttga ataatcctaa 420

tccgaatgca cctcatgtta tttcatcgtt tagcgatctt agcgtcacgt tagacctgcc 480

atctagtaac ctcaggttct ttcttgtcag gggatgtccc tttgttactt gtaatgtcat 540

tagtgatcct gttgcactta agatctctac aattcatgct attcttgaat gctcttggaa 600

tgctactctg accaaatata ctatcaagtt caacaatggc caaacatggc ttctgtacgc 660

gtcttcaccc atcaatttga gcaatgatat gaataatatc acttctaatg agttttcggg 720

tacaataagg atcgttcttt tgccaaattc cgactatgaa gcagttcttg atcagttcag 780

ttcttgttat cctaaatttg gtaatgcggt tttcagtcag ccattttgca tcgaatacaa 840

gtgggagaag actggttggg gagacttgtt gatgctggct catcctctgc atctccaact 900

gctctcggat cgtacaggta ttatcttgga ggattttaag tacaatagta ttgatggtga 960

gcttgttggc gttgttggag attcgtggct attgaagagt gatccgattt ctgtaacatg 1020

gcattcgatt gaaggtgtaa aggaggagga gtcttgttct gaaataattg atgctttgag 1080

caaggatgtc gcggacctga actcaacaac attaatctca acatcatcat catactttta 1140

tgggaagtta attgcaagag ctgcaaggct agcgttgata gccgaagagg tttcttaccc 1200

tgatgttatc ccaacaatcc gcaaattcct caaggataca attgaaccct ggttagatgg 1260

gactttcgaa gaaaatggtt tcttttatga ttcaaaatgg ggtggaatcg taactaaaca 1320

aggttcgcta gactctggtg ctgattttgg ctttggagta tttaatgatc accattacca 1380

cattggttat ttcctttatg ccattgcagt gcttgtcaag atagatccaa tgtggggaag 1440

aaagtacagg ccacaagcct attctcttat ggcagatttt atgaacttaa gcaggcgaga 1500

aaattcacac tatacgcggt tgagatgctt tgatttgtgg aaattgcatt cttgggcagg 1560

gggattaact gagtttgcag atggaaggaa ccaggagagc acaagtgaag cggtgaacgc 1620

gtactattca gcagctttaa tgggattggc atatggggac actcatcttg ttgccattgg 1680

atcaactctt tcggccatgg aggttcattc agcacaaact tggtggcatg ttaaagaaga 1740

aagcaacttg tatgcagagg aattcacgag aaataaccgt gtggtcggag ttctgtggtc 1800

taataaaagg gacagtggcc tttggtttgc tccatctgat tggaaagaat gtagacttgg 1860

tattcaggtt ttacctttat tgcctattac tgaagttgta ttttccgatg ctcggttcgt 1920

cagagagctg gtacaatgga caatgccagc tcttgcaaga caaggtgttg gagaagggtg 1980

gaaggggttt gtgtatgcgt tagaagggat gtatgataaa gcaagtgctt tggtgaaaac 2040

aagaagatta actggtttcg acgatggaaa ctcacttaca aatcttctat ggtggattca 2100

tactagaggt ggtgatggag cagaggaatg tgacaaaggg aacaat 2146