阅读说明：本技术 一种dna编码化合物库及其筛选方法 (DNA coding compound library and screening method thereof ) 是由 万飞 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种标准化、操作便捷的DNA编码化合物库系统,其在合成化合物的过程中加入DNA序列来标记反应,实现对每一个期望的化合物产物分子进行唯一编码,并且包含配套的标准化试剂,能够实现在用户本地即可完成目标化合物的筛选。本发明还提供了使用该DNA编码化合物库进行筛选目标靶点的标准化操作流程和方法,包括固载蛋白、DNA编码化合物选择性结合、PCR、测序、DNA解码信息分析等步骤,适用于亲水性靶蛋白的苗头化合物的筛选。(The invention provides a standardized DNA coding compound library system with convenient operation, which adds a DNA sequence to mark reaction in the process of synthesizing a compound, realizes unique coding of each expected compound product molecule, contains a matched standardized reagent and can realize that the screening of a target compound can be completed locally by a user. The invention also provides a standardized operation process and a method for screening target targets by using the DNA coding compound library, which comprises the steps of selective combination of immobilized protein and DNA coding compounds, PCR, sequencing, DNA decoding information analysis and the like, and is suitable for screening the seedling-end compounds of the hydrophilic target protein.)

一种DNA编码化合物库及其筛选方法

技术领域

本发明涉及DNA编码分子库技术领域，特别是涉及了一种DNA编码分子库及DNA编码分子库化合物的筛选方法。

背景技术

当代药物研发中，针对疾病的药物靶点，通过构建大型的候选药物分子库，进行高通量、大规模筛选是新药研发中不可或缺的手段。当今世界上主要的制药公司均拥有大型的分子库和大规模的筛选平台用于新药研发。然而，传统的分子库和筛选平台成本高昂、技术门槛高、管理运行复杂，成为高通量筛选发展和应用中的严重制约。

近年来，DNA编码分子库技术逐渐发展起来，成为药物研发中的新兴筛选方法。在DNA编码分子库中，每一个化合物与一个特异性的DNA链相连接，成为一个特异的条形码，实现对化合物的特异性编码。DNA编码分子库能够在极小的体系中，实现千万乃至上亿级的高通量筛选。筛选结果可以通过PCR扩增和DNA测序进行解码分析，已获得先导化合物用于进一步药物研发。近年来，DNA编码分子库已经得到新药研发领域中的广泛认可和应用，成为新药研发中的一种重要支撑技术。

使用DNA编码分子库进行药物筛选，所使用的靶点大多为纯化后的蛋白质。蛋白质靶点经修饰后，固载在磁珠之类的固相之上，再与分子库进行孵育。不能与靶点蛋白结合的小分子被洗脱，与结合在蛋白靶点上的小分子相分离。再在蛋白质变性条件下，对结合的小分子进行洗脱，PCR扩增，以及DNA测序，从而读出编码序列，获得与靶点结合的小分子的化学结构。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种经过标准化优化的，便捷的DNA编码分子库系统及其用于化合物筛选的标准化方法。使用本发明的DNA编码分子库系统及筛选方法，能够使用户在本地如小型实验室，即可实施DNA编码分子库技术筛选目标化合物更好更高效的筛选和分析目标化合物。

本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种DNA编码化合物库，其中对每一个期望的化合物产物分子进行唯一编码，其特征在于：在合成化合物的过程中加入DNA序列来标记反应，实现对每一个期望的化合物产物分子进行唯一编码。

进一步的，本发明的DNA编码化合物库，每管库试剂包含约1～5亿个化合物分子。

进一步的，本发明的的DNA编码化合物库，制备为冻干粉。

进一步的，本发明的DNA编码化合物库，其适用于亲水性靶蛋白的苗头化合物筛选。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，包含权利要求上述任一种所述的DNA编码化合物库。

进一步的，本发明的试剂盒，还包括磁珠、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、鲑鱼精DNA、扩增引物等试剂。

本发明的试剂盒，能够在用户本地，如小型或条件一般的实验室实施，便捷的实现目标化合物的筛选。优选的，进行亲水性靶蛋白的苗头化合物筛选。

另一方面，本发明还提供经标准化优化的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，使用本发明上述任一项的DNA编码化合物库，或使用上述任一项所述的试剂盒进行。

进一步的，本发明的DNA编码分子库的筛选方法，其包括以下步骤：

(1)：磁珠预处理：磁珠去除乙醇、用PBS缓冲液清洗，Washing buffer/Assaybuffer重悬磁珠；

(2)：固载蛋白：将带有His标签的蛋白加入磁珠管，低温混合，完成固载；

(3)：DNA编码化合物库选择性结合：将DNA编码化合物库冻干粉溶于Selectionbuffer或assay buffer，若选择assay buffer则外加适量sssDNA，含固载蛋白的磁珠弃液，将DNA编码化合物溶液加入含固载蛋白的磁珠中，低温混合；

(4)：洗涤，分离磁珠，弃掉液体部分，Washing buffer重悬磁珠，混匀、分离磁珠、弃液，重复清洗2-3次；

(5)：洗脱：Washing buffer重悬磁珠，水浴加热95℃左右，约20分钟，短暂离心，分离磁珠；

(6)：将洗脱液加入含固载蛋白的磁珠中，重复上述步骤(3)-(5)，重复筛选2-3轮；

(7)：收集的液体用于qPCR定量和PCR建库；

(8)：DNA电泳检测、回收DNA、测序；

(9)：DNA解码及信息分析；

所述Washing buffer/Assay buffer包含约50mM PBS、约0.5mM CHARPs、约10mMimidazole；所述Selection buffer包含约50mM PBS、约0.5mM CHRPs、约10mM imidazole、约0.1mg/ml sssDNA。

进一步的，本发明的筛选方法中，步骤(3)中低温混合具体为：4℃冰箱内3D旋转仪上混合约60分钟。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：DNA编码化合物冻干粉

在合成化合物的过程中加入DNA序列来标记反应，从而实现对每一个期望的化合物产物分子进行唯一编码。每管库试剂包含约1～5亿个化合物分子，并且提供三个包装规格。使用本领域常规的技术制备成冻干粉，得到本发明的DNA编码化合物冻干粉，其适用于亲水性靶蛋白的苗头化合物筛选。

实施例2：靶点筛选

1.磁珠预处理

加入1mg磁珠到1.5ml EP管，借助磁力架去除乙醇，加入1ml PBS buffer，混匀、磁力架吸附、弃液，重复清洗三次。600ul Washing buffer/Assay buffer重悬磁珠，分成四份，分别为300ul(用于固载蛋白)和100ul×3组(磁珠对照)。

2.固载蛋白

约80ug(或根据beads和蛋白结合比例计算)带有His标签的蛋白，加入300ul磁珠管，4℃冰箱内3D旋转仪上混合30分钟，完成固载(固载条件可根据实际情况调整)。磁力架分离磁珠和液体QC。磁珠用500ul Washing buffer/Assay buffer重悬，混匀、磁力架吸附，重复清洗三次QC，最后用300ul Washing buffer/Assay buffer重悬，分100ul×3组，置冰上备用。

3.T-DELs选择性结合

1支DNA Encoded Chemical Libraries冻干粉溶于100ul Selectionbuffer或assay buffer(外加0.1mg/ml sssDNA)。100ul含固载蛋白磁珠和100ul磁珠对照，分别上磁力架，弃液，分别加入100ul DNA Encoded Chemical Libraries溶液，4℃冰箱内3D旋转仪上混合60分钟(条件可根据实际情况调整)。

4.洗涤

借助磁力架分离磁珠，弃掉液体部分。500ul Washing buffer重悬磁珠，混匀、磁力架吸附、弃液，重复清洗三次。

5.洗脱

100ul Washing buffer重悬磁珠，水浴加热95℃20分钟。掌上离心机离心5秒，磁力架吸附磁珠，分别收集样品和对照组的液体部分QC。

两组液体各加入sssDNA，使其终浓度为0.1mg/ml)。

6.重复两轮筛选

第二轮重复：分别另取一管之前准备的100ul固载蛋白和100ul磁珠对照，磁力架吸附磁珠，弃掉液体部分，对应加入100ul第5步收集的两组液体，重复步骤3-步骤5。

第三轮重复：将第二轮收集的两组液体，流程同第二轮重复。洗涤最后一次用500PBS，洗脱缓冲液为50ul PBS，重悬，同第5步洗脱过程。收集的液体用于qPCR定量和PCR建库。

7.qPCR

收集每轮筛选洗脱液进行qPCR定量，详见下表分组：

建议qPCR程序：98℃3min；(98℃20s、68℃20s)30个循环；72℃10min；12℃保存。

8.建库

根据所选测序供应商提供测序端序列来合成建库引物。

引物序列:DNA编码两端的保守序列+测序端内测序列

PCR程序：同上

9.DNA电泳检测

取5ul PCR产物及DNA ladder上样，电泳分离

核酸染色，拍照

10.胶回收

按照试剂盒操作胶回收，同一批测序可回收到一个EP管(Ultra Pure)

11.DNA测序

根据三轮筛选后得到的化合物定量结果或PCR结果，乘以300倍测序深度为建议测序数据量，通常为1-10G。

12.样品保存

-80度冻存

13.DNA解码及信息分析。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。