阅读说明：本技术 动态人抗体轻链文库 (Dynamic human antibody light chain library ) 是由 罗培志 李艳 杜方勇 于 2017-08-21 设计创作，主要内容包括：本文提供含有多核苷酸的文库,其中所述多核苷酸中的一者编码具有特定高变区HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链。本文进一步提供含有编码多种独特抗体的多核苷酸的文库,其中各抗体包含重链可变区和轻链可变区。也提供与所述文库相关的抗体、多肽文库、载体文库、细胞、非人动物、抗体轻链、制备抗体文库的方法、试剂盒和产生双特异性抗体的方法。(Provided herein are libraries containing polynucleotides, wherein one of the polynucleotides encodes an antibody light chain having particular hypervariable regions HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3. Further provided herein are libraries comprising polynucleotides encoding a plurality of unique antibodies, wherein each antibody comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region. Also provided are antibodies, polypeptide libraries, vector libraries, cells, non-human animals, antibody light chains, methods of making antibody libraries, kits, and methods of producing bispecific antibodies related to the libraries.)

动态人抗体轻链文库

技术领域

本公开涉及含有编码抗体轻链(例如动态人抗体的轻链)的多核苷酸的文库以及与其相关的抗体轻链、抗体、细胞、动物、方法和试剂盒。

发明背景

单克隆抗体已变得极其适用于包括生物学研究、医学诊断和药物产品的广泛多种领域中。潜在结合特异性的可变性允许获得具有有价值的特异性和效能的抗体。然而，这个可变性使得在巨大数目的抗体之中进行筛选以鉴定一种或多种具有所需性质的抗体是困难的和繁重的。

一种鉴定目标抗体的方法是通过抗体文库诸如经克隆B细胞序列的文库、噬菌体展示文库、酵母展示文库等来进行筛选。这些文库允许在代表众多独特抗体序列的许多抗体之中进行筛选，以鉴定具有特定目标性质例如与特定靶标的结合、结合亲和力、选择性等的抗体。然而，当前文库具有特定限制。源于生物来源诸如人B细胞谱系的文库局限于可从所述来源克隆的那些抗体序列。相较于生物源性文库，合成文库可包括非天然存在的序列，但它们也受限于可在特定时间段合成的抗体的数量。此外，极其大型的文库需要更加耗时和更具消耗性的筛选方法；另外，文库中仅有一小部分可实际上被关于目标抗体加以筛选。

因此，存在对开发动态抗体文库的需要，所述文库含有一组用于设计和构建在功能上具有潜在更大相关性的动态抗体的具有明确确定的可开发序列概况的稳健动态单元。所述文库不仅将极大改进文库内抗体上的抗体结合位点的多样性，而且也将极大改进筛选具有在给定抗原上的新型和/或构象性表位的抗体的效率。此外，所述文库将使可能鉴定到具有高亲和力和可开发性概况的特定目标抗体的可能性增加。

本文引用的所有参考资料，包括专利申请、专利公布和UniProtKB/Swiss-Prot登录号，都以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像明确地和个别地指示将各个别参考资料以引用的方式并入一样。

发明内容

为满足以上需要和其他需要，本文公开允许获得动态人抗体的抗体序列，诸如轻链高变区(HVR)和轻链可变区(例如VL区)。这些序列被设计来允许获得具有高度柔性HVR序列环的抗体，所述抗体能够以高效能结合它们的靶标和/或识别多种适用表位，和/或与在不同物种之间以低序列同一性(约60％序列同一性或更小)共有的表位交叉反应。有利的是，这些抗体序列允许创建小得多，然而含有众多适用抗体的文库，和/或在给定文库大小下产生大得多的多样性。所述文库可用于鉴定对广泛范围的靶标具有特异性，或在一些情况下，与多种目标靶标交叉反应的新目标抗体。

因此，在一个方面，本文提供包含多核苷酸(例如合成多核苷酸)的文库，其中所述多核苷酸中的一者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，多核苷酸中的至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少十者、至少50者、至少100者、至少200者、至少250者、或280者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，多核苷酸中的每一者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的轻链，并且其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。

在一些实施方案中，多核苷酸含有HVR-L1序列、HVR-L2序列和HVR-L3序列的小于约1000种独特组合。在一些实施方案中，多核苷酸含有HVR-L1序列、HVR-L2序列和HVR-L3序列的约280种或更少种独特组合。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ IDNO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体轻链可变区的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的至少一者采用多种构象，如通过结构测定和/或计算建模所测定。在一些实施方案中，多核苷酸中的编码抗体轻链可变区的至少一者处于载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是展示载体。在一些实施方案中，多核苷酸中的编码抗体轻链可变区的至少一者处于细胞中。在一些实施方案中，细胞是细菌、酵母或哺乳动物细胞(例如非人动物细胞或经分离人细胞)。

在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、选自由SEQID NO:5-9组成的组HVR-L2序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(7)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(8)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(13)包含氨基酸序列SEQ IDNO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(16)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(17)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；和(18)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；和(11)包含氨基酸序列SEQID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。

在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的FW-L1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FW-L2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的FW-L3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的FW-L4。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:28-50组成的组的序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码全长抗体轻链。在一些实施方案中，文库进一步包含编码抗体重链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗体重链可变区的多核苷酸包括至少一种独特序列、至少100种独特序列、至少1000种独特序列、或至少约10⁹种独特序列。

在另一方面，本文提供包含编码多种独特抗体的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的文库，其中各抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述多种独特抗体中的各抗体的所述轻链可变区包含相同序列，并且包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ IDNO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQID NO:1的HVR-L1、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组HVR-L2序列和包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的HVR-L3；(7)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(8)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(16)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(17)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；和(18)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ IDNO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ IDNO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；和(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。

在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的FW-L1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FW-L2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的FW-L3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的FW-L4。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:28-50组成的组的序列。在一些实施方案中，文库中的抗体的重链可变区具有至少一种独特序列、至少100种独特序列、至少1000种独特序列、或至少约10⁹种独特序列。在一些实施方案中，文库的多核苷酸是合成多核苷酸。

在另一方面，本文提供包含由来自根据任何先前实施方案的文库的多核苷酸(例如合成多核苷酸)表达的多肽的抗体。在一些实施方案中，抗体以在约10^-7与约10^-11M之间的平衡解离常数(Kd)结合至少1种靶标。

在另一方面，本文提供包含多肽的文库，其中所述多肽中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少五者、至少10者、至少25者、至少50者、至少75者、至少100者、至少125者、至少150者、至少175者、至少200者、至少225者、至少250者、至少275者等)由根据任何先前实施方案的多核苷酸(例如合成多核苷酸)文库的多核苷酸编码。在一些实施方案中，多肽中的至少两者由多核苷酸文库的多核苷酸编码。在一些实施方案中，多肽中的至少100者由多核苷酸文库的多核苷酸编码。在一些实施方案中，多肽中的每一者由多核苷酸文库的多核苷酸编码。在一些实施方案中，至少一种多肽是轻链可变结构域。在一些实施方案中，至少一种多肽展示在噬菌体的表面上。在一些实施方案中，包含多肽的文库进一步包含至少一种重链可变结构域多肽。

在另一方面，本文提供包含载体的文库，其中所述载体中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少五者、至少10者、至少25者、至少50者、至少75者、至少100者、至少125者、至少150者、至少175者、至少200者、至少225者、至少250者、至少275者等)包含根据任何先前实施方案的多核苷酸文库的多核苷酸。在一些实施方案中，载体中的至少两者包含来自多核苷酸文库的多核苷酸。在一些实施方案中，载体中的至少100者包含来自多核苷酸文库的多核苷酸。在一些实施方案中，载体中的每一者包含来自多核苷酸文库的多核苷酸。在一些实施方案中，至少一种载体编码轻链可变结构域多肽。在一些实施方案中，包含载体的文库进一步包含编码重链可变结构域多肽的载体。本文也提供包含细胞群体的文库，其中至少一种(例如至少一种、至少两种、至少五种、至少10种、至少100种、至少10³种、至少10⁴种、至少10⁵种、至少10⁶种、至少10⁷种、至少10⁸种、至少10⁹种等)细胞包含根据任何先前实施方案的文库的载体。在一些实施方案中，细胞中的至少两者包含文库的载体。在一些实施方案中，细胞中的至少100者包含文库的载体。在一些实施方案中，细胞中的每一者包含文库的载体。在一些实施方案中，至少一种细胞是细菌、酵母或哺乳动物细胞(例如非人动物细胞或经分离人细胞)。

在另一方面，本文提供包含至少一种展示在它的表面上的多肽的噬菌体，其中所述至少一种多肽包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域进一步包含抗体重链可变区。

在另一方面，本文提供包含根据任何先前实施方案的多核苷酸文库的非人动物。在一些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、骆驼或非人灵长类动物)。在一些实施方案中，非人动物包含多核苷酸，其中所述多核苷酸中的一者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。

在另一方面，本文提供包含轻链可变区的抗体轻链，所述轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NOS:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(7)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ IDNO:18的HVR-L3；(8)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(16)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(17)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；和(18)包含选自由SEQID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ IDNO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含氨基酸序列SEQ IDNO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；和(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的FW-L1、含有氨基酸序列SEQ IDNO:25的FW-L2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的FW-L3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的FW-L4。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:28-50组成的组的序列。在一些实施方案中，轻链可变区的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的至少一者采用多种构象，如通过结构测定和/或计算建模所测定。

在另一方面，本文提供包含重链和轻链的抗体，其中所述轻链包含本文所述的轻链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ IDNO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NOS:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HVR-L1、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的HVR-L3；(7)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(8)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(16)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(17)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；和(18)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ IDNO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ IDNO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；和(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的FW-L1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FW-L2、含有氨基酸序列SEQID NO:26的FW-L3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的FW-L4。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:28-50组成的组的序列。在一些实施方案中，抗体以在约10^-7与约10^-11M之间的平衡解离常数(Kd)结合至少1种靶标。

在另一方面，本文提供一种编码任何本文所述的抗体轻链可变区的多核苷酸(例如合成多核苷酸)。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含任何本文所述的抗体轻链可变区的全长抗体轻链。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含任何本文所述的抗体轻链可变区的抗体。

在另一方面，本文提供一种包含抗体轻链可变区的文库，其中所述抗体轻链可变区中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少十者、至少50者、至少100者等)包含任何本文所述的抗体轻链可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，文库中的抗体轻链可变区中的每一者包含任何本文所述的抗体轻链可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，文库进一步包含一种或多种抗体重链可变区。在一些实施方案中，本文提供一种包含全长抗体轻链的文库，其中所述抗体轻链中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少十者、至少50者、至少100者等)包含任何本文所述的抗体轻链可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，文库中的抗体轻链中的每一者包含任何本文所述的抗体轻链可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，文库进一步包含一种或多种全长抗体重链。在一些实施方案中，本文提供一种包含抗体的文库，其中所述抗体中的至少一者(例如至少一者、至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少十者、至少50者、至少100者等)包含任何本文所述的抗体轻链可变区的氨基酸序列。在一些实施方案中，文库中的抗体中的每一者包含任何本文所述的抗体轻链可变区的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供制备文库的方法，所述方法包括提供以及组装根据任何先前实施方案的文库的多核苷酸序列。

在另一方面，本文提供制备抗体文库的方法，所述方法包括以下步骤：(a)选择一种、两种或三种包含具有多种构象的序列的轻链HVR；和(b)组装多核苷酸序列以产生编码多种抗体轻链可变区序列的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的文库。在一些实施方案中，抗体轻链可变区序列是人抗体序列。在一些实施方案中，抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ IDNO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组HVR-L2序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(7)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(8)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(16)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(17)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；和(18)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；和(11)包含氨基酸序列SEQID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的FW-L1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FW-L2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的FW-L3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的FW-L4。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:28-50组成的组的序列。在另一方面，本文提供包含抗原结合结构域的文库，其中所述抗原结合结构域中的一者包含抗体轻链可变区，所述抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域进一步包含抗体重链可变区。在一些实施方案中，抗体轻链可变区包含一种或多种根据任何以上实施方案的氨基酸序列。在一些实施方案中，文库包含噬菌体。在一些实施方案中，抗原结合结构域展示在文库的至少一种噬菌体的表面上。在一些实施方案中，文库包含表达展示在噬菌体表面上的根据任一以上实施方案的抗原结合结构域的多种噬菌体。

在另一方面，本文提供产生包含两个抗体重链可变区和两个相同轻链可变区的双特异性抗体的方法，所述方法包括：(a)筛选结合第一抗原的第一抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域包含第一抗体重链可变区和第一抗体轻链可变区，并且其中所述第一抗体轻链可变区由根据任何先前实施方案的文库的多核苷酸编码(例如所述第一抗原结合结构域包含第一抗体重链可变区和第一抗体轻链可变区，其中所述第一抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列)；(b)筛选结合第二抗原的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域包含第二抗体重链可变区和第二抗体轻链可变区，其中所述第二抗体轻链可变区与所述第一抗体轻链可变区具有相同序列(例如所述第二抗原结合结构域包含第二抗体重链可变区和第二抗体轻链可变区，其中所述第二抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列)；和(c)产生包含所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的双特异性抗体。

在另一方面，本文提供双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)包含第一重链可变区和第一轻链可变区的第一结合结构域，其中所述第一结合结构域结合第一靶标；(b)包含第二重链可变区和第二轻链可变区的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域结合第二靶标，其中所述第二轻链可变区具有与第一轻链可变区序列相同的序列；其中所述第一轻链可变区和所述第二轻链可变区中的每一者包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ IDNO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组HVR-L2序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(7)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(8)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；(12)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQID NO:23的HVR-L3；(13)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(14)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(15)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(16)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(17)包含选自由SEQID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；和(18)包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的HVR-L3；(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；(7)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(8)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；(9)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；(10)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQID NO:20的HVR-L3；和(11)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的FW-L1、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的FW-L2、含有氨基酸序列SEQ ID NO:26的FW-L3和含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的FW-L4。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:28-50组成的组的序列。在一些实施方案中，第一重链可变区连接于第一重链恒定区，其中第二重链可变区连接于第二重链恒定区，其中第一抗体轻链可变区连接于第一轻链恒定区，其中第二抗体轻链可变区连接于第二轻链恒定区，并且其中第一抗体轻链和第二抗体轻链具有相同序列。

在另一方面，本文提供包括根据任何先前实施方案的具有多核苷酸或包含多核苷酸的细胞群体的文库的试剂盒。

应了解，以上以及本文中所述的各种实施方案的一种、一些或全部性质可加以组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面将变得为本领域技术人员显而易知。本发明的这些和其他实施方案通过随后

具体实施方式

来进一步描述。

附图说明

图1A显示根据VL结构域的氨基酸的残基编号的熵图。人抗体的81个VL结构用于计算熵。

图1B显示对一示例性抗体轻链可变结构域(VL)序列(SEQ ID NO:60)的本文所用的高变区(HVR)的界定与对相同VL序列的互补决定区(CDR)的Kabat界定的比较。

图2A显示来自DPL5和SEL021抗体文库的经确认达成抗原结合的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3区段使用。对应于所指示SEQ ID NO的氨基酸序列可见于表1中。

图2B显示来自DPL5、SEL021和DPL16～34抗体文库的经确认与单一抗原靶标和多种抗原靶标进行抗原结合的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3区段使用。对应于所指示SEQID NO的氨基酸序列可见于表1中。

图3显示经确认与抗原TAGT-1、TAGT-2和TAGT-3结合的fab的亲和力测量结果。

具体实施方式

本公开提供含有编码抗体轻链(例如动态人抗体的轻链)的(例如非天然存在或合成)多核苷酸的文库。有利的是，本文公开的抗体轻链包括被设计来产生高度柔性环以达成更有效底物结合和/或针对多种目标底物的特异性的HVR序列。相比于现有技术，这些HVR序列被认为会允许创建较小抗体文库。

I.一般性技术

本文中描述或参考的技术和程序通常由本领域技术人员所充分了解，并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用，所述方法诸如像以下中描述的广泛利用的方法：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等人编,(2003))；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))；Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal CellCulture(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.LippincottCompany,1993)。

II.定义

在详细描述本发明之前，应了解本发明不限于毫无疑问可变化的特定组合物或生物系统。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。

除非内容另外明确规定，否则如本说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。因此，举例来说，提及“一个(种)分子”任选包括两个(种)或更多个(种)所述分子的组合，诸如此类。

如本文所用的术语“约”是指相应值的易于为本技术领域中的熟练人士所知的通常误差范围。在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关那个值或参数本身的实施方案。

应了解本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”方面和实施方案，“由方面和实施方案组成”，以及“基本上由方面和实施方案组成”。

术语“抗体”在本文中在最广泛意义上使用，并且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(例如单链可变片段或scFv)，只要它们展现所需生物活性即可。

基本4链抗体单元是一种由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链组成的异四聚糖蛋白。V_H和V_L一起配对形成单一抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和TristramG.Parslow(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。

来自任何脊椎动物物种的L链都可基于它们的恒定结构域的氨基酸序列而被指定为称为κ(“kappa”)和λ(“lambda”)的两种明确不同类型中的一者。视免疫球蛋白的重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列而定，免疫球蛋白可被指定为不同类别或同种型。存在免疫球蛋白的五个类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指定为α(“alpha”)、δ(“delta”)、ε(“epsilon”)、γ(“gamma”)和μ(“mu”)的重链。γ和α类别基于在CH序列和功能方面的相对微小差异而被进一步分为子类(同种型)，例如人表达以下子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的，并且一般地描述于例如Abbas等,Cellular and Molecular Immunology,第4版(W.B.Saunders Co.,2000)中。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指所述抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可被称为“V_H”。轻链的可变结构域可被称为“V_L”。这些结构域通常是抗体的最可变部分，并且含有抗原结合位点。

术语“如按照Kabat的可变结构域残基编号”或“如按照Kabat的氨基酸位置编号”及其变化形式是指Kabat等(上文)中汇编抗体时用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或向其中的插入的较少或额外氨基酸。举例来说，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，可通过在具有同源性的区域处将抗体序列与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。

Kabat编号系统通常在涉及可变结构域中的残基(近似是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时使用(例如Kabat等,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”通常在涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等(上文)中报道的EU索引)。“如按照Kabat的EU索引”是指对人IgG1 EU抗体的残基编号。

术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的相对于免疫球蛋白的含有抗原结合位点的其他部分即可变结构域具有更保守氨基酸序列的部分。恒定结构域含有重链的C_H1、C_H2和C_H3结构域(总称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。

与抗体片段相对比，术语“全长抗体”(术语“完整”抗体或“完全”抗体在本文中可互换使用)可指呈它的大致上完整形式的抗体。类似地，与抗体轻链片段相对比，术语“全长抗体轻链”(术语“完整”抗体轻链或“完全”抗体轻链在本文中可互换使用)可指呈它的大致上完整形式的抗体轻链。具体来说，完全抗体包括具有重链和轻链，包括Fc区的那些。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应物功能。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致上同质抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的个别抗体是相同的，例外之处是可少量存在的可能天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为从大致上同质抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例来说，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，所述技术包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow 等,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 101(34):12467-472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、以及用于在具有人免疫球蛋白基因座的各部分或全部或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人抗体或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

如本文所用，“高变区(HVR)”是指抗体结构域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。参见例如Xu等,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,Methods in MolecularBiology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。各VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个HVR和四个框架(FW)区组成：FW1-HVR1-FW2-HVR2-FW3-HVR3-FW4。在整篇本公开中，轻链的三个HVR被称为HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。为进行比较，对于图1B中所示的示例性抗体轻链可变结构域，使对HVR(如本文所用)的界定与对互补决定区(CDR)的Kabat界定(Yvonne Chen等(1999)“Selection and Analysis of an OptimizedAnti-VEGF Antibody:Crystal Structure of an Affinity-matured Fab in Complexwith Antigen”,J.Mol.Biol.293,865-881)进行对比。

如本文所用，“文库”是指一组两种或更多种具有共有类别的实体。举例来说，含有多核苷酸的文库可指一组两种或更多种多核苷酸。术语“文库”在本文中在最广泛意义上使用，并且明确涵盖可或可不加以组合的子文库。

如本文所用，“独特”是指某一组的某一成员不同于所述组的其他成员。举例来说，来自编码多种编码抗体的多核苷酸的文库的独特抗体可指具有不为由所述文库编码的其他抗体所共有的特定序列的抗体。实际上，应了解文库的实体性实现形式的“独特”成员可以超过一个拷贝存在。举例来说，文库可含有多种“独特”抗体，其中“独特”抗体分子中的一者或多者以超过一个拷贝存在。

如本文所用，“多样性”是指多样化和/或异质性。举例来说，文库中的抗体的多样性可指所述文库中存在多种具有独特序列的抗体。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，并且可指两个或更多个氨基酸的聚合物。

如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰核苷酸或碱基、和/或它们的类似物或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应来并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰核苷酸诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在，那么可在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸可包含在合成之后进行的修饰，诸如与标记的缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰诸如像具有不带电荷键联(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)以及具有带电荷键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧挂部分诸如像蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多L-赖氨酸等)的那些、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷基化剂的那些、具有经修饰键联(例如α端基异构核酸等)的那些；以及未修饰形式的多核苷酸。此外，任何通常存在于糖中的羟基都可例如由膦酸酯基团、磷酸酯基团置换，由标准保护基加以保护，或被活化以制备与额外核苷酸的额外键联，或可缀合于固体或半固体载体。5’和3’末端OH可加以磷酸化，或用胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分加以取代。其他羟基也可加以衍生以获得标准保护基。多核苷酸也可含有核糖或脱氧核糖的通常在本领域中是已知的类似形式，包括例如2’-O-甲基-核糖；2’-O-烯丙基-核糖；2’-氟-核糖或2’-叠氮基-核糖；碳环糖类似物；α-端基异构糖；差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖；吡喃糖；呋喃糖；景天庚酮糖；无环类似物以及无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可由替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯由P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中各R或R’独立地是H或任选含有醚(-O-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或未取代的烷基(1-20个C)。并非所有在多核苷酸中的键联都需要是相同的。先前描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“经分离”(诸如经分离多肽、核酸或细胞)是指分子已与它的自然环境的组分分离。

细胞(例如包含合成多核苷酸或合成多核苷酸的文库的细胞或细胞群体)或经分离细胞包括可为或已为用于并有多核苷酸插入物的载体的接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且所述子代可由于天然、偶然或故意突变而未必与原始亲本细胞完全相同(在形态方面或在基因组DNA互补方面)。宿主细胞包括在体内用多核苷酸(例如编码本公开的抗体轻链可变区的合成多核苷酸)转染的细胞。

“非人动物”是指不分类为人的任何动物，诸如家养动物、农场动物或动物园动物、运动动物、玩赏动物(诸如狗、马、猫、母牛等)以及研究中使用的动物。研究动物可不加限制地指代线虫、节肢动物、脊椎动物、哺乳动物、蛙、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、鱼(例如斑马鱼或河豚鱼)、鸟(例如鸡)、狗、猫以及非人灵长类动物(例如恒河猴、食蟹猴、黑猩猩等)。在优选实施方案中，动物是产生抗体的动物。

III.抗体文库以及文库的产生

本公开的某些方面涉及例如编码抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的多核苷酸的文库。本公开的文库可含有一种或多种编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区的多核苷酸，所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3各自独立地包含本文所述的HVR序列(例如表1中所示的HVR序列)。

在一些实施方案中，相比于典型抗体文库，本公开的文库含有较小数目的独特轻链HVR序列和/或独特VL序列。有利的是，所述文库可提供足以鉴定结合许多目标抗原中的一者或多者的抗体的多样性，同时由于文库大小降低，所以也允许达成更高效筛选。在一些实施方案中，本公开的文库包括以下或由以下组成：含有HVR-L1序列、HVR-L2序列和HVR-L3序列的小于约1000种、小于约900种、小于约800种、小于约700种、小于约600种、小于约500种、小于约400种、或小于约300种独特组合的多核苷酸。在某些实施方案中，本公开的文库包括以下或由以下组成：含有HVR-L1序列、HVR-L2序列和HVR-L3序列的约280种或更少种独特组合的多核苷酸。

在一些实施方案中，文库含有多种多核苷酸，其中所述多核苷酸中的至少一者编码本公开的抗体轻链可变区(例如包含本公开的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)。在一些实施方案中，多核苷酸中的一者或多者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少一者或至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQ ID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ ID NO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQ ID NO:10-23)。在一些实施方案中，多核苷酸中的至少2者、至少3者、至少4者、至少5者、至少6者、至少7者、至少8者、至少9者、至少10者、至少15者、至少20者、至少25者、至少30者、至少35者、至少40者、至少45者、至少50者、至少55者、至少60者、至少65者、至少70者、至少75者、至少80者、至少85者、至少90者、至少95者、至少100者、至少110者、至少120者、至少130者、至少140者、至少150者、至少160者、至少170者、至少180者、至少190者、至少200者、至少225者或至少250者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少一者或至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQ ID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ ID NO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQ ID NO:10-23)；和/或多核苷酸中的小于300者或小于或等于280者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少一者或至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQ ID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ IDNO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQ ID NO:10-23)。在某些实施方案中，文库的多核苷酸中的每一者编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少一者或至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQ ID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ ID NO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQ ID NO:10-23)。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸处于载体(例如表达载体或展示载体)中。

在一些实施方案中，文库中的多核苷酸编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中HVR-L1包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的序列。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸编码包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的抗体轻链可变区，其中HVR-L1包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的序列。

本文所述的轻链HVR序列可以任何组合包括在本公开的文库中。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。

在某些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3序列；选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；以及包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在某些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：包含氨基酸序列SEQID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ IDNO:14的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ IDNO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者。在一些实施方案中，轻链可变区包含表1中所列的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:28-50的序列或与选自SEQ ID NO:28-50的序列具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，轻链可变区进一步包含根据式：(FW-L1)-(HVR-L1)-(FW-L2)-(HVR-L2)-(FW-L3)-(HVR-L3)-(FW-L4)来并置在HVR之间的可变区轻链框架序列。在一些实施方案中，框架序列中的一者、两者、三者或四者是以下序列：

FW-L1是DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:24)

FW-L2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:25)

FW-L3是PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY(SEQ ID NO:26)

FW-L4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:27)。

在一些实施方案中，文库含有多种多核苷酸，其中所述多核苷酸中的至少一者编码抗体重链可变区(例如包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)。在一些实施方案中，文库含有编码抗体重链可变区的至少10³种、至少10⁴种、至少10⁵种、至少10⁶种、至少10⁷种、至少10⁸种、至少10⁹种、至少10¹⁰种、至少10¹¹种、或至少10¹²种独特序列的多种多核苷酸。在一些实施方案中，文库含有编码抗体重链可变区的至少10³种独特序列的多种多核苷酸。在一些实施方案中，文库含有编码抗体重链可变区的至少10⁹种独特序列的多种多核苷酸。在其他实施方案中，文库含有编码一种抗体重链可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，文库含有编码抗体重链可变区的1至约10³种独特序列的多种多核苷酸。

在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸编码全长抗体轻链。在其他实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸编码轻链Fab片段。在一些实施方案中，文库的一种或多种多核苷酸编码单链可变片段。

在一些实施方案中，文库含有编码多种独特抗体的多种多核苷酸。在一些实施方案中，各抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，多种独特抗体中的各抗体的轻链可变区包含相同序列，并且包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的至少一者或至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQ ID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ ID NO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQ ID NO:10-23)。本文所述的轻链HVR序列可以任何组合包括在本公开的文库中，所述文库也包括编码一种或多种重链可变区的多核苷酸。

在一些实施方案中，本公开的文库包括一种或多种编码一种或多种本公开的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的载体。举例来说，在一些实施方案中，文库包括一种或多种编码一种或多种编码抗体轻链可变区的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的载体，其中所述抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中所述抗体轻链可变区的所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的HVR-L2序列和选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的HVR-L3序列。

本文进一步提供一种例如通过提供以及组装本公开的文库的多核苷酸序列(例如合成多核苷酸)来制备文库的方法。本文进一步提供一种例如通过以下方式来制备文库的方法：选择一种、两种或三种包含具有多种构象的序列的轻链HVR(例如一种、两种或三种本公开的轻链HVR)，以及组装多核苷酸序列以产生编码多种抗体轻链可变区序列的多核苷酸(例如合成多核苷酸)的文库。在一些实施方案中，抗体轻链可变区序列是人抗体序列。在一些实施方案中，抗体轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且所述HVR-L1、所述HVR-L2和所述HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ ID NO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQID NO:10-23)。

在一些实施方案中，抗体轻链可变区的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的至少一者采用多种构象。在一些实施方案中，多种构象可使用本领域中已知的技术来测定或检测，所述技术包括不限于结构测定(例如X射线晶体照相术或NMR)和/或计算建模。

可将编码一组抗体轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸克隆至任何适合载体中以表达一部分或整个轻链或重链序列。在一些实施方案中，克隆至载体中的多核苷酸允许产生融合于病毒外壳蛋白的全部或一部分(即产生融合蛋白)，并且展示在粒子或细胞的表面上的一部分或整个轻链或重链序列。若干类型的载体是可用的，并且可用于实施本发明，例如噬菌粒载体。噬菌粒载体通常含有多种组分，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制起点位点以及如为本领域普通技术人员所知的其他必需组分。在一些实施方案中，可将编码一组抗体轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸克隆至载体中以在细菌细胞中表达来达成细菌展示，或在酵母细胞中表达来达成酵母展示。示例性载体描述于美国授予前公布号US20160145604中。在一些实施方案中，载体是展示载体，所述载体从5’至3’包含编码待展示在表面(例如噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞的表面)上的氨基酸序列的多核苷酸、限制位点、编码能够展示在所述表面上的表面肽的第二多核苷酸、以及第二限制位点。在一些实施方案中，第二多核苷酸编码噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白、细菌外膜蛋白、细胞表面栓系结构域、或衔接物、或其截短形式或衍生物。在某些实施方案中，第二多核苷酸是丝状噬菌体M13的基因III或其截短形式或衍生物。在一些实施方案中，表面肽用于噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或哺乳动物展示、或在其之间的穿梭展示。在一些实施方案中，当表达时，氨基酸序列和表面肽以融合蛋白形式展示在表面上。在一些实施方案中，载体进一步包含在第一限制位点的5’或在第二限制位点的3’的融合标签。

本公开的某些方面涉及一种含有本文所述的载体的细胞群体。可使由通过任何本文所述的技术或其他适合技术产生的多核苷酸编码的抗体轻链和/或重链表达，并且加以筛选以鉴定具有所需结构和/或活性的抗体。抗体的表达可例如使用无细胞提取物(例如核糖体展示)、噬菌体展示、原核细胞(例如细菌展示)或真核细胞(例如酵母展示)来进行。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。用于转染细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞的方法在本领域中是已知的，并且描述于本文引用的参考文献中。以下更详细描述在这些细胞类型中(例如从本公开的文库)表达多肽(例如抗体链)以及筛选目标抗体。

或者，多核苷酸可在诸如由Pluckthun和Skerra所述的大肠杆菌(E.coli)表达系统中表达。(Meth.Enzymol.,1989,178:476；Biotechnology,1991,9:273)。可表达突变蛋白质以达成分泌在培养基中和/或分泌在细菌的细胞质中，如由Better和Horwitz,Meth.Enzymol.,1989,178:476所述。在一些实施方案中，使编码VH和VL的单结构域各自连接于编码信号序列诸如ompA、phoA或pelB信号序列的序列的3′末端(Lei等,J.Bacteriol.,1987,169:4379)。这些基因融合物组装在双顺反子构建体中，因此，它们可从单一载体表达，并且分泌至大肠杆菌的周质间隙中，在所述周质间隙中，它们将再折叠，并且可以活性形式加以回收。(Skerra等,Biotechnology,1991,9:273)。举例来说，抗体重链基因可与抗体轻链基因并行表达以产生抗体或抗体片段。

在其他实施方案中，使用如例如US20040072740；US20030100023；和US20030036092中所述的分泌信号和脂质化部分，抗体序列在原核生物例如大肠杆菌的膜表面上表达。

或者，抗体可通过如例如Jeong等,PNAS,2007,104:8247中所述的锚定周质表达(APEx双杂交表面展示)，或通过如例如Mazor等,Nature Biotechnology,2007,25:563中所述的其他锚定方法来表达和筛选。

高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞，例如骨髓瘤细胞(例如NS/0细胞)、杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾(HEK)细胞，也可用于表达本公开的抗体。通常，在哺乳动物细胞中表达的抗体被设计来分泌至培养基中，或在细胞的表面上表达。抗体或抗体片段可例如以完整抗体分子形式或以个别VH和VL片段、Fab片段、单结构域形式或以单链形式(scFv)产生。

在其他实施方案中，抗体可使用哺乳动物细胞展示来选择(Ho等,PNAS,2006,103:9637)。在一些实施方案中，如在以上所述以及在以下所例示，可在例如使用噬菌体展示来产生融合于病毒外壳蛋白的全部或一部分(即产生融合蛋白)，并且展示在粒子或细胞的表面上的一部分或整个轻链或重链序列之后，对抗体进行选择。

本公开的某些方面涉及一种包含本公开的多核苷酸文库的非人动物。举例来说，本公开的非人动物可被修饰，以致它的基因组包括编码本公开的轻链可变区的多核苷酸。在一非限制性实例中，产生包括被修饰来表达一种或多种本公开的轻链可变区的轻链免疫球蛋白基因座(例如VL基因座)的转基因小鼠。在一些实施方案中，转基因动物(例如小鼠)表达由多核苷酸编码的抗体或轻链。用于修饰非人动物的一个或多个免疫球蛋白基因座的技术在本领域中是已知的(例如用于产生Xenomouse^TM的方法)。

对源于本公开的文库的抗体的筛选可通过本领域中已知的任何适当手段来进行。举例来说，可通过标准免疫测定和/或亲和色谱法来评估结合活性。关于催化功能例如蛋白水解功能来对本发明的抗体进行的筛选可使用标准测定例如血红蛋白斑块测定来实现。测定抗体对靶标的结合亲和力可使用多种熟知技术来在体外测定，所述技术例如BIACORE^TM仪器，所述仪器基于表面等离子体共振来测量抗体对给定靶标或抗原的结合速率；或生物层干涉测量术(BLI)，如以下使用ForteBioRED96平台(Pall Life Sciences)所例示。体内测定可使用许多动物模型中的任一者来进行，接着在适当时在人中加以随后测试。也涵盖基于细胞的生物测定。抗体或抗原结合片段可关于功能活性例如拮抗剂或激动剂活性加以进一步选择。本文描述示例性筛选方法。举例来说，在一些实施方案中，通过用人IgG1-Fc标签对抗原加标签以及通过抗hIgG-Fc捕集(AHC)生物传感器来捕集，使用BLI测量fab片段与一种或多种靶标之间的结合亲和力。Fab可在它们的CH1结构域的C末端用His6标签加标签，在宿主细胞诸如大肠杆菌中过度表达，并且例如使用Ni-NTA树脂加以纯化。亲和力可接着使用AHC传感器(抗人IgG-Fc捕集浸渍和读取生物传感器)来测量，所述AHC传感器被浸渍至含有用动力学缓冲液例如稀释至5-10μg/mL的纯化fab的孔中。

在通过与靶标或抗原的结合和/或功能性测定来鉴定结合剂之后，可提取核酸。所提取DNA可接着直接用于转化大肠杆菌宿主细胞，或者，可例如使用PCR以适合引物来扩增编码序列，并且通过任何典型测序方法来测序。可对结合剂的可变结构域DNA进行限制酶消化，接着插入载体中以进行蛋白质表达。

IV.抗体以及抗体产生

本文提供从本文所述的文库鉴定和选择的抗体。本公开的某些方面涉及抗体轻链HVR或重链HVR、包含所述HVR的可变区、和/或编码所述HVR或所述可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，HVR和/或可变区是抗体片段、全长抗体、或单链可变片段(scFv)的一部分。

在一些实施方案中，轻链可变区包含下表1中所列的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列中的一者、两者或三者。

表1：轻链HVR序列

在一些实施方案中，轻链可变区包含下表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者。

表2：轻链HVR序列的组合

在一些实施方案中，本文提供一种具有包含本公开的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的轻链可变区的抗体轻链。在一些实施方案中，HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的至少两者包含选自以下的氨基酸序列：本公开的HVR-L1序列(例如SEQ ID NO:1-4)、本公开的HVR-L2序列(例如SEQ ID NO:5-9)和本公开的HVR-L3序列(例如SEQ ID NO:10-23)。

本文所述的轻链HVR序列可以任何组合包括在本公开的抗体轻链或轻链可变区中。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1，并且抗体的HVR-L2包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1和抗体的含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、含有选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和含有选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3。在某些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3序列；选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:9的HVR-L2和包含选自由SEQ ID NO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含选自由SEQ IDNO:10-23组成的组的氨基酸序列的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的氨基酸序列的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-L3；包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；以及包含选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的氨基酸序列的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3。在某些实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者：包含氨基酸序列SEQID NO:2的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ IDNO:14的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的HVR-L3；以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的HVR-L3；以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ IDNO:11的HVR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区包含表2中所列的抗体的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者。在一些实施方案中，轻链可变区包含表1中所列的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中的三者。在一些实施方案中，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:28-50的序列。

在一些实施方案中，轻链可变区进一步包含根据式：(FW-L1)-(HVR-L1)-(FW-L2)-(HVR-L2)-(FW-L3)-(HVR-L3)-(FW-L4)来并置在HVR之间的可变区轻链框架序列。在一些实施方案中，框架序列中的一者、两者、三者或四者是以下序列：

FW-L1是DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:24)

FW-L2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:25)

FW-L3是PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY(SEQ ID NO:26)

FW-L4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:27)。

在一些实施方案中，本文进一步提供一种包含重链和轻链的抗体，其中所述轻链包括本公开的轻链可变区。在一些实施方案中，本文进一步提供一种包含本公开的重链可变区和轻链可变区的抗体片段或scFv。

在一些实施方案中，本公开的抗体或抗体片段以特定结合亲和力结合至少1种靶标(例如靶标蛋白质或表位)或至少两种靶标。举例来说，在一些实施方案中，本公开的抗体或抗体片段以约10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小、10^-10M或更小、或10^-11M或更小的平衡解离常数(Kd)结合至少1种靶标或至少两种靶标。在一些实施方案中，本公开的抗体或抗体片段以在约10^-7与约10^-11M之间的平衡解离常数(Kd)结合至少1种靶标或至少两种靶标。用于测定结合亲和力的示例性测定在下文描述和例示。

本公开的抗体可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物来产生。在一些实施方案中，提供编码本文所述的任何抗体的经分离核酸。所述核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，本文提供一种或多种包含所述核酸的载体(例如表达载体或展示载体)。在一些实施方案中，提供一种包含所述核酸的宿主细胞。在一个所述实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供一种制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养如上提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

对于重组产生本公开的抗体，分离编码例如如上所述的抗体的核酸，并且插入一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。所述核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来分离和测序。

适于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。举例来说，抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。)在表达之后，可从于可溶性部分中的细菌细胞糊状物分离抗体，并且可进一步纯化。

除原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)以及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞也源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定可与昆虫细胞联合使用的众多杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(所述专利描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可用作宿主。举例来说，适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为适用的。适用哺乳动物宿主细胞系的其他实例是通过SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7)；人胚肾株系(293或293细胞，如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell)(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他适用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。

具有相同/共同/单种轻链的双特异性抗体

本文进一步提供一种具有本公开的相同轻链可变区(例如具有两个具有不同结合特异性的重链可变区和两个相同轻链可变区)的双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个抗体重链可变区和两个相同轻链可变区，其中双特异性抗体包括：结合第一靶标或抗原，并且包含第一抗体重链可变区和第一轻链可变区的第一结合结构域；以及结合第二靶标或抗原，并且包含第二抗体重链可变区和第二抗体轻链可变区的第二结合结构域；其中所述第二抗体轻链可变区具有与第一抗体轻链可变区序列相同的序列。在一些实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域结合不同靶标生物分子。在某一实施方案中，第一结合结构域和第二结合结构域结合同一生物分子上的不同表位。在一些实施方案中，第一抗体重链可变区是包含第一重链可变区和第一重链恒定区(例如包含CH1、铰链、CH2和CH3)的第一抗体重链的一部分。在一些实施方案中，第二抗体重链可变区是包含第二重链可变区和第二重链恒定区(例如包含CH1、铰链、CH2和CH3)的第二抗体重链的一部分。在一些实施方案中，第一抗体轻链可变区是包含第一轻链可变区和第一轻链恒定区的第一抗体轻链的一部分。在一些实施方案中，第二抗体轻链可变区是包含第二轻链可变区和第二轻链恒定区的第二抗体轻链的一部分。在一些实施方案中，第一抗体轻链和第二抗体轻链具有与本公开的轻链相同的序列。

本文进一步提供一种产生具有本公开的相同轻链可变区(例如具有两个具有不同结合特异性的重链可变区和两个相同轻链可变区)的双特异性抗体的方法。在一些实施方案中，方法包括选择结合第一抗原，并且包含本公开的第一抗体重链可变区和第一轻链可变区的第一抗原结合结构域；(b)选择结合第二抗原，并且包含本公开的第二抗体重链可变区的第二抗原结合结构域，其中第二抗体轻链可变区具有与第一抗体轻链可变区序列相同的序列；和(c)产生包含含有所述第一抗体重链可变区的氨基酸序列的重链可变区、含有所述第二抗体重链可变区的氨基酸序列的重链可变区、含有所述第一抗体轻链可变区序列的氨基酸序列的轻链可变区、以及含有所述第二抗体轻链可变区序列的氨基酸序列的轻链可变区的双特异性抗体。在一些实施方案中，第一轻链可变区由来自本公开的文库的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体可具有额外特异性。举例来说，双特异性抗体的一个抗原或靶标结合位点可特异性结合超过一种靶标。

用于制备/产生双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。对全长双特异性抗体的产生可基于共同表达两对免疫球蛋白重链-轻链，其中两个链具有不同特异性(Millstein等,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，所以这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确双特异性结构。通常通过亲和色谱法步骤进行的对正确分子的纯化是相当麻烦的，并且产物产率低下。类似程序公开于WO 93/08829中以及Traunecker等,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。

本领域中已知的一种用于制备双特异性抗体的方法是“钮入孔(knobs-into-holes)”或“突起入空腔(protuberance-into-cavity)”方法(参见例如美国专利号5,731,168)。在这个方法中，两种免疫球蛋白多肽(例如重链多肽)各自包含界面。一种免疫球蛋白多肽的界面与另一免疫球蛋白多肽上的相应界面相互作用，由此允许两种免疫球蛋白多肽进行缔合。这些界面可被工程改造以使位于一种免疫球蛋白多肽的界面中的“钮”或“突起”(这些术语在本文中可互换使用)与位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“孔”或“空腔”(这些术语在本文中可互换使用)相对应。在一些实施方案中，孔与钮具有相同或类似尺寸，并且被适合地定位以使当两个界面相互作用时，一个界面的钮可位于另一界面的相应孔中。在不希望束缚于理论下，这被认为使异多聚体稳定，并且有利于超过其他种类例如同多聚体来形成异多聚体。在一些实施方案中，这个方法可用于促进两种不同免疫球蛋白多肽的异多聚化，从而产生包含两种对不同表位具有结合特异性的免疫球蛋白多肽的双特异性抗体。

在一些实施方案中，钮可通过用较大侧链替换小氨基酸侧链来构建。在一些实施方案中，孔可通过用较小侧链替换大氨基酸侧链来构建。钮或孔可存在于原始界面中，或它们可被合成引入。举例来说，钮或孔可通过改变编码界面的核酸序列以用至少一个“输入”氨基酸残基替换至少一个“原始”氨基酸残基来合成引入。用于改变核酸序列的方法可包括本领域中熟知的标准分子生物学技术。在一些实施方案中，原始残基具有小侧链体积(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸)，并且用于形成钮的输入残基是天然存在的氨基酸，并可包括精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，原始残基具有大侧链体积(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)，并且用于形成孔的输入残基是天然存在的氨基酸，并可包括丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。

在一些实施方案中，基于异多聚体或同多聚体(例如同二聚体)的三维结构来鉴定用于形成钮或孔的原始残基。本领域中已知的用于获得三维结构的技术可包括X射线晶体照相术和NMR。在一些实施方案中，界面是免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)恒定结构域的CH3结构域。在这些实施方案中，人IgG₁的CH3/CH3界面涉及在各结构域上位于四个反平行β链上的十六个残基。在不希望束缚于理论下，突变残基优选位于两个中心反平行β链上以使钮可被周围溶剂而非配偶体CH3结构域中的补偿性孔容纳的风险最小。在一些实施方案中，两种免疫球蛋白多肽中形成相应钮和孔的突变对应于下表中提供的一对或多对。

表3：示例性的各组相应钮和孔形成突变

第一免疫球蛋白的CH3	第二免疫球蛋白的CH3
		T366Y	Y407T
T366W	Y407A
		F405A	T394W
Y407T	T366Y
		T366Y:F405A	T394W:Y407T
T366W:F405W	T394S:Y407A
		F405W:Y407A	T366W:T394S
F405W	T394S

突变通过以下方式来表示：原始残基，继之以使用Kabat编号系统的位置，接着是输入残基(所有残基都以单字母氨基酸代码给出)。多个突变由冒号分隔。

在一些实施方案中，免疫球蛋白多肽包含含有一个或多个在上表3中所列的氨基酸取代的CH3结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白多肽，所述第一免疫球蛋白多肽包含含有一个或多个在表3的左列中所列的氨基酸取代的CH3结构域；和第二免疫球蛋白多肽，所述第二免疫球蛋白多肽包含含有一个或多个在表3的右列中所列的相应氨基酸取代的CH3结构域。

在如上所讨论使DNA突变之后，编码具有一个或多个相应钮或孔形成突变的经修饰免疫球蛋白多肽的多核苷酸可使用本领域中已知的标准重组技术和细胞系统来表达和纯化。参见例如美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；美国公布号2013/0089553；以及Spiess等,Nature Biotechnology 31:753-758,2013。经修饰免疫球蛋白多肽可使用原核宿主细胞诸如大肠杆菌、或真核宿主细胞诸如CHO细胞来产生。可以共培养方式在宿主细胞中表达相应钮和孔携带性免疫球蛋白多肽，并且以异多聚体形式一起纯化，或它们可以单培养方式表达，分别纯化，并且在体外组装。在一些实施方案中，使用本领域中已知的标准细菌培养技术来共培养两种细菌宿主细胞菌株(一种表达具有钮的免疫球蛋白多肽，并且另一种表达具有孔的免疫球蛋白多肽)。在一些实施方案中，两种菌株可以特定比率混合例如以便在培养时实现相等表达水平。在一些实施方案中，两种菌株可以50:50、60:40或70:30比率混合。在多肽表达之后，可使细胞一起溶解，并且可提取蛋白质。本领域中已知的允许测量同多聚种类相对于异多聚种类的丰度的标准技术可包括尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，使用标准重组技术来分别表达各经修饰免疫球蛋白多肽，并且它们可在体外一起组装。组装可例如通过以下方式来实现：纯化各经修饰免疫球蛋白多肽，以相等质量将它们一起混合和孵育，使二硫化物还原(例如通过用二硫苏糖醇处理)，浓缩，以及使多肽再氧化。形成的双特异性抗体可使用包括阳离子交换色谱法的标准技术来纯化，并且使用包括尺寸排阻色谱法的标准技术来测量。对于这些方法的更详细描述，参见Speiss等,Nat Biotechnol31:753-8,2013。在一些实施方案中，经修饰免疫球蛋白多肽可分别在CHO细胞中表达，并且使用上述方法来在体外组装。

V.试剂盒

在另一方面，本文提供一种包括本公开的多核苷酸的文库的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括包装插页，所述包装插页包含关于表达、修饰、筛选或以其他方式使用文库例如以鉴定目标抗体HVR或可变区的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括一种或多种例如用于储存、转移、转染或以其他方式使用一种或多种多核苷酸(例如合成多核苷酸)的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括一个或多个用于储存一种或多种多核苷酸的容器。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括一种或多种例如用于用一种或多种多核苷酸来转染宿主细胞的载体。

实施例

通过参照以下实施例，本发明将得以更充分了解。然而，实施例不应解释为限制本公开的范围。应了解本文所述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且根据其的各种修改或变化将为本领域技术人员所想起，并将包括在本申请的精神和界限以及随附权利要求的范围内。

实施例1：鉴定高变区上动态基序的最小集合

为在结构水平上了解抗体可变结构域的可变性，开发了用以绘制抗体可变结构域的几何比对，并且此外，用以基于几何比对来计算结构和序列熵的算法。采用这种方法使得通过明确确定的V(D)J重组过程来确定的抗体多样性的经典理论与来自动态单元的构象多样性(由Linus Pauling提出的模板引导的构象选择；参见例如James,L.和Tawfik,D.“Conformational diversity and protein evolution–a 60-year-old hypothesisrevisited”,Trends Biochem Sci.2003年7月；28(7):361-8)组合联用以允许通过选择和改适抗体结合位点来对几乎无限的表位空间进行取样。作为一实例，这个算法用于分析人抗体可变轻链结构域的81个高分辨率晶体结构的结构和序列可变性。计算并绘制可变轻链结构域的每个位置的熵(图1A；结构熵用粗线表示，序列熵用点线表示)。通过基于几何比对来计算结构和序列熵所获得的结果用于定位高变(HVR)区，以及用于鉴定这些可变区上的关键位置。为进行比较，鉴定一示例性抗体轻链可变结构域序列的HVR(如通过上述方法所界定)和CDR(如由Kabat所界定)(图1B)。

引起关注的是，如通过结构比对所评估的可变性通常低于以序列比对所观察到的可变性。尽管如通过结构比对所评估的可变性通常较低，但存在具有显著结构变化的许多位点/区域，从而表明这些可变位点可在抗体功能方面起关键作用。此外，那些高变区中的一些显示伴有多种构象的高柔性。对具有高度可变残基的区域的鉴定给出了抗体可变结构域的保守性和可变性的更全面图景，所述图景可在新抗体设计中加以利用。对动态基序的鉴定使得有可能以降低数目的氨基酸序列涵盖广泛范围的结构多样性。这个抗体设计方法的惊人优势是更加有限数目的动态基序可在可变区中用于涵盖广泛范围的抗体结构多样性，并且在这些抗体中提供可允许结合多种目标抗原的广泛柔性。因此，使用不变残基的单一人种系或种系源性序列构建了普通轻链文库(称为DL280)，同时有限数目的动态基序用于高变区以捕集在可变区HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3中鉴定的广泛范围的结构可变性。

实施例2：构建普通轻链文库

构建轻链文库DL280

为开始构建DL280轻链文库，合成了20种编码HVR-L1序列和HVR-L2序列(表1)的20种组合的小型基因。接着将合成的小型基因用PvuI和BamHI消化，并且连接至用相同的两种限制酶消化的靶标载体Fad22中。将连接混合物转化至DH10B细胞中，纯化20种构建体，并且验证序列以进行下一阶段构建。

设计和合成总计14对编码14种HVR-L3序列(表1)的寡聚物。在PCR机器中采用以下设置来进行寡聚物退火：95℃持续3分钟，接着是35个循环(各循环持续15秒)，所述循环在95℃下开始，每个循环使温度降低1℃。在退火之后，各对用PstI和Acc65I个别地加以消化，并且个别地连接至以上提及的20种用相同的两种限制酶消化的构建体中。将连接混合物个别地转化至DH10B细胞中，纯化所得280种构建体，定量，并且验证序列。对应于这280种构建体的HVR-L1区、HVR-L2区和HVR-L3区的序列列于表2中。此外，这280种构建体各自共有相同框架区，即FW-L1(SEQ ID NO:24)、FW-L2(SEQ ID NO:25)、FW-L3(SEQ ID NO:26)和FW-L4(SEQ ID NO:27)。等量混合280种构建体中的每一者以进行文库构建。

将280种质粒的以上提及的混合物用PvuI和Acc65I消化，并且连接至也用相同的两种限制酶消化的噬菌粒载体Fad40中。将连接混合物转化至DH10B细胞中，对所得文库(DL280)进行纯化、定量和储存以组装完全噬菌粒文库。

构建VH文库

设计、合成编码VH_vr1和VH_vr2的多种简并寡聚物，并且通过以下方案来转变成双链DNA：使0.75μL 0.2μM模板寡聚物与10μL 5x PrimeSTAR缓冲液、4μL dNTP混合物、1μL100μM正向引物、1μL 100μM反向引物、0.5μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μL)和33μL水混合。使PCR溶液在96℃下预热5分钟，接着进行14个循环(96℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续6秒)，随后在72℃下延伸3分钟。使用引物对F_1999(CGTTTGTCC TGTGCAGCTTCCGG)(SEQ ID NO:61)和R_1999(CGAGGCCCTT ACCCGGGGCCTGACG)(SEQ ID NO:62)来扩增VH_vr1，同时使用引物对F_2003(CCGGGTAAGGGCCTCGAGTGG)(SEQ ID NO:63)和R_2003(GAGCACGTCCGTTCGAATTGTCGCGACTTATAG)(SE Q ID NO:64)来扩增VH_vr2(表4)。

双链VH_vr1和VH_vr2通过在它们的5'或3'末端的重叠序列来接合在一起。所用方案如下：使20ng VH_vr1和20ng VH_vr2模板与10μL 5x PrimeSTAR缓冲液、4μL dNTP混合物、1μL 100μM F_1999引物、1μL 100μM R_2003引物、0.5μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μL)和水(补足至50μL)混合。使混合物在96℃下预热5分钟，接着进行14个循环(96℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续10秒)，随后在72℃下延伸3分钟。这些PCR片段接着通过凝胶电泳(GENEray凝胶提取试剂盒)来纯化，用BspEI和BstBI(Thermo Scientific)消化，并且随后克隆至用相同的两种酶消化的FTV014中。通过电穿孔来将连接混合物转化至DH10B细胞中，并且收集超过10倍计算多样性的数目的菌落用于质粒制备。纯化质粒构成文库VH-VR12。

设计、合成编码VH_vr3的数百种简并寡聚物，并且通过以下方案来转变成双链DNA：使0.75μL 0.2μM模板寡聚物与10μL 5x PrimeSTAR缓冲液、4μL dNTP混合物、1μL 100μM正向引物、1μL 100μM反向引物、0.5μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μL)和33μL水混合。使PCR溶液在96℃下预热5分钟，接着进行14个循环(96℃持续15秒，60℃持续15秒，72℃持续6秒)，随后在72℃下延伸3分钟。正向引物是S1089(ACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTG)(SEQ ID NO:65)，并且反向引物是S1090(GAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACCCC A)(SEQ ID NO:66)(表4)。编码VH_vr3的双链DNA接着通过凝胶电泳(GENEray凝胶提取试剂盒)来纯化，用AflII和SpeI(Thermo Scientific)消化，并且随后克隆至用相同的两种限制酶消化的FTV012中。通过电穿孔来将连接混合物转化至DH10B细胞中，并且收集超过10倍计算多样性的数目的菌落用于质粒制备。纯化质粒构成文库VH-VR3。

为组装全长VH文库，将纯化VH-VR3文库质粒混合物用AflII和SpeI(NEB)消化，并且通过凝胶电泳(GENEray凝胶提取试剂盒)来纯化VR3编码片段，并且随后克隆至已用相同的两种限制酶消化的VH-VR12文库质粒混合物中。使连接产物脱盐(PCR纯化试剂盒(QIAGEN))，随后进行滚环扩增(RCA)。如下进行RCA：使40ng连接产物与10μL 10xNEBuffer 4、50μL 100μM pd(N)8和水(补足至88.5μL)混合，加热至95℃，持续3分钟，并且持续65个循环进行退火(各循环持续30秒)，其中各循环降低1℃。在添加10μL 10mM dNTP混合物、1μL 100x BSA和0.5μL Phi29 DNA聚合酶之后，使经退火反应在30℃下孵育过夜。RCA产物首先用NotI消化，纯化DNA片段(PCR纯化试剂盒)，并且用XhoI进一步消化。经消化产物接着用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)加以连接。在通过乙醇沉淀来纯化之后，通过电穿孔来将连接产物转化至DH10B细胞中，并且收集超过10倍计算多样性的数目的菌落用于质粒制备。纯化质粒构成文库VH-VR123。

表4：用于PCR扩增的引物

构建普通轻链文库

普通轻链文库由源于VH-VR123文库的重链文库和源于DL280文库的轻链文库组成。VH-VR123文库质粒与DL280文库质粒两者均用BspEI和SpeI(Thermo Scientific)消化。将源于VH-VR123文库的编码重链的DNA片段克隆至源于DL280文库的载体骨架中。使连接产物脱盐(PCR纯化试剂盒(QIAGEN))，随后进行滚环扩增(RCA)。如下进行RCA：使40ng连接产物与10μL 10x NEBuffer 4、50μL 100μM pd(N)8和水(补足至88.5μL)混合，加热至95℃，持续3分钟，并且持续65个循环进行退火(各循环持续30秒)，其中各循环降低1℃。在添加10μL 10mM dNTP混合物、1μL 100x BSA和0.5μL Phi29 DNA聚合酶之后，使经退火反应在30℃下孵育过夜。RCA产物首先用NotI消化，纯化DNA片段(PCR纯化试剂盒)，并且用Acc65I进一步消化。经消化产物接着用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)加以连接。在通过乙醇沉淀来纯化之后，通过电穿孔来将连接产物转化至ER2738细胞中。从板(2xYT、1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素)收集总数3.5*10⁹个菌落。

实施例3：筛选普通轻链文库以分离目标抗体

制备普通轻链文库噬菌粒粒子

为制备用于抗原淘选的普通轻链文库噬菌粒粒子，将1.6升具有普通轻链文库的ER2738细胞(描述于以上实施例2中)以0.1的起始OD₆₀₀接种于含有2xYT、2％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素的培养基中。使培养物在37℃下在250rpm下振荡下生长，直至它达到0.6-0.8的OD₆₀₀。接着用M13KO7辅助噬菌体在37℃下在感染复数(MOI)10下感染细胞30分钟。使受感染ER2738细胞在22℃下在3.2升含有2xYT、100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的培养基中生长过夜。接着通过在10,000rpm下离心15分钟来收集培养上清液，并且经0.45μm低结合膜过滤器(Corning)过滤。接着使用PEG/NaCl来使噬菌粒粒子从经过滤上清液沉淀，并且再混悬于PBS中。进行另一轮PEG/NaCl沉淀，随后再混悬于PBS中。噬菌体效价通过测量OD₂₆₈来测定(假定在OD₂₆₈下的1单位是约1*10¹³个噬菌体粒子/毫升)，并且通过空斑测定加以确认。将文库噬菌粒粒子于20％甘油中储备在-80℃下。

噬菌体文库淘选

将抗原蛋白质在1-30μg/ml的浓度下在4℃下在Maxisorp条带(ThermoScientific,目录号446469)上涂布过夜。对于各文库，制备多个孔的抗原。首先在室温下用含5％奶的PBS阻断经涂布孔1-2小时，并且用PBS洗涤。接着，将1,100μL/孔的噬菌粒粒子溶液(通常是于2％奶-PBS中的1-5*10¹²个噬菌体)添加至4个平行孔中，并且孵育1-2小时。接着用吐温20(Tween 20)的浓度递增(从0.1％至0.3％)的PBS，并且最后用单独PBS将孔洗涤数次。在室温下持续10分钟用100μL 0.2M甘氨酸-HCl将结合的噬菌粒粒子从各孔洗脱。立刻用18μL 1M Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱的噬菌体。

或者，根据制造商说明书，通过KingFisher(Thermo Scientific)，使用Dyna珠粒(M280，链霉亲和素，Invitrogen,目录号60210)进行噬菌粒文库淘选。用PBS洗涤300μLDyna珠粒，并且与生物素化抗人Fc抗体一起在室温下孵育20分钟。接着在室温下用含5％BSA的PBS阻断珠粒1小时。通过在室温下孵育1小时来捕集Fc融合抗原(70-100pmol)。接着用PBS洗涤珠粒一次，并且与1mL噬菌体文库溶液(通常是于5％BSA-PBS中的5*10¹²至1*10¹³个噬菌体粒子)一起孵育1-2小时。接着用PBS/吐温(0.1％至0.3％)和PBS洗涤珠粒数次，并且在室温下持续10分钟用100μL 0.2M甘氨酸-HCl将结合的噬菌体从珠粒洗脱。立刻用18μL1M Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱的噬菌体。针对各抗原进行总计三或四轮淘选，并且包括10-100倍过量的纯化人Fc以降低背景结合。

对于一些测试抗原，2mL抗原(10-30μg/mL)用于在4℃下将免疫管涂布过夜。相应地增加阻断溶液、洗涤溶液和洗脱溶液的体积。

经富集噬菌体的扩增

洗脱的经富集噬菌体池如下加以进一步扩增：在37℃下用洗脱的噬菌粒粒子感染ER2738细胞30分钟。接着将受感染细胞涂铺在具有2％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素的2xYT琼脂板上。从各板收集菌落，使所述菌落在100ml的2％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素中生长，并且用M13KO7辅助噬菌体感染。通过上述方法来纯化和定量经扩增噬菌体。通常，在最后一轮淘选之后的所洗脱噬菌体用于感染ER2738细胞，并且挑选所得ER2738菌落用于上清液ELISA筛选测定。

上清液夹心式Elisa测定

开发一种灵敏夹心式Elisa测定来测量存在于细菌上清液中的Fab。用多克隆抗人IgG抗体(Fab特异性)(Sigma I5260)涂布微板以捕集存在于细菌上清液中的Fab，接着经HRP标记山羊抗人Fc抗体用于检测捕集的Fab的量。测量各孔的A₄₅₀以测定Fab结合活性。将主要命中物确定为其ELISA信号是背景的ELISA信号的至少两倍的那些命中物，并且在以下实施例(实施例4)中加以进一步表征。

实施例4：在体外表征抗体

在大肠杆菌中过度表达对应于以上在实施例3中鉴定的主要命中物的在它们的CH1结构域的C末端用His6标签加标签的Fab，并且根据制造商说明书，通过Ni-NTA树脂(Thermo Fisher Scientific)来纯化。通过ForteBio Octet RED96系统来测量它们的亲和力。简要来说，AHC传感器(抗人IgG-Fc捕集浸渍和读取生物传感器)用于捕集抗原，并且浸渍至含有用动力学缓冲液稀释至5-10μg/mL的纯化Fab的孔中(对于额外描述，参见例如ForteBio,Anti-human IgG Capture(AHC)Biosensors,Product Insert 41-0072-PD(2008))。获得的ForteBio数据用Data Acquisition软件7.1处理，并且将动力学数据相对于1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型加以拟合。在25℃下测量的Fab对靶标TAGT-1、TAGT-2和TAGT-3的亲和力显示于表5和图3中。这三种靶标抗原(TAGT-1、TAGT-2和TAGT-3)是共有小于17％序列同一性的无关蛋白质。

表5：经确认与TAGT-1、TAGT-2和TAGT-3结合的Fab在25℃下的亲和力测量结果

如由上表5所指示，可从所制备文库成功鉴定和选择以高亲和力靶向三种不同抗原的多种抗体。

实施例5：DL280文库的应用

为说明在实施例2中组装的DL280轻链文库在不同情况下的应用，使用DL280轻链文库构建了三个抗体文库：

DPL5：整组DL280轻链与大型VH文库配对

VH：多样性是>10⁹种VH

VL：整组DL280

SEL021：整组DL280轻链与小型VH文库配对

VH：20种VH

VL：整组DL280

DPL16～DPL34：DL280轻链的子组与大型VH文库配对

VH：多样性是>10¹⁰种VH

VL：DL280中的单一种类

为考查DL280轻链文库的稳健性和柔性，针对三种靶标：TAGT-1、TAGT-2和TAGT-3来筛选DPL5、SEL021和DPL16～DPL34文库(如实施例3中所述)。从三个测试文库中的每一者鉴定了阳性命中物，并且测量和确认具有亲和力数据(表6)的含有24种独特VL的总计165个阳性命中物。

表6：经确认命中物的亲和力数据

在24种独特VL中，它们中的九者在与不同VH配对时结合多种靶标。举例来说，命中物标识符3757含有DL280-135(SEQ ID NO:28)和VH(SEQ ID NO:51)，并且结合TAGT-1，而命中物标识符5905也含有DL280-135，但具有不同VH(SEQ ID NO:52)，并且结合不同靶标，即TAGT-3。类似地，当DL280-67(SEQ ID NO:34)与一种VH(SEQ ID NO:56)配对成命中物标识符5145时，它结合TAGT-2，并且当与不同VH(SEQ ID NO:57)配对成命中物标识符7077时，它结合TAGT-1。

也发现来自DL280的在与不同VH序列配对时可结合所有三种靶标抗原的VL。举例来说，当DL280-70(SEQ ID NO:32)与一种VH(SEQ ID NO:53)配对成命中物标识符7035时，它结合TAGT-2，当与第二VH(SEQ ID NO:54)配对成命中物标识符4218时，它结合TAGT-1，并且当与第三VH(SEQ ID NO:55)配对成命中物标识符5114时，它结合TAGT-3。额外两种DL280在使用多种不同VH的情况下结合相同靶标。举例来说，当与两种不同VH(SEQ ID NO:58和59)分别配对成命中物标识符5930和6008时，DL280-271(SEQ ID NO:36)结合TAGT-3。以下表7显示在文库分析期间鉴定的24种独特VL的序列使用和结合的靶标的数目。

表7：VL的靶标结合能力

分析来自DPL5和SEL021文库的抗体命中物的DL280区段使用(图2A)。

通过使VL与具有大于10¹⁰种VH序列的VH文库配对来将顶尖VL(如表7中所示)中的19者构建成单种VL文库(DPL16～34)，并且通过再次分析与TAGT-3、TAGT-2和TAGT-1的结合来对这些抗体进行再筛选。在确认来自所有三个文库(DPL5、SEL021和DPL16～34)的命中物之后，对DL280区段使用(图2B)进行再评估(表8)。在不希望受理论束缚下，认为由包含给定高变区的抗体结合的抗原的数目较高可指示那个特定高变区具有高度柔性，而给定高变区的较高区段使用可指示所述高变区(以及周围多肽序列)的稳健折叠。

表8：来自DPL5、SEL021和DPL16～34的经确认命中物中的DL280区段使用

也计算HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的所有组合的区段组合分布(表9和表10)。

表9：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3 2区段组合使用

表10：HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3 3区段组合使用

用于基于结构和序列可变性来鉴定抗体的经重新界定高变区的动态基序的新型方法已导致设计有限数目的VL组分，所述VL组分视所述VL组分与其配对的VH区段而定可结合相同靶标或多种不同靶标。本文所述的数据和抗体揭示以整组或子组形式使用的DL280轻链文库足够稳健以作为VL组分用于进行抗体发现。

序列表

<110> 天演药业有限公司(ADAGENE INC.)

<120> 动态人抗体轻链文库

<130> IP170326

<160> 66

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L1序列1

<400> 1

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L1序列2

<400> 2

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L1序列3

<400> 3

Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L1序列4

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L2序列1

<400> 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L2序列2

<400> 6

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L2序列3

<400> 7

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L2序列4

<400> 8

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L2序列5

<400> 9

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列1

<400> 10

His Cys Gln His Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Thr

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列2

<400> 11

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列3

<400> 12

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列4

<400> 13

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Pro Gln Thr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列5

<400> 14

Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列6

<400> 15

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Ser His Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列7

<400> 16

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn Thr

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列8

<400> 17

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列9

<400> 18

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列10

<400> 19

Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列11

<400> 20

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列12

<400> 21

Tyr Cys Lys Gln Ala Tyr Ile Pro Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列13

<400> 22

Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 经设计HVR-L3序列14

<400> 23

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 24

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 框架FW-L1序列

<400> 24

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 框架FW-L2序列

<400> 25

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 26

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 框架FW-L3序列

<400> 26

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

1 5 10 15

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

20 25

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 框架FW-L4序列

<400> 27

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 28

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列1

<400> 28

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 29

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列2

<400> 29

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 30

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列3

<400> 30

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 31

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列4

<400> 31

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 32

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列5

<400> 32

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 33

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列6

<400> 33

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 34

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列7

<400> 34

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 35

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列8

<400> 35

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 36

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列9

<400> 36

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 37

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列10

<400> 37

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 38

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列11

<400> 38

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 39

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列12

<400> 39

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 40

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列13

<400> 40

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 41

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列14

<400> 41

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 42

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列15

<400> 42

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 43

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列16

<400> 43

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 44

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列17

<400> 44

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 45

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列18

<400> 45

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 46

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列19

<400> 46

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 47

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列20

<400> 47

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 48

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列21

<400> 48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 49

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列22

<400> 49

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 50

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 轻链可变区序列23

<400> 50

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 51

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符3757-VH

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Ser Tyr Tyr Gly Val Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符5905-VH

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Gly

20 25 30

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Ser Thr Arg Asp Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符7035-VH

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Thr Ala Gly Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符4218-VH

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ser Ser Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符5114-VH

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Trp Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys

50 55 60

Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Trp Val Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符5145-VH

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Phe Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ile Thr Ala Gly Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符7077-VH

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Gly

20 25 30

Gly Val Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Asp Thr Val Val Gly Asp Trp Phe Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符5930-VH

<400> 58

Glu Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

His His Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Trp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys

50 55 60

Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 命中物标识符6008-VH

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asn Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 图1B中的VL

<400> 60

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Ser His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> F_1999

<400> 61

cgtttgtcct gtgcagcttc cgg 23

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> R_1999

<400> 62

cgaggccctt acccggggcc tgacg 25

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> F_2003

<400> 63

ccgggtaagg gcctcgagtg g 21

<210> 64

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> R_2003

<400> 64

gagcacgtcc gttcgaattg tcgcgactta tag 33

<210> 65

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> S1089

<400> 65

acaactgaac agcttaagag ctgaggacac tgccgtctat tattg 45

<210> 66

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> S1090

<400> 66

gaggagacgg tgactagtgt tccttgaccc ca 32